FHIT和PCNA在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌中的表達(dá)與臨床意義【摘要】 目的 研究脆性組氨酸三聯(lián)體基因（FHIT）蛋白和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和宮頸癌中的表達(dá)情況，探討兩者在宮頸癌早期診斷和發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。方法 采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)20例正常宮頸組織；20例宮頸CIN級(jí)、25例CIN/級(jí)；60例宮頸癌組織中的FHIT蛋白和PCNA的表達(dá)。結(jié)果 FHIT蛋白在正常宮頸組、宮頸CIN組、CIN組、CIN/組和宮頸癌組中的陰性率分別為0%（0/20）、24.4%（11/45）、10.0%（2/20）、36.0%（9/25）和66.7%（40/60），各組間陰性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；PCNA在正常宮頸組織、宮頸CIN組、宮頸癌組中的陽(yáng)性率分別是65.0%（13/20）、93.3%（42/45）和98.3%（59/60），各組間陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在宮頸CIN和宮頸癌中，F(xiàn)HIT和PCNA的表達(dá)有一定的相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)論 檢測(cè)宮頸CIN中的FHIT蛋白表達(dá)情況，可用作高級(jí)別的CIN篩查或預(yù)測(cè)。FHIT和PCNA對(duì)于宮頸癌前期病變和宮頸癌的篩查和早期診斷具有一定的臨床參考價(jià)值。 【關(guān)鍵詞】 宮頸上皮內(nèi)瘤變 宮頸癌 組氨酸三聯(lián)體 增殖細(xì)胞核抗原 免疫組織化學(xué) 早期診斷【Abstract】 Objective To study the expression of fragile histidine triad (FHIT) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in normal cervix, cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and cervical cancer. To discuss the potential involvement of FHIT and PCNA in tumorigenesis，metastasis in cervical cancer; to discuss the significance of FHIT and PCNA in early diagnosis of cervical cancer. Methods The expressions of FHIT protein and PCNA were detected by immunohistochemistry in 20 cases of normal cervix, 20 cases of CIN,25 cases of CIN/, 60 cases of cervical cancer. Results The percentages of negative expression of FHIT protein in normal tissues were 0%(0/20), 24.4%（11/45）in CIN group,10.0%（2/20） in CINgroup,36.0%（9/25）in CIN/ group and 66.7%（40/60）in cervical cancer group. There were significant differences between groups (Chi-square test, P<0.05). The positive expression rate of PCNA wase 65.0% （13/20）in normal group, 93.3% （42/45）in CIN group, and 98.3%（59/60）in cervical cancer group. There was significant difference between groups (Chi-square test, P<0.05). FHIT protein expression and PCNA expression were negatively related (P<0.05) in CIN and cervical cancer. Conclusion Since the expression level of FHIT is associated with the grade of CIN, it can be used to screen or forecasting higher-grade- group of CIN. FHIT and PCNA has clinical reference value for screening and early diagnosis of cervical lesions and cervical cancer. 