STAT3基因在骨肉瘤組織中的表達(dá)及臨床意義【摘要】 目的：探討信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3( signal transducerand activator of transcription 3,STAT3)基因在骨肉瘤組織中的表達(dá)及臨床意義。方法 ：將武漢市四大三級甲醫(yī)院收集的骨肉瘤20例及良性骨軟骨瘤5例標(biāo)本,應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測各組組織中STAT3基因的表達(dá)水平, 采用HPIAS1000圖文報告管理系統(tǒng)對STAT3基因的表達(dá)進行定量分析，并用SPSS11.5軟件對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK(q)檢驗。結(jié)果：STAT3基因在骨肉瘤組織中呈高表達(dá), STAT3基因在良性骨軟骨瘤組織中呈低表達(dá), STAT3基因在骨肉瘤組織中的表達(dá)與良性骨軟骨瘤組織的表達(dá)比較差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)論：STAT3基因在骨肉瘤的分子發(fā)病機制中可能起了重要的作用,并可作為判斷骨肉瘤患者預(yù)后的參考指標(biāo)之一。 【關(guān)鍵詞】 骨肉瘤; STAT3癌基因; 免疫組織化學(xué)骨肉瘤是最常見的骨原發(fā)惡性腫瘤。美國每年約診斷900例骨肉瘤，中國骨肉瘤發(fā)病率在原發(fā)惡性腫瘤中居首位，發(fā)病率為1.52.0/10萬，多發(fā)于1020歲的青少年的長骨,尤以股骨下段和脛骨上段多見1。骨肉瘤早期臨床癥狀無特異性,且病情進展較快,大多數(shù)病例就診時已經(jīng)進入臨床B期。這些患者中有相當(dāng)一部分會出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移,肺轉(zhuǎn)移是其主要死亡原因,80%的病例在確診時已有肺部微小轉(zhuǎn)移灶24。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducers and activators of transcription, STATs)家族是一種存在于胞漿并在激活后能夠轉(zhuǎn)入核內(nèi)與DNA結(jié)合的蛋白家族,具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控雙重功能5。STATs蛋白廣泛表達(dá)于機體不同類型的細(xì)胞和組織中,參與細(xì)胞生長、分化、凋亡等多種生理功能的調(diào)控,并與炎癥、腫瘤和免疫反應(yīng)關(guān)系密切。STATs家族成員中,STAT3與腫瘤的關(guān)系最為密切67。本研究通過應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和圖像分析技術(shù)檢測骨肉瘤及良性骨軟骨瘤組織中STAT3的表達(dá)水平，探討STAT3在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制，為臨床上防治骨肉瘤提供理論依據(jù)。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 材料來源及分組 收集武漢市四大三級甲醫(yī)院病理科20002008年骨肉瘤存檔蠟塊20例及良性骨軟骨瘤存檔蠟塊5例。所有切片經(jīng)病理學(xué)專家診斷為骨肉瘤及良性骨軟骨瘤。1.1.2 材料 采用免疫組織化學(xué)SP法檢測STAT3基因在骨肉瘤與良性骨軟骨瘤組織中的表達(dá)。1.2 主要試劑和儀器1.2.1 主要試劑 STAT3兔抗人多克隆抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司);超敏即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒(福州邁新公司);DAB顯色試盒及多聚賴氨酸(北京中山生物技術(shù)有限公司)。1.2.2 主要儀器 YWY781型醫(yī)用微波儀，250 W，50 Hz (浙江臨安電子器材廠生產(chǎn));家用高壓鍋;電熱恒溫干燥箱 (湖北黃石醫(yī)療器械廠生產(chǎn));顯微鏡成像系統(tǒng) (Olympus公司)。1.3 方法1.3.1 蠟塊切片厚5m，貼片于涂有多聚賴氨酸的潔凈載玻片上，置于烤箱烤干待用。1.3.2 免疫組織化學(xué)SP法檢測STAT3相關(guān)抗原具體步驟： 4m組織切片常規(guī)脫蠟至水后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗33 min; 抗原修復(fù)(檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)法)，室溫自然冷卻后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗53 min; 滴加3%過氧化氫，37濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗33 min; 正常羊血清37濕盒孵育10min以減少非特異性背景; 甩去多余血清，分別滴加一抗，4孵育過夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗35 min; 滴加生物素標(biāo)記的二抗37濕盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗33 min; 滴加鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物復(fù)合物37濕盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗33 min; 滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色，光鏡下控制反應(yīng)時間(約35 min)，自來水沖洗終止反應(yīng); 蘇木素復(fù)染，流水沖洗，1%鹽酸酒精分色數(shù)秒，流水沖洗，0.1%氨水返藍(lán); 梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢;用PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為陽性對照組。1.3.