高效液相色譜的維護與保養(yǎng),液相色譜儀器的使用及保養(yǎng),色譜泵的保養(yǎng),流動相要過濾 常用緩沖液時，停泵前要用水沖洗，并用水沖洗柱塞桿清洗孔 擰緊排液閥時，不要太用力，以不滲液為準 更換流動相時，要保證兩種溶劑的互溶性,如不互溶，要用一種中間溶劑過渡. 例如:使用無機鹽緩沖液時,用前和用后均須用水過渡,流動相的脫氣,流動相脫氣的目的 使色譜泵的輸液準確 輸液均勻準確，并且脈動減小 保留時間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高 提高檢測的性能 防止氣泡引起的尖峰 基線穩(wěn)定，信噪比增加 溶劑的紫外吸收本底降低 保護色譜柱 減少死體積 防止填料的氧化,加熱 簡單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動相組成的變化 抽真空 同上，一般在溶劑抽濾的同時，也有脫氣的效果 超聲波 簡單，但效果不理想。 通惰性氣體（一般用氦氣） 可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度 在線脫氣機 可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度,流動相脫氣的方法,色譜泵的排氣操作,使用前，應先確認泵頭內(nèi)沒有氣體，如有氣體要按以下步驟排氣： 將排液閥反時針轉(zhuǎn)2-3圈，用10ml注射器抽，直到出液 按以下方法之一將泵的后面放空 將U6K的C閥打開，或717設在PURGE狀態(tài) 或，將參比閥打開 或，把色譜柱摘下 打開電源開關 開大流速到 69ml/min 同時用10ml注射器從排液閥注入流動相 直到泵后的流速穩(wěn)定無氣泡為止,色譜泵的運行,注意用外部控制器與用泵面板控制的區(qū)別 有些型號的外部控制器與面板不能同時用 如需要面板控制，需要斷開控制線或關閉控制器 排氣后的色譜泵即可運行 注意 排氣后，先設流速為 0 恢復排氣時斷開的部分，如進樣器、色譜柱 如需要，恢復排氣時斷開的控制線 根據(jù)色譜柱的不同，逐漸提高流速到設定值,液相色譜對流動相的要求,除色譜柱對流動相的要求外，還有 與檢測器匹配 脫氣 避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)） 溶劑的粘度 防止細菌的生長,溶劑的相溶性,流動相的保存,有機溶劑流動相: 室溫下密封,避光保存 緩沖鹽流動相: 當日現(xiàn)配現(xiàn)用 低溫下密封保存,一般不超過3天 防止長菌 有機溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動相: 低溫密封保存 防止有機相的揮發(fā) 選用適宜的容器,保存于聚乙烯瓶中的超純水,測試條件 水樣: 40ml trace enrichment 2.0 ml/min 色譜柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 線性 100% 水 100% 乙腈 波長: 254 nm,保存于標準棕色玻璃瓶中的超純水,測試條件 水樣: 40ml trace enrichment 2.0 ml/min 色譜柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 線性 100% 水 100% 乙腈 波長: 254 nm,檢測器的保養(yǎng),如長時間不用檢測器可以關掉紫外燈 在4小時以上不用時，太頻繁開關也不好 不要讓緩沖液長期停滯在檢測池內(nèi) 用純水沖洗 示差檢測器及熒光檢測器 注意流動池的耐壓，不要在后面加壓,關于自動進樣器的針清洗,Purge Injector 與 Needle Wash 洗針溶劑瓶(綠色塑料管)不要放在自動進樣器的上部，應放于自動進樣同一水平面 洗針溶劑根據(jù)流動相的不同應有不同：,液相色譜系統(tǒng)的清洗與鈍化,一般采用30磷酸作為清洗劑，用6M硝酸作為鈍化劑，先清洗再鈍化 清洗的目的是去除不銹鋼管路及系統(tǒng)內(nèi)的污垢 鈍化的目的是使不銹鋼管路的內(nèi)表面形成光滑均勻的氧化膜,測柱效 良好的色譜實驗習慣,拿到一根新色譜柱時，先測柱效 保留在新色譜柱上測得的色譜圖，并記錄色譜測試條件 定期檢測柱效 定期檢測儀器的譜帶展寬,測柱效的方法,色譜柱種類繁多,性能各異,測定方法亦各不相同 