TFF3在大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍胃黏膜不同部位的表達(dá)作者：呂洋 吳靖芳 劉博 王志勇 王浩宇 鄭慧娥 張耕 張江蘭【摘要】 目的：探討大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍期間，三葉肽因子3(trefoil factor3，TFF3)免疫反應(yīng)細(xì)胞在胃黏膜不同部位中表達(dá)的變化。方法：通過(guò)胃前壁黏膜下注射冰乙酸制備大鼠胃潰瘍模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)36只大鼠不同部位胃黏膜組織中TFF3的表達(dá)。結(jié)果：(1)胃潰瘍損傷后大鼠胃黏膜TFF3的陽(yáng)性表達(dá)率為63.9%(23/36)。(2)潰瘍周邊部位TFF3的數(shù)密度要顯著高于遠(yuǎn)離潰瘍的其它部位(P<0.01)。其中，潰瘍周邊部位TFF3的數(shù)密度從大鼠胃潰瘍損傷后的第2天開(kāi)始到損傷后的第6天呈遞增趨勢(shì)，且顯著高于對(duì)應(yīng)時(shí)期的遠(yuǎn)離潰瘍的其它部位(P<0.01);而損傷后的第1天以及第10天以后，潰瘍周邊部位TFF3的數(shù)密度與遠(yuǎn)離潰瘍的其它部位差異沒(méi)有顯著性意義(P>0.05)。結(jié)論：大鼠胃潰瘍期間TFF3表達(dá)增高，潰瘍周邊部位TFF3的表達(dá)更強(qiáng)，TFF3對(duì)潰瘍損傷起著保護(hù)及修復(fù)作用。 【關(guān)鍵詞】 胃潰瘍;三葉肽因子3;免疫組織化學(xué);大鼠【ABSTRACT】 Objective:To explore the changes of TFF3 immunoreactive cells in different position of gastric mucosa during experimental gastric ulcer.Methods:Acetic acidinduced ulcers were caused by injection acetic acid to subserosal of paries anterior gastricus.The expressions of TFF3 in 36 rats were detected by immunohistochemical SP method with antiTFF3.Results:(1)In gastric ulcer,TFF3 expression rate was 63.9% of cases.(2)The numerical densities on area(NA)around the ulceration were stronger than that far away from it(P<0.01),especially among the second day to the sixth day after the experimental gastric ulcer in rats(P<0.01).But in the first day and after tenth day of gastric ulcer,the two groups had no statistical significance(P>0.05).Conclusion:The expression of TFF3 during gastric ulcer is high.TFF3 expression is stronger around the ulceration than that far away from it.TFF3 can protect and respair the mucosa of gastric ulcer.【KEY WORDS】 Stomach ulcer,Trefoil factor 3,Immunohistochemistry,Rats三葉因子家族(trefoil factor family,TFF)是一群主要由胃腸道粘液細(xì)胞分泌的小分子多肽。目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的三葉肽(trefoil peptide)有3種，即乳癌相關(guān)肽(pS2或TFF1)、解痙多肽(SP或TFF2)和腸三葉因子(ITF或TFF3)1。其中TFF3是在1991年由Suemori等2從大鼠空腸中發(fā)現(xiàn)的，分子僅由59個(gè)氨基酸組成，含有1個(gè)P結(jié)構(gòu)域。正常情況下，TFF的主要表達(dá)位點(diǎn)是在胃腸道，且有區(qū)域性和細(xì)胞選擇性。TFF1在正常組織中主要由胃竇和胃體的隱窩及表層上皮的黏膜細(xì)胞產(chǎn)生;TFF2主要分布于遠(yuǎn)端胃和下段十二指腸腺;TFF3主要分布于腸黏膜。當(dāng)胃腸黏膜受損時(shí)，三者表達(dá)的組織專一性消失3。國(guó)外學(xué)者報(bào)道實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍期間胃黏膜出現(xiàn)TFF3高表達(dá)4。但胃潰瘍形成及愈合過(guò)程胃黏膜不同部位TFF3的報(bào)道少見(jiàn)。我們通過(guò)大鼠乙酸潰瘍模型，檢測(cè)大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍形成及自愈過(guò)程不同部位TFF3的改變。1 材料與方法1.1 大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍模型的制作雄性8周齡SD大鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)共36只，體質(zhì)量180230g。用3%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔麻醉。