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷STAT3陽性染色為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞核和胞質(zhì)內(nèi)。陰性對照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。采用HPIAS1000 高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)(同濟千屏影像公司)對STAT3基因的表達(dá)進行定量分析，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野(400) ,測定每個視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積,計算陽性面積率(陽性面積率=單位面積中陽性反應(yīng)的總面積/單位面積中細(xì)胞的總面積100%)。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。1.4 統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS11. 5 軟件對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK(q) 檢驗，檢驗水準(zhǔn)為0.05。2 結(jié)果在骨肉瘤組中可見密集分布的棕黃色顆粒，STAT3基因呈陽性表達(dá);在良性骨軟骨瘤組中可見少量的棕黃色顆粒，STAT3基因表達(dá)呈弱陽性或陰性。圖像分析結(jié)果顯示: 骨肉瘤組STAT3基因表達(dá)的平均光密度為0.28400.0107, 良性骨軟骨瘤組STAT3基因表達(dá)的平均光密度為0.09540.0054; 骨肉瘤組STAT3基因表達(dá)的陽性面積率為0.32540.0497, 良性骨軟骨瘤組STAT3基因表達(dá)的陽性面積率為0.15360.0127,經(jīng)單因素分析骨肉瘤組與良性骨軟骨瘤組比較(P<0.05)，差異有顯著性。見表1。表1 骨肉瘤組與良性骨軟骨瘤組STAT3基因表達(dá)的平均光密度和陽性面積率注：* 骨肉瘤組與良性骨軟骨瘤組比較，P<0.05。3 討論骨肉瘤是一種起源于間葉組織的惡性腫瘤, 病情兇險,預(yù)后較差,多數(shù)病例在原發(fā)灶較小的早期即發(fā)生廣泛的肺轉(zhuǎn)移,以能產(chǎn)生骨樣組織的梭形基質(zhì)細(xì)胞為特征,是骨骼系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,多發(fā)于青少年,好發(fā)于血運豐富的干骺端,其血行轉(zhuǎn)移發(fā)生率高且早,進展迅速。其病因和發(fā)病機理尚未清楚。越來越多的研究結(jié)果表明,骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后與癌基因和抑癌基因的異常表達(dá)密切相關(guān)810。因此, 近些年有許多學(xué)者著重研究骨肉瘤的分子發(fā)病學(xué), 為觀察骨肉瘤預(yù)后和轉(zhuǎn)移尋找新的指標(biāo), 也為尋找骨肉瘤新的治療方法提供了理論基礎(chǔ)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT3)是STATs家族的重要成員，已被認(rèn)為是一種癌基因,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，其過度激活將導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和凋亡障礙，促進腫瘤細(xì)胞的形成1113。STATs家族是一種存在于細(xì)胞漿并在激活后能夠轉(zhuǎn)入核內(nèi)與DNA結(jié)合的獨特的蛋白家族，它與酪氨酸磷酸化信號通道偶聯(lián)，發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用14。JAK/sTAT代表的是一條極其快速的從細(xì)胞外到細(xì)胞核的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。近年來發(fā)現(xiàn)JAK/sTAT途徑的激活,特別是STAT3的激活,對于細(xì)胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)化產(chǎn)生重要影響。已有研究證實STAT3的酪氨酸磷酸化,即信號依賴的活化形式,在多種腫瘤中普遍存在,并在某些腫瘤中發(fā)揮重要作用15。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3( signal transducerand activator of transcription 3,STAT3)是一種存在于細(xì)胞漿與酪氨酸磷酸化信號通道偶聯(lián)的雙功能蛋白。STAT3過度激活將導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和凋亡障礙,促進腫瘤的形成、發(fā)展。其致癌機制為促進細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、促血管生成而加快轉(zhuǎn)移1619。本實驗結(jié)果顯示, STAT3在骨肉瘤的表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05)，骨肉瘤組與對照組比較(P<0.05)，差異有顯著性。結(jié)果證實STAT3在腫瘤發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移等過程中有促進作用，提示STAT3高表達(dá)可能參與、促進了骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展。STAT3因子的過度表達(dá)可能促使骨肉瘤細(xì)胞的增殖、分化，并抑制其凋亡，其過度激活可以促進腫瘤細(xì)胞的形成及發(fā)展，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。其確切機制有待進一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Meyers P, Schwartz C, Krailo M, et al. 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