第二章 菌種培養(yǎng) 第一節(jié) 微生物的生長 一. 生長現(xiàn)象和繁殖方式 這里指微生物的群體生長，包括個體生長和個體繁殖，在發(fā)酵工業(yè)中，應(yīng)用最多的是細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌 1. 細(xì)菌（bacteria） 單細(xì)胞原核生物，主要靠分裂繁殖,細(xì)菌分裂圖,2. 放線菌 單細(xì)胞絲狀，主要靠無性孢子進(jìn)行繁殖（圖）,3. 酵母菌 單細(xì)胞真核生物，出芽繁殖和子囊孢子繁殖 （出芽）,酵母菌子囊孢子,4. 霉菌 單細(xì)胞或多細(xì)胞絲狀真菌，發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用最多的是青霉、曲霉、毛霉、木霉等（圖）,二. 生長的測定 微生物的生長和產(chǎn)物的生成有著密切的關(guān)系，因此測定生長對發(fā)酵的控制很重要 1. 測定細(xì)胞的數(shù)目 1）濁度計比濁法 2）計數(shù)器記數(shù)法 對于單細(xì)胞的微生物或微生物的孢子比較準(zhǔn)確，對于菌絲體比較困難,2. 測定細(xì)胞重量 1）細(xì)胞干重稱量法 2）細(xì)胞堆積容積測量法 3）細(xì)胞組成分析法 ：蛋白質(zhì) DNA RNA 4) 營養(yǎng)物消耗分析法：測定培養(yǎng)基中不用于合成代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)物，如磷酸鹽、硫酸鹽等 5）產(chǎn)物重量分析法：測定培養(yǎng)中形成的CO2、ATP和H2等,三. 群體生長規(guī)律（典型細(xì)菌生長曲線） growth curve（圖）,1. 延滯期（lag phase） 是微生物生長過程對外界的適應(yīng)期 個體重量增加，體積增大，活菌數(shù)為增加 原生質(zhì)均勻，嗜堿性強(qiáng)，RNA含量高，酶類的合成和誘導(dǎo) 菌體對外界物理、化學(xué)因素的抵抗力弱，“幼齡期”，代謝活躍 發(fā)酵生產(chǎn)中，早期保證營養(yǎng)和氧氣，使幼齡菌很好生長,2. 對數(shù)生長期（log phase） 細(xì)胞的代時（generation time）最短且恒定，群體細(xì)胞以幾何級數(shù)增加，單位時間內(nèi)細(xì)胞數(shù)目或細(xì)胞重量的增加（生長速率）恒定 細(xì)胞分裂產(chǎn)生的所有菌都是活菌，總菌數(shù)與活菌數(shù)接近相等 細(xì)胞的形態(tài)、生理特征一致 在發(fā)酵工業(yè)中要設(shè)法延長此期，獲得更多的活細(xì)胞（？）,3. 穩(wěn)定期（stationary phage） 菌體的世代時間加長且不穩(wěn)定，活菌數(shù)的增加與死菌數(shù)的增加接近平衡（原因？） 如果出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象，總菌數(shù)將下降 溶菌的結(jié)果，使培養(yǎng)基變的更加復(fù)雜，導(dǎo)致培養(yǎng)物緩慢地二次生長 原生質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)貯藏物質(zhì)，如糖原、異染顆粒、脂肪粒等，液泡，芽孢 穩(wěn)定期內(nèi)代謝活動在進(jìn)行，大量的初級和次級代謝產(chǎn)物主要在此期形成（延長？）,4.衰亡期（decline or death phase） 總菌數(shù)可以恒定，但活菌數(shù)逐漸減少 細(xì)胞容易出現(xiàn)多形態(tài)，包括畸形，最后菌體自溶死亡 在發(fā)酵工業(yè)中，由于活菌數(shù)大減，產(chǎn)物產(chǎn)生少，甚至破壞多，菌體自溶影響產(chǎn)物提取，及時結(jié)束發(fā)酵（？） 霉菌和放線菌在發(fā)酵液中呈絮狀菌絲體，在不斷攪拌下均勻分布在發(fā)酵液中，生長規(guī)律不典型,第二節(jié) 微生物生長的動力學(xué) 研究微生物生長速率、營養(yǎng)物消耗速度、產(chǎn)物生成速度及其相互關(guān)系 研究影響反應(yīng)速率的因素 為獲得理想的發(fā)酵參數(shù)、小型實驗數(shù)據(jù)的放大、發(fā)酵生產(chǎn)設(shè)備的合理化和提高生成率提供理論依據(jù) 生長動力學(xué)和產(chǎn)物生成動力學(xué)兩部分組成 比生長速率和比產(chǎn)物生成率是重要參數(shù),一. 比生長速率（specific growth rate） 1. 