【Key words】 Cervical intraepithelial neoplasia (CIN) Cervical carcinoma Fragile histidine triad (FHIT) Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) Immunohistochemistry Early diagnosis 宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，在全球婦女惡性腫瘤中居第2位，占所有婦科惡性腫瘤的10%12%1。脆性組氨酸三聯(lián)體基因（fragile histidine triad,FHIT）是一候選抑癌基因，許多研究報(bào)道多種腫瘤細(xì)胞系和原發(fā)性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有FHIT基因的異常轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，包括宮頸癌。增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）又稱周期抗原，其含量反映了細(xì)胞的增殖程度，可作為人類腫瘤和預(yù)后的指標(biāo)2。本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)FHIT和PCNA在正常宮頸、CIN和宮頸癌組織中的表達(dá)情況，探討其臨床意義。 1 對(duì)象與方法 1.1 研究對(duì)象 收集2007年1月至2008年12月，溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科保存的石蠟包埋組織標(biāo)本，共125例。其中正常宮頸組織20例，宮頸CIN級(jí)20例，CIN/級(jí)25例，宮頸癌60例。正常組20例為因子宮良性病變而行子宮全切的正常宮頸組織標(biāo)本。CIN組45例均為門診宮頸活檢標(biāo)本。宮頸癌標(biāo)本均為宮頸癌住院患者手術(shù)后標(biāo)本，術(shù)前均未接受放、化療及其他輔助治療。 1.2 方法 全部標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4m連續(xù)切片2張。采用免疫組化SP法檢測(cè)，根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行常規(guī)操作。高壓鍋噴氣進(jìn)行抗原修復(fù)。兔抗人FHIT多克隆抗體、鼠抗人PCNA單克隆抗體均為美國(guó)NeoMarkers公司產(chǎn)品，購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。FHIT一抗稀釋度150，PCNA一抗為即用型。FHIT和PCNA的陽(yáng)性及陰性對(duì)照片均由邁新公司隨試劑提供。 1.3 結(jié)果判斷 染色結(jié)果判定由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的婦科病理醫(yī)生盲法獨(dú)立閱片完成，核對(duì)結(jié)果，取得共識(shí)。FHIT表達(dá)結(jié)果判定：FHIT蛋白以胞漿和/或胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒視為陽(yáng)性細(xì)胞。在400倍顯微鏡下選10個(gè)視野，共計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。FHIT表達(dá)的判斷標(biāo)準(zhǔn)3：（1）根據(jù)染色強(qiáng)度：不染色或弱染色（淺黃色）為1分；中度染色（棕黃色）為2分；強(qiáng)染色（棕褐色）為3分。（2）根據(jù)染色范圍：陽(yáng)性細(xì)胞百分比10%為1分，10%50%為2分，50%為3分。將上述兩種得分相乘，3分為FHIT表達(dá)缺失，記為陰性（-），3分為表達(dá)正常，記為陽(yáng)性（+）。PCNA表達(dá)結(jié)果判定4：細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為PCNA陽(yáng)性。在400倍顯微鏡下選10個(gè)視野，共計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，10%記為陰性（-），10%記為陽(yáng)性（+）。 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)輸入EXCEL進(jìn)行整理，統(tǒng)計(jì)處理均用SPSS for windows 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。免疫組化的陽(yáng)性表達(dá)率為計(jì)數(shù)資料，采用四格表或列聯(lián)表2檢驗(yàn)。設(shè)定P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1 不同病變宮頸組織中FHIT的表達(dá) 在正常宮頸組織中FHIT陰性率為0。CIN組、CIN組、CIN/組和宮頸癌組中FHIT的陰性率分別為24.4%（11/45）、10.0%（2/20）、36.0%（9/25）和66.7%（40/60）。運(yùn)用列聯(lián)表2檢驗(yàn)，對(duì)各組間陰性率進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常組與CIN組、與宮頸癌組比較，CIN組與CIN/組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。