信號傳導(dǎo)與激活因子2基因在食管癌中的表達(dá)【摘要】 目的： 篩選食管癌中特異表達(dá)的基因，進(jìn)一步了解食管癌發(fā)生的分子機制。方法： 利用熒光差異顯示技術(shù)(DD-PCR)獲得差異表達(dá)的片段，對這些片段進(jìn)行克隆和序列分析。通過在基因庫中同源性檢索，查找差異片段相對應(yīng)的同源基因。利用實時熒光定量PCR技術(shù)在食管癌臨床標(biāo)本中進(jìn)行驗證。結(jié)果： 通過DD-PCR獲得的差異片段中有一個片段對應(yīng)于信號傳導(dǎo)與激活因子2(stat2)基因，該基因的讀碼框長2 556 bp，編碼852個氨基酸，編碼蛋白分子量約97.9 kD。應(yīng)用實時熒光定量PCR方法進(jìn)一步驗證發(fā)現(xiàn)該基因在食管癌組織中的表達(dá)量高于其對應(yīng)的癌旁組織（P<0.05, n=16）。結(jié)論： stat2基因在食管癌組織中呈高表達(dá)，推測其可能在食管癌的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用。 【關(guān)鍵詞】 熒光差異顯示; 定量PCR; 食管癌; 信號傳導(dǎo)與激活因子2; 基因表達(dá)Abstract Objective: To further investigate the molecular mechanism of esophageal carcinogenesis, and to validate the genes expressed differently in esophageal cancer. Methods： mRNA differential display(DD-PCR) was employed to search differently expressed fragments, some of which were cloned and sequenced. By homology analysis in GenBank, corresponding homologous genes of those fragments were found. The corresponding genes of those differently expressed fragments were validated by Real-time quantitative PCR. Results： By DD-PCR, one of the highly expressed EST in cancer tissues was identified to be Homo sapiens signal transducer and activator of transcription 2(stat2)gene. The results of real-time quantitative PCR showed that the expression level of stat2 in esophageal cancer tissues were significantly higher than that in normal tissues(n=16, P<0.01). The ORF of stat2 gene was 2556 base pair long and encodes 852 amino acids. The molecular weight was about 97.9 kD. Conclusion： The over-expression of stat2 gene may indicate an important role in the occurrence and development of esophageal cancer.Key words fluorescent differential display; real-time quantitative PCR; esophageal cancer; stat2; gene expression食管癌是最主要的惡性腫瘤類型之一，我國是世界上食管癌的高發(fā)地區(qū)。同時，食管癌的發(fā)生在我國也具有地區(qū)差異性，如河南省林縣和江蘇省揚中地區(qū)等都是食管癌高發(fā)地區(qū)。目前，已發(fā)現(xiàn)一些食管癌的癌變機制相關(guān)因素，但關(guān)鍵原因尚未明確1。癌基因、抑癌基因和細(xì)胞周期控制基因的異常表達(dá)參與了食管癌及其他惡性腫瘤的演進(jìn)2,如Ohta等3的研究表明腫瘤抑制基因-FHIT基因，在大約50%的食管癌、胃癌和結(jié)腸癌中存在轉(zhuǎn)錄異常，Gleeson等4在Barrett食管腺癌中發(fā)現(xiàn)了特異性p53突變譜。而細(xì)胞周期控制基因cyclinD1的擴增與食管鱗癌明顯相關(guān)5。在癌基因中stat(singnal transducers and transcription activator， stat)家族和myc家族等均對腫瘤的發(fā)生起重要作用。STAT家族是具有高度同源性的轉(zhuǎn)錄因子，可介導(dǎo)多種細(xì)胞因子和生長因子的信號向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和凋亡有密切關(guān)系6。目前有關(guān)stat2在各種腫瘤中表達(dá)狀況的報道很少，本研究應(yīng)用mRNA定量分析的方法發(fā)現(xiàn)stat2基因在食管癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，為食管癌發(fā)生的機制研究提供了新思路。1 材料與方法1.1 臨床材料 標(biāo)本來自2006年6月至11月于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療的16例食管癌患者。每例患者均取手術(shù)切除的食管癌組織及癌旁正常組織，并經(jīng)病理檢查證實。