分批培養(yǎng)的比生長速率 當(dāng)微生物處在最高的生長時期，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物過量，此時生長速率與營養(yǎng)物濃度無關(guān)，而與細(xì)胞濃度有關(guān)，其關(guān)系表現(xiàn)為微生物細(xì)胞濃度（以重量表示）的瞬時增長速率dX/dt和培養(yǎng)液中微生物細(xì)胞濃度X成正比，或任一瞬間生長速率與細(xì)胞濃度成正比,dX/dt=X （1） X: 每毫升培養(yǎng)液中細(xì)胞的數(shù)量 t：培養(yǎng)時間（h） ：比生長速率，即每單位數(shù)量的細(xì)菌或物質(zhì)在單位時間內(nèi)（h）增加的量 對（1）式積分，得 lnNt-lnN0=(t1-t0) 換成以10為底的對數(shù) lgNt-lgN0=(t1-t0)/2.303,Nt與N0分別代表t和t0時的細(xì)胞數(shù)量，測定從N0增加到Nt所用的時間和Nt與N0的量，就可以求出該條件下的 如N0時每ml培養(yǎng)液中細(xì)菌數(shù)為104，經(jīng)過4小時后該培養(yǎng)液中細(xì)菌的數(shù)目增加到108，求此條件下細(xì)菌的比生長速率（ ） =(lg Nt -lg N0 )/(t1-t0)2.303 =(8-4)/4 2.303/h =2.303h 代表在該條件下，每個細(xì)菌以每小時增加2.303個細(xì)菌的速度增加,：細(xì)胞濃度的瞬時增大速率和細(xì)胞濃度的比例常數(shù) 單位重量菌體的瞬時增量 重量：g 時間：hr : 菌體的增重數(shù)/hr.g, g/g.hr,二. 生長的營養(yǎng)條件及其選擇 （一）營養(yǎng)物的影響和選擇 1. 營養(yǎng)物對生長的影響 1）微生物所需的營養(yǎng)物： 2）分析細(xì)胞的化學(xué)組成分析對營養(yǎng)物的需要 3）滿足營養(yǎng)需要，微生物才能正常發(fā)育 4）營養(yǎng)物種類對微生物生長的影響，主要表現(xiàn)在對生長速率的影響,速效性氮源： 速效性碳源： 遲效性氮源： 遲效性碳源： 5）對繁殖的影響，如不同碳源對Aspergillus niger產(chǎn)孢的影響 6）微生物在單一碳源上和多種碳源上生長時的差異 單一碳源 二種碳源 多種碳源,2. 營養(yǎng)物濃度對生長的影響 對生長速率的影響和生長的抑制上 當(dāng)營養(yǎng)物濃度達(dá)到一定值，生長速度達(dá)到最高，在特定的溫度、pH、營養(yǎng)物種類和營養(yǎng)物濃度等條件下，分批培養(yǎng)的比生長速率是常數(shù) 營養(yǎng)物濃度過大，微生物的生長受到抑制 營養(yǎng)物濃度太高時，對微生物細(xì)胞具有毒害作用,營養(yǎng)物濃度和生長速率之間的動力學(xué)關(guān)系：Monod模型 = maxS/Ks+S :比生長速率（1/h） max：最大比生長速率（1/h） S:：營養(yǎng)物濃度 克/L Ks：飽和常數(shù)或營養(yǎng)物利用常數(shù) 克/L，或 mol/L,微生物生長的Monod模型,Ks是使達(dá)到最大比生長率max值一半時的營養(yǎng)物濃度, 當(dāng)一種限制性營養(yǎng)物濃度S大大低于Ks時， =maxS/Ks，即很小，此時生長很慢 當(dāng)S=Ks時，=0.5 max，隨營養(yǎng)物濃度增加，相應(yīng)增加，逐漸趨向max，成為營養(yǎng)物濃度的重要函數(shù)，此時營養(yǎng)物濃度仍是生長的限制因素，在Monod模型上表現(xiàn)為曲線,當(dāng)營養(yǎng)物濃度S大大高于Ks時，營養(yǎng)物濃度不再影響微生物生長，即S的變化不再成為生長限制因素，此時，接近max，在Monod曲線上表現(xiàn)為直線 在分批培養(yǎng)時，Ks表示微生物對營養(yǎng)物的親和力，在一定營養(yǎng)條件下，Ks越小，微生物對限制性營養(yǎng)物的親和力越大，限制性營養(yǎng)物的濃度必須降低到十分低的水平，才能影響微生物的生長，Ks越大，親和力越小，即使限制性營養(yǎng)物濃度很高，生長率也下降,3. 營養(yǎng)物比例對生長的影響 C/N比 不當(dāng)，會影響菌體對按比例吸收營養(yǎng)物 不當(dāng)，改變原來合適的pH環(huán)境 氮源不足，表現(xiàn)為菌體繁殖慢，碳源不足表現(xiàn)為菌體容易衰老 生理酸性鹽和生理堿性鹽的比例也會影響微生物生長的pH環(huán)境,4. 發(fā)酵過程中營養(yǎng)條件的選擇 種子質(zhì)量和發(fā)酵初期菌體生長的控制，對發(fā)酵是非常重要的 比生長速率最大，延長對數(shù)期長，獲得更健壯的菌體 在影響的諸多因素中，營養(yǎng)條件最為重要 1）營養(yǎng)物種類 2）營養(yǎng)物比例 3）營養(yǎng)物濃度：對易被吸收的限制性營養(yǎng)物濃度的控制很重要，充足而不過大，過大，對生長的抑制,（二）溶解氧的影響和選擇 氧對好氧和厭氧微生物非常重要 氧在培養(yǎng)液中的飽和濃度只有(0.0032mg