胸腹部剃毛，消毒，在無(wú)菌條件下(手術(shù)切口長(zhǎng)約2cm)暴露胃。在胃前壁近胃竇處將0.01mL冰醋酸注入胃黏膜下層。注射后，胃壁表面立即形成一個(gè)圓形或橢圓形的隆起，然后該處變?yōu)橐蝗榘咨煌该鲄^(qū)，直徑約5mm。將大網(wǎng)膜覆蓋于注射區(qū)后，逐層縫合腹壁切口。1.2 取材方法取材前禁食12h，不限飲水。動(dòng)物用3%戊巴比妥鈉麻醉后，迅速開(kāi)胸，主動(dòng)脈插管，剪開(kāi)右心耳，首先灌注生理鹽水100mL，繼之灌注4%多聚甲醛磷酸緩沖液(pH7.4)250mL，維持20min。在手術(shù)后1、2、4、6、10和14d分批取胃前壁近胃竇處(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只)，沿胃大彎剪開(kāi)大鼠胃壁，PBS液沖洗干凈后平鋪，將潰瘍邊緣勾畫(huà)在玻璃紙上，以便用每小方格1mm1mm的坐標(biāo)紙估算潰瘍面積。剪取潰瘍旁約3mm5mm的組織條，置于Bouins液中，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚6m，裱貼于涂有APES的載片，行免疫組化染色。1.3 免疫組化染色采用免疫組織化學(xué)SP法，DAB染色。兔抗人TFF3多克隆抗體(工作濃度為1100)，SP試劑盒，枸櫞酸抗原修復(fù)緩沖液、DAB染色劑分別購(gòu)自武漢博士德生物工程公司及福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。切片染色前根據(jù)抗體要求行枸櫞酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)。余具體操作過(guò)程按試劑盒說(shuō)明書(shū)完成，并設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照(公司提供)和陰性對(duì)照(以PBS緩沖液代替一抗)，在光鏡下觀察陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色。1.4 觀察用OLYMPUSCX31顯微鏡連接MiE顯微圖像處理軟件在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行觀察：TFF3的判斷標(biāo)準(zhǔn)：以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒視為陽(yáng)性細(xì)胞，每只動(dòng)物隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)以及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。以>10%陽(yáng)性細(xì)胞為陽(yáng)性，<10%為陰性;用成像系統(tǒng)在顯微鏡下隨機(jī)圈定面積，在高倍鏡下計(jì)數(shù)所選區(qū)域陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，通過(guò)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)密度對(duì)不同部位胃黏膜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)密度(The numerical densities on area，NA)= TFF3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目/所選胃黏膜面積。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以上所得數(shù)據(jù)均采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用(xs)表示。胃潰瘍不同部位的數(shù)密度比較用ANOVA方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 制模后的潰瘍面觀察制模術(shù)后1d，潰瘍組大鼠胃體前壁即可見(jiàn)一個(gè)直徑36mm的潰瘍，潰瘍呈圓形或橢圓形，中心顏色蒼白，邊界清楚，周圍黏膜充血水腫。術(shù)后2d潰瘍最為明顯，潰瘍中心可見(jiàn)灰白色苔膜。術(shù)后4d潰瘍周圍邊界清晰，黏膜不再充血水腫，呈典型的龕形潰瘍，90%以上為穿孔性潰瘍，周圍大網(wǎng)膜和肝臟粘連包裹形成潰瘍底。隨后進(jìn)入愈合階段，潰瘍面積逐漸減小。至14d左右潰瘍直徑在12mm，有的已經(jīng)接近完全愈合。光鏡下觀察，術(shù)后2d壞死黏膜脫落形成明顯潰瘍，黏膜腺體消失，炎性細(xì)胞浸潤(rùn);4d可見(jiàn)上皮細(xì)胞向潰瘍中心移行;6d潰瘍邊緣可見(jiàn)新形成的擴(kuò)張腺體;14d后潰瘍處胃壁結(jié)構(gòu)逐漸完成再生，有的黏膜及黏膜下層近似正常。2.2 胃黏膜TFF3的染色情況TFF3染色主要在胞漿(見(jiàn)圖1圖2)，胃潰瘍損傷后大鼠胃黏膜TFF3的總體陽(yáng)性表達(dá)率為63.9%(23/36)。2.3 距潰瘍不同部位胃黏膜TFF3表達(dá)的數(shù)密度比較我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，潰瘍周邊部位及遠(yuǎn)離潰瘍部位大鼠的胃黏膜不僅在例數(shù)上表達(dá)TFF3差異有顯著性，而且在數(shù)密度上差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見(jiàn)表1，圖34)。其中，潰瘍周邊部位TFF3的數(shù)密度從大鼠胃潰瘍損傷后的第2天開(kāi)始到損傷后的第6天呈遞增趨勢(shì)，且顯著高于對(duì)應(yīng)時(shí)期的遠(yuǎn)離潰瘍的其它部位(P<0.01);而損傷后的第1天以及第10天以后，潰瘍周邊部位TFF3的數(shù)密度與遠(yuǎn)離潰瘍的其它部位差異沒(méi)有顯著性意義(P>0.05)。