組織離體后立即在液氮中速凍，并置于-70 冰箱中保存。1.2 試劑和儀器 RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司，熒光差異顯示試劑盒購于Genhunter公司，SuperScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Gibco公司，熒光定量PCR試劑盒和PMD18T-vector試劑盒購于TaKaRa公司。主要儀器有FMBIO（HITACHI）熒光差異顯示系統(tǒng)，STRATAGENE MX3000P熒光定量PCR儀，Genspec（HITACHI）。1.3 總RNA的制備 每例取約20 mg 標(biāo)本放入1 ml Trizol中，充分研磨，移入離心管，加入200 l 氯仿，混勻，4 12 000 r/min 離心20 min，將上清移至含有300 l異丙醇的離心管中，混勻，室溫沉淀20 min，4 12 000 r/min 離心15 min，棄上清，用不含RNase的70%乙醇清洗后烘干，加入30 l 不含RNase的雙蒸水溶解。用不含RNase的DNase去除污染的基因組DNA。用Genspec檢測RNA，確定其質(zhì)量和濃度。同時取0.5 l 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA完整性。1.4 熒光差異顯示（FDD） 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)分別用錨定引物HT11A,HT11G,HT11C。以總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，每管反應(yīng)體系如下：取總RNA（1 g/l）2 l，加入錨定引物（2 mol/L） 2 l，混勻，65加熱5 min，迅速置于冰上，加入5SuperScriptRT緩沖液 4 l，RNase抑制劑（40 U/l）0.5 l，DTT（100 mmol/L）2 l, dNTP(250 mol/l) 2 l, SuperScript逆轉(zhuǎn)錄酶（200 U/l）0.2 l，加入DEPC水將總反應(yīng)體系補至20 l。反應(yīng)條件：25 5 min,42 10 min,50 60 min,72 15 min。 熒光差異顯示PCR選用與反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所用錨定引物序列完全相同的熒光標(biāo)記錨定引物（FHT11A,FHT11G,FHT11C）,選用試劑盒中的隨機引物HAP-9。反應(yīng)體系：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 l，10緩沖液 2 l，dNTP(250 mol/L) 2 l，F(xiàn)HT11N（n=A，G，C）2 l，HAP-9（2 mol/L） 2 l，Taq酶（5 U/l）0.2 l，用無RNA酶的H2O將總體系補至20 l。反應(yīng)條件：94 2 min；94 30 s，50 30 s，72 1 min,35 個循環(huán)；72 10 min。 PCR產(chǎn)物8 l中加入2 l上樣緩沖液置于PCR儀上，80 變性 5 min。隨后，PCR產(chǎn)物在電泳儀上樣，在6 %的聚丙烯酰胺凝膠上以1 400 V恒壓電泳5 h左右。電泳結(jié)束后將凝膠在FMBIO熒光差異顯示系統(tǒng)上掃描。從膠板上切取差異條帶。 1.5 差異片段的克隆 差異的條帶經(jīng)切割和處理后作為模板,進(jìn)行再次擴增, 反應(yīng)條件和反應(yīng)體系同第一次PCR擴增。將差異片段與PMD18T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞。用藍(lán)白斑篩選陽性克隆，陽性克隆經(jīng)酶切鑒定后測序。1.6 熒光定量PCR分析 應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計用于定量PCR的stat2基因引物,選用-actin作為內(nèi)參,檢測stat2基因在16例食管癌組織與癌旁組織中的表達(dá)，引物序列見表1。 反應(yīng)體系參照TaKaRa公司熒光定量PCR試劑盒的說明書。反應(yīng)條件：94 20 s，57 30 s，72 30 s，35 個循環(huán)。根據(jù)2-Ct公式計算stat2基因相對拷貝數(shù)。1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計軟件, 采用單因素方差分析,以P<0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 食管癌和癌旁組織總RNA的提取 提取的總RNA進(jìn)行凝膠電泳結(jié)果顯示, 28 S和18 S條帶較為明顯,總RNA 的完整性和質(zhì)量較好。為進(jìn)一步證實,采用GeneSpec檢測,D(260 nm)/D(280 nm)值均在1.82.0之間,結(jié)果與電泳結(jié)果一致,達(dá)到反轉(zhuǎn)錄要求。表1 stat2基因熒光定量PCR驗證及全長基因克隆的引物序列（略）Tab 1 Primer sequences used for quantitative RT-PCR and stat2 full length cloning 2.2 熒光差異顯示結(jié)果及陽性差異片段的篩選 聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn),食管癌組織和癌旁組織中基因的表達(dá)存在差異性。為進(jìn)一步了解這些差異片段的信息,將差異片段切出后,進(jìn)行二次擴增,并對擴增到的片段進(jìn)行克隆和序列分析。