免疫組化檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1、2、3。 表1 不同病變宮頸組織中FHIT的表達(dá) 注：*與正常組比較，P0.05；與CIN組比較，P0.05；與CIN比較，P0.052.2 不同宮頸組織中PCNA的表達(dá) 在正常宮頸組織、宮頸CIN組、宮頸癌組中PCNA的陽(yáng)性率分別是65.0%（13/20）、93.3%（42/45）和98.3%（59/60），運(yùn)用列聯(lián)表2檢驗(yàn)，對(duì)各組間陽(yáng)性率進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常組與CIN組、與宮頸癌組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。免疫組化檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4、5、6。表2 不同宮頸組織中PCNA的表達(dá)注：*與正常組比較，P0.05 2.3 FHIT與PCNA表達(dá)之間的關(guān)系 在宮頸CIN和宮頸癌中，F(xiàn)HIT表達(dá)陰性而PCNA表達(dá)陽(yáng)性的患者為51例，F(xiàn)HIT表達(dá)陽(yáng)性而PCNA表達(dá)陰性的患者為4例。兩個(gè)指標(biāo)的表達(dá)同時(shí)為陽(yáng)性的患者為50例，而兩個(gè)指標(biāo)的表達(dá)同時(shí)為陰性的患者為0例。應(yīng)用配對(duì)四格表2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。表3 宮頸CIN和宮頸癌中FHIT與PCNA表達(dá)之間的關(guān)系 3 討論 宮頸癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位，僅次于乳腺癌。宮頸癌有較長(zhǎng)的癌前病變階段，約為10年。早期檢查，盡早發(fā)現(xiàn)癌前病變是預(yù)防宮頸癌的最有效手段，從這個(gè)意義上來(lái)說(shuō)，宮頸癌是可防可治的5。脆性組氨酸三聯(lián)體基因（FHIT）是在染色體3p區(qū)域發(fā)現(xiàn)的候選抑癌基因，已有研究發(fā)現(xiàn)該基因與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)6。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是細(xì)胞增殖所必需的蛋白，腫瘤形成時(shí)表達(dá)增高，常被用于反映腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)。因此，作者研究FHIT蛋白和PCNA在宮頸癌前期病變和宮頸癌中的表達(dá)情況，以探討其臨床意義。 3.1 FHIT與宮頸病變的關(guān)系 1996年，Ohta等7利用外顯子捕獲法，在3p14.2區(qū)域找到一個(gè)新的候選抑癌基因，該基因跨越人類染色體脆性部位FRA3B和家族性腎細(xì)胞癌基因相關(guān)的染色體交叉異位t（3;8）（p14.2;424）斷裂點(diǎn)，并含有編碼組氨酸三聯(lián)體的功能區(qū)，遂被命名脆性組氨酸三聯(lián)體（FHIT）。FHIT基因位于3p14.2，在染色體上占據(jù)500kb大小的位置，含10個(gè)外顯子，轉(zhuǎn)錄1個(gè)長(zhǎng)1100bp的mRNA并編碼147個(gè)氨基酸16.8kD的蛋白質(zhì)。外顯子5至9組成開放性閱讀框架（open reading frame,ORF）,編碼FHIT蛋白質(zhì)。FHIT蛋白在腫瘤中的作用尚不完全清楚，一般認(rèn)為存在以下機(jī)制：（1）調(diào)控細(xì)胞周期8；（2）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；（3）Ap3A水解酶活性；（4）FHIT底物復(fù)合物的作用；（5）Asish等9發(fā)現(xiàn)FHIT蛋白可與tubulin結(jié)合，后者為形成微管的主要成分，從而抑制細(xì)胞的分裂與增生；（6）mRNA脫帽功能；（7）FHIT基因失活還與DNA損傷后修復(fù)能力增加相關(guān)，提示FHIT基因依賴的DNA損傷修復(fù)反應(yīng)可能在腫瘤進(jìn)展中起一定作用10。本研究顯示，F(xiàn)HIT在正常的宮頸組織中均為陽(yáng)性表達(dá)，無(wú)缺失發(fā)生。在CIN組中的陰性率為24.4%，與正常組比較P0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CIN級(jí)和CIN/級(jí)中FHIT的陰性率分別為10.0%和36.0%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示檢測(cè)CIN中的FHIT蛋白，可用作高級(jí)別的CIN篩查。FHIT在宮頸癌組中的陰性率為66.7%，與正常組比較P0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究還顯示，在宮頸CIN三個(gè)期別的各組中，均有FHIT的陰性表達(dá)，說(shuō)明FHIT表達(dá)缺失在宮頸病變的早期就已經(jīng)開始，由此推測(cè)，F(xiàn)HIT表達(dá)缺失是宮頸癌發(fā)生的早期事件。