基本上所有的色譜柱均附有“使用與維護說明書”,可按說明書所述方法測定 以下是Waters反相C18柱的測定方法: 流動相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min 樣品:50mg Acenaphthene(二氫苊)溶于100ml乙腈,加入600l丙酮 進樣量5l 檢測波長:254nm,計算色譜柱的柱效 N,理論塔板數(shù)計算公式： W 方法 Wtan 16 切線法 Wh 5.54 半峰高 W3 9 3 W4 16 4 W5 25 5,色譜柱的正確使用及操作,流動相的轉(zhuǎn)換 特別是GPC柱 流速(壓力)的變化幅度：0.1ml/min 凝膠柱（GPC及糖柱） 溫度的變化幅度 專用色譜柱樣品及溶劑的要求,色譜柱與儀器的聯(lián)接,不同公司的色譜柱接頭不同。處理不當時會造成嚴重后果： 色譜峰展寬（死體積）致使柱效下降或滲漏 解決辦法： 自制相應的轉(zhuǎn)換接頭 使用“通用”型接頭（錐箍及螺母） 這種錐箍在不銹鋼管上是活動的，即stop-depth長度可調(diào)。因此可以換接不同的色譜系統(tǒng)及色譜柱。從Waters Phase Separations公司能得到一些PEEK工程塑料的接頭,可用在各種類型的色譜柱上。,色譜柱的聯(lián)接,各種錐箍和管路接頭長度示意圖:,色譜柱安裝及連接的機械因素,連接不妥，造成漏液,連接適當,連接不妥,由于色譜柱連接不當引起的譜帶展寬，機械問題,譜帶展寬,色譜柱的在線保護裝置,給色譜柱提供物理的保護 除去樣品及流動相中的顆粒 給色譜柱提供化學的保護 防止分析柱被化學污染 裝置 在線過濾器 自裝填料保護柱 預裝保護柱,In-Line Filter 防止顆粒在色譜柱頭累積 優(yōu)點：基本不影響柱效 在需要高柱效的分析時中常用（如：氨基酸分析） 可更換的消耗品 更換濾芯 更換墊圈,色譜柱的在線保護裝置,保護柱,可避免化學污染 新型保護柱可提高整個色譜柱的柱效，甚至可作為色譜柱使用 保護柱選擇： 選用與色譜柱相同的填料 真正起到保護作用 保證色譜分離結果,使用保護柱延長色譜壽命實例：磺胺藥物分析,色譜柱的保護,使用配Symmetry C8保護柱的色譜柱：首次進樣,相同保護柱與色譜柱：第950次進樣,更換新Sentry Guard保護柱：第951次進樣,對所做的樣品要有充分的了解 用對該樣品洗脫能力最強的流動相清洗 硅膠柱的一般方法 先用甲醇洗去極性雜質(zhì) 用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化 鍵合相柱(烷基)的一般方法 20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗 若使用緩沖液，需先用不含鹽的水溶液清洗,色譜柱的清洗,色譜柱的存放,存放前的處理 除去雜質(zhì)、緩沖鹽 合適的存放溶劑 避免色譜柱床的干涸 避免機械震動 防止細菌生長 注意存放的溫度,正確使用色譜柱（一）,流動相方面 除去微粒 純度的要求 -超純水，梯度實驗時水中有機雜質(zhì)含量要低 -緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi) -緩沖液（鹽）的濃度 -溶劑：色譜純，并與填料相匹配 -溶劑中的雜質(zhì)含量 流動相對樣品的溶解度 -有機溶劑或水的比例,正確使用色譜柱(二),色譜柱的在線保護裝置,色譜柱的存放,啟動液相色譜儀器的流程,常見問題分析,基線噪音,可能的原因：,檢測池臟,檢測池燈能量下降,由泵引起的脈沖,檢測器上的溫度效應,檢測池中有氣泡通過,Time (min.),基線漂移,梯度洗脫引起的,溫度不穩(wěn)定（RID）,流動相臟,柱子沒有用流動相平衡,系統(tǒng)中污染物溢出,鬼峰,20% - 100% MeOH 梯度洗脫沒有進樣,鬼峰沒有進樣就有色譜峰出現(xiàn)。,原因流動相臟,60,15,30,15,0,3,7,15,17,柱外擴展,用較短的、窄內(nèi)徑的毛細管連接進樣器和色譜柱以及柱子和檢測器。,確認連接管的接頭都相互匹配。,使用死體積小的流動池,減小進樣量,增加柱外死體積,峰形,柱頭塌陷或柱床運動。,泵頭過濾芯(Frit)部分堵塞。,組份共流出,1雙峰,正常,雙峰,柱頭塌陷,峰形,2峰擴展,所有峰都擴展,柱效降低或有柱塌陷,進樣體積過大,流動相粘度大,部分峰擴展,前一次分析樣品的流出