將測序獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對,其中一個差異片段(圖1)與基因庫中的stat2基因同源性達(dá)到100%。 圖1 熒光差異顯示凝膠圖譜（略）Fig 1 Example of differential display fingerprints2.3 熒光定量PCR結(jié)果 對熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)stat2基因在食管癌癌組織中的表達(dá)量高于癌旁組織, 癌組織中stat2基因表達(dá)量大約是癌旁組織中的3.7倍，其差異具統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。 圖2 stat2基因在16例食管癌組織及癌旁組織中平均相對表達(dá)量（略）Fig 2 Relative quantification of stat2 mRNA level inesophageal cancer tissues and normal tissues2.4 stat2基因全長ORF的克隆 根據(jù)獲得的基因的序列，設(shè)計特異引物用于stat2基因全長ORF的克隆，引物序列見表1,將擴增出來的stat2基因與PMD-18T載體連接,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞，以Sal和EcoR酶切鑒定陽性克隆(圖3),將陽性克隆進(jìn)行測序分析。 M: DNA Marker/-Hind digest; 1: stat2 PCR產(chǎn)物; 2: PMD-18T+stat2雙酶切; 3: 陽性質(zhì)粒為模板PCR產(chǎn)物圖3 stat2基因ORF克隆的電泳圖譜（略）Fig 3 Full length cDNA of stat2 gene3 討論 STAT為一種核轉(zhuǎn)錄因子，哺乳動物中STAT家族成員參與了多種細(xì)胞因子、生長因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)節(jié)人體免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞的生長、分化等。STAT具有強烈的抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用,參與了人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和演進(jìn)7，STATs蛋白家族成員的相對分子質(zhì)量在84113 kD之間,有共同的5個保守結(jié)構(gòu)域,其中第600到第700位氨基酸殘基為高度保守的SH2 區(qū),是STATs對活化的受體復(fù)合物補位、JAK激酶家族磷酸化STATs、STATs二聚體化及結(jié)合DNA所必需的。目前,對STATs家族在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中作用的研究主要集中在STAT1， STAT3,STAT5。STAT1是第一個發(fā)現(xiàn)的STAT成員,可被INF,INF,IL26等細(xì)胞因子激活，STAT1介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),并能負(fù)性調(diào)節(jié)c-myc啟動子表達(dá)，在多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌等腫瘤中, 可檢測到STAT1的高表達(dá)8。已證實STAT3的異常活化與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤、白血病、心血管疾病、肥胖、肝細(xì)胞再生等多種病理生理過程有著密切的關(guān)系9，10。STAT5由兩種高度同源的STAT5a和STAT5b組成,在多種造血系統(tǒng)腫瘤中,STAT5被活化11。 目前國內(nèi)外關(guān)于stat2在各種腫瘤中表達(dá)情況的報道很少,一般認(rèn)為STAT2與STAT1形成二聚體而參與JAK/STAT信號通路12。本研究利用熒光差異顯示技術(shù)及熒光定量PCR等方法，發(fā)現(xiàn)stat2基因在食管癌組織中的表達(dá)量高于其對應(yīng)的癌旁組織，推測stat2基因在食管癌組織中的高表達(dá)可能與食管癌的形成相關(guān)。其可能的機制是，癌組織中高表達(dá)量的STAT2通過其SH2結(jié)構(gòu)域與受體上的磷酸化Tyr殘基結(jié)合,并在JAK激酶的作用下,其C端Tyr殘基發(fā)生磷酸化，磷酸化的STAT2與磷酸化的STAT1也通過SH2結(jié)構(gòu)域相互作用形成二聚體并進(jìn)入細(xì)胞核,與相關(guān)基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，再經(jīng)過某種修飾作用(如Ser 的磷酸化) 誘導(dǎo)基因表達(dá)，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生和演進(jìn)。對stat2基因的功能以及stat2基因在其他惡性腫瘤中是否高表達(dá)等方面進(jìn)行深入研究，將有助于解析食管癌形成、發(fā)展的機理?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 聞 燕，王文兵，高 廣，等.食管癌中高表達(dá)的鈣結(jié)合蛋白1基因的序列分析及意義J.江蘇大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2007，17（2）:155-157.2 Kuroki T, Trapasso F, Yendamuri S, et al. 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