表1 潰瘍自愈期間不同部位TFF3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)密度變化注：與對(duì)照組(遠(yuǎn)離潰瘍組)相比*P<0.012.4 距潰瘍不同部位胃黏膜TFF3隨損傷時(shí)間的改變通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析我們發(fā)現(xiàn)，潰瘍周邊細(xì)胞TFF3的改變與損傷后發(fā)生的時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(P<0.05,r=-0.333);而遠(yuǎn)離潰瘍部位細(xì)胞TFF3的改變與損傷后的時(shí)間不具有相關(guān)性(見(jiàn)表2，圖5)。表2 距潰瘍不同部位TFF3的改變與損傷時(shí)間的關(guān)系注：與對(duì)照組(遠(yuǎn)離潰瘍組)相比*P<0.053 討論TFF3是最近發(fā)現(xiàn)的三葉肽家族成員之一，目前的研究認(rèn)為，TFF3主要在小腸及結(jié)腸杯狀細(xì)胞中表達(dá)，在人子宮、正常乳腺、下丘腦、垂體、肺等組織中的低水平表達(dá)亦有報(bào)道。對(duì)于TFF3在胃黏膜的表達(dá)情況，目前公認(rèn)的是在人胃黏膜不表達(dá)TFF3，但在胃潰瘍及胃癌中都有其高表達(dá)的報(bào)道5。關(guān)于TFF3在距潰瘍不同部位表達(dá)情況的差異，早在1990年Wright等6發(fā)現(xiàn)在慢性潰瘍附近區(qū)域存在一個(gè)特有的解剖結(jié)構(gòu)即潰瘍相關(guān)細(xì)胞系(UACL)。在消化性潰瘍以及潰瘍性結(jié)腸炎時(shí)會(huì)出現(xiàn)UACL。UACL是一種腺樣結(jié)構(gòu)，直接來(lái)源于腸腺隱窩基部干細(xì)胞群。UACL可以不斷地產(chǎn)生新的細(xì)胞并遷移到潰瘍表面，促進(jìn)潰瘍修復(fù)。UACL表達(dá)已知的三種TFF以及EGF、TGF。這些因子出現(xiàn)的先后順序存在一定爭(zhēng)議，早期研究發(fā)現(xiàn)UACL首先表達(dá)EGF和TGF，再刺激鄰近的細(xì)胞表達(dá)TFF。近期實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍模型研究表明，首先在黏膜損傷30min至2h TTF2 mRNA表達(dá)達(dá)到高峰，12h后降至正常水平;接著第2天再表達(dá)TTF3 mRNA，第3天達(dá)高峰，隨后逐漸下降，損傷后10d降至近正常水平，最后為EGF和TGF4。因此推斷，與EGF和TGF相比，TFF的表達(dá)可能是對(duì)損傷的早期快速反應(yīng)。我們的研究結(jié)果表明，潰瘍周邊部為T(mén)FF3的表達(dá)要顯著強(qiáng)于遠(yuǎn)離潰瘍的其它部位(P<0.01)，與上述的研究結(jié)果相符。同時(shí)，從大鼠胃潰瘍損傷后的第2天開(kāi)始到損傷后的第6天，潰瘍周邊部位TFF3的表達(dá)均顯著強(qiáng)于遠(yuǎn)離潰瘍的其它部位(P<0.01);而損傷后的第1天以及10d之后，胃體各部位TFF3的表達(dá)差異沒(méi)有顯著性意義(P>0.05)。這一結(jié)果不僅印證了TFF3并不是開(kāi)始就存在于正常胃黏膜當(dāng)中，而是當(dāng)出現(xiàn)了潰瘍損傷后伴隨著損傷黏膜的修復(fù)其開(kāi)始表達(dá)并逐漸增多的，而且在潰瘍周邊部位TFF3表達(dá)更強(qiáng)一些，同樣印證了其參與修復(fù)受損黏膜的作用。而隨著損傷黏膜的逐漸恢復(fù)，TFF3的表達(dá)含量又逐漸降低，且在距潰瘍的各個(gè)部位其表達(dá)含量沒(méi)有顯著性差異，也與上述推論相一致。有研究結(jié)果證明，三葉肽可增強(qiáng)受損黏膜周圍完好的上皮細(xì)胞向損傷黏膜表面遷移覆蓋，促進(jìn)損傷黏膜的重建8。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析我們發(fā)現(xiàn)，潰瘍周邊細(xì)胞TFF3的改變與損傷后發(fā)生的時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(P<0.05,r=-0.333);而遠(yuǎn)離潰瘍部位細(xì)胞TFF3的改變與損傷后的時(shí)間不具有相關(guān)性，與上述研究結(jié)果相符。但從趨勢(shì)上，我們的結(jié)果表明在制模后的第1天，遠(yuǎn)離潰瘍部位細(xì)胞TFF3的表達(dá)要略高一些，說(shuō)明雖然沒(méi)有冰醋酸造成的潰瘍形成，但是經(jīng)過(guò)手術(shù)后，大鼠胃黏膜的其它部位也造成了損傷，TFF3的表達(dá)增高可能也與這部分黏膜的修復(fù)相關(guān)。相關(guān)報(bào)道還表明，在部分腫瘤組織如皮膚粘液癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌等中可見(jiàn)TFF3表達(dá)上調(diào)5，8，9，因此，TFF3不僅在黏膜保護(hù)及修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，而且在腫瘤診治等方面也有深刻的意義。進(jìn)一步深入探討TFF家族特別是TFF3的作用機(jī)理必將對(duì)于黏膜保護(hù)、潰瘍治療及腫瘤治療等方面有重大意義?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 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