而宮頸癌中FHIT的陰性率高達(dá)66.7%，說(shuō)明FHIT表達(dá)缺失與宮頸癌有著密切的關(guān)系。這與Butler等8的報(bào)道一致。Nakagawa等11的研究也提出相同的結(jié)論，即FHIT基因的表達(dá)缺失在啟動(dòng)宮頸鱗癌的發(fā)生中起重要作用，而不是腫瘤進(jìn)展的結(jié)果。 3.2 PCNA與宮頸病變的關(guān)系 PCNA是一種核內(nèi)蛋白質(zhì)，分子量為36kD，從人PCNA的cDNA序列推知人PCNA蛋白含有261個(gè)氨基酸，是DNA聚合酶的輔助蛋白，參與調(diào)節(jié)DNA的合成，與細(xì)胞的增殖周期密切相關(guān)。PCNA有兩種存在形式：一種是可溶性，存在于靜止和增殖細(xì)胞中，另一種為不溶性，緊密結(jié)合于細(xì)胞核DNA的特定位點(diǎn)上，免疫熒光技術(shù)證實(shí)只有這種PCNA與DNA復(fù)制位點(diǎn)有關(guān)，證明在DNA復(fù)制中起作用的是不溶性PCNA。PCNA在DNA模板鏈和隨從鏈的合成過(guò)程中均起重要作用12、13。PCNA為增殖期細(xì)胞特異性表達(dá)的核蛋白，是目前腫瘤增殖活動(dòng)研究中可靠的增殖期標(biāo)志物14。幸海等15研究發(fā)現(xiàn)，CIN和宮頸癌PCNA表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于正常宮頸，P<0.01。本研究也提示PCNA在宮頸CIN和宮頸癌中的陽(yáng)性率分別為93.3%和98.3%，兩者與正常宮頸中65.0%的陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與Wang等16的研究結(jié)果相似。本文還發(fā)現(xiàn)，PCNA的陽(yáng)性率在CIN級(jí)、CIN/級(jí)及宮頸癌中分別是90.0%、96.0%及98.3%，這表明隨著宮頸病變的加重，細(xì)胞的增殖活性增高。故PCNA可成為反映CIN和宮頸癌細(xì)胞異常增殖的靈敏標(biāo)志。 3.3 宮頸CIN和宮頸癌中FHIT基因表達(dá)與PCNA表達(dá)之間的關(guān)系 許多學(xué)者研究表明用酵母雙雜交法篩選到與FHIT蛋白相互作用的蛋白，它的序列與人泛素結(jié)合酶9完全相同，已知酵母的泛素結(jié)合酶9與S期及M期細(xì)胞周期蛋白的降解有關(guān)，因此推測(cè)FHIT蛋白可能通過(guò)泛素結(jié)合酶來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期。同時(shí)檢測(cè)點(diǎn)異?？赡軐?dǎo)致受損傷的DNA順利進(jìn)入S期，而不能得以修復(fù)，從而促使細(xì)胞轉(zhuǎn)化或增殖失控或凋亡受阻。因此提示FHIT蛋白可能具有對(duì)細(xì)胞增殖的負(fù)性調(diào)控作用。FHIT基因缺失或突變可能導(dǎo)致FHIT蛋白表達(dá)降低或喪失，從而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)HIT基因的蛋白表達(dá)與PCNA的表達(dá)具有相關(guān)性（P<0.05），兩者呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)HIT表達(dá)缺失者PCNA表達(dá)高，細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)。有研究表明17，在子宮內(nèi)膜腺癌中FHIT蛋白及PCNA的表達(dá)亦呈負(fù)相關(guān)?？傊?，F(xiàn)HIT蛋白的功能與調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞分裂增生有關(guān)，而PCNA是反映細(xì)胞增殖活性的標(biāo)志物，其含量反映細(xì)胞的增殖程度，作者推測(cè)，在正常宮頸組織中，F(xiàn)HIT蛋白和PCNA共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，二者存在平衡關(guān)系。而CIN和宮頸癌中，存在FHIT蛋白和PCNA的失衡，導(dǎo)致這種失衡的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。 總之，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟的過(guò)程，是在致病因素作用同時(shí)，多種基因同時(shí)或先后協(xié)同作用的結(jié)果。本研究表明，F(xiàn)HIT和PCNA均參與了宮頸癌前病變和宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。因此，作者認(rèn)為，F(xiàn)HIT和PCNA對(duì)于宮頸癌前病變和宮頸癌的篩查及早期診斷具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Volgareva G,Zavalishina L,Andreeva Y,et al. 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