唾液富組蛋白5表達(dá)載體的構(gòu)建【摘要】 目的 將唾液富組蛋白5 cDNA克隆至表達(dá)載體pGEX4T1。方法 EcoR+ Sal雙酶切克隆載體pMD19Thrp5及pGEX4T1，回收目的片段hrp5及雙酶切載體pGEX4T1，將二者連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，氨芐青霉素篩選陽性菌落，PCR、酶切、測序鑒定重組質(zhì)粒。結(jié)果 唾液富組蛋白5的cDNA正確克隆至表達(dá)載體pGEX4T1，無突變。 結(jié)論 重組載體pGEX4T1hrp5構(gòu)建成功。 【關(guān)鍵詞】 唾液富組蛋白5 克隆 表達(dá)載體 Construction of Expression Vector of Salivary Histatin 5 ZHOU Qi，JIN Kehua，LUO Desheng，et al (Students of Grade 2004, Xianning University Medical School，Xianning Hubei 437100，China) ABSTRACT：Objective To clone the cDNA of salivary histatin 5 to expression vector pGEX4T1.Methods pMD19Thrp5 and pGEX4T1 were digested by Sal+ EcoR.The digested hrp5 and pGEX4T1 were linked and transformed to E.coli DH5，and the positive colonies were screened by ampicillin, and identified by PCR，digestion and sequencing. Results The cDNA of hitatin 5 was correctly inserted into expression vector pGEX4T1 without mutation. Conclusion Recombinant vector pGEX4T1hrp5 was constructed successfully. KEY WORDS:Salivavry Histatin 5；Clone；Expression vector 唾液富組蛋白5（HRP5）為富含組氨酸的陽離子多肽，存在于人類和靈長類動物腮腺唾液分泌物中。研究表明HRP5能有效殺滅耐藥的白色念珠菌，且具有抗細(xì)菌、抗腫瘤及治療關(guān)節(jié)炎的作用，作用機(jī)理獨特，未發(fā)現(xiàn)毒副作用，不易誘導(dǎo)抗藥菌株的產(chǎn)生，作為多肽類藥物防治口腔等疾病潛力巨大1。唾液中HRP5含量低，采集唾液極為不便，提取過程繁瑣，產(chǎn)率低；化學(xué)合成成本高；我們構(gòu)建了含HRP5基因的原核表達(dá)載體，以望表達(dá)具有生物活性的HRP5。 1 材料與方法 1.1 材料 克隆載體pMD19Thrp5為前期構(gòu)建2，原核表達(dá)載體pGEX4T1、大腸桿菌DH5購自invitrogen公司，限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒、酶購自寶生物（大連）公司。氨芐青霉素（Amp）、瓊脂糖、Yeast Extract、Tryptone、DNA Marker購自武漢凌飛科技公司，引物由上海英駿公司合成。 1.2 提取質(zhì)粒pGEX4T1 將含pGEX4T1的菌株于含 Amp（100g/ml）的固體LB培養(yǎng)基上劃線，37倒置培養(yǎng)過夜。 選擇生長良好的單菌落，接種至4ml含Amp（100g/ml）的LB培養(yǎng)基，37 200轉(zhuǎn)/min（rpm）振蕩培養(yǎng)12h。 取1.5 ml2菌液，按試劑盒抽提質(zhì)粒。 1.3 目的片段的酶切和回收 按文獻(xiàn)2體系，酶切5份克隆載體，合并反應(yīng)液，沉淀后進(jìn)行2瓊脂糖凝膠電泳分離，切取目的片段，按試劑盒回收。 1.4 酶切表達(dá)載體并回收 酶切體系如下： pGEX4T1 6l 10H Buffer 6l EcoR 2l Sal2l dH2O 44l 溫和混勻，37水浴4h；加入120l無水乙醇，6l 3mol/L 醋酸鈉，混勻，-80沉淀1h；12000 rpm離心5min，棄乙醇，600l 70乙醇洗滌沉淀，12000 rpm離心5min，棄乙醇，室溫風(fēng)干，加入20l dH2O溶解沉淀，0.8瓊脂糖凝膠電泳分離，按試劑盒回收表達(dá)載體。 1.5 表達(dá)載體構(gòu)建 取目的片段及酶切載體各4l，10ligation buffer 1l，T4 DNA ligase 1l，混勻，16連接過夜。轉(zhuǎn)化DH5感受細(xì)胞，于含Amp（100g/ml）的LB培養(yǎng)基篩選陽性菌落。 1.6 重組表達(dá)載體的鑒定 1.6.1 PCR鑒定 挑取陽性菌落，用鑒定引物P1: 5GTGAATTCGACTCTCATGCG 3,P2: 5ATGTCGACATAACCGCGATG 3 PCR鑒定，反應(yīng)體系：dNTPs（10mmol/L）1l，10buffer 5l， MgCl2（25mmol/L）3l，P1(5pmol/L) 2l，P2(5pmol/L) 2l，Taq DNA聚合酶(5U/l) 0.25l，ddH2O 36.5l。循環(huán)參數(shù)：始變性 95 3min；94 30s，54 30s，72 30s 30個循環(huán)；72延伸10min。擴(kuò)增后電泳檢測。 1.6.2 酶切鑒定 培養(yǎng)PCR鑒定的陽性菌落，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定。酶切體系： pGEX4T1 20l 10H Buffer 10l EcoR 3l Sal3l dH2O 64l 溫和混勻，37水浴4h；按1.4方法沉淀、洗滌、溶解，2.0%瓊脂糖凝膠鑒定。 1.6.3 測序鑒定 將1.6.2酶切鑒定的陽性質(zhì)粒送寶生物（大連）公司進(jìn)行DNA序列測定。 2 結(jié) 果 2.1 質(zhì)粒pGEX4T1的提取 電泳后可見1、2泳道抽提片段大小位于43676557bp，與質(zhì)粒pGEX4T1（4900bp）相符，即為所需質(zhì)粒（圖1）。 2.2 重組表達(dá)載體的鑒定 2.2.1 PCR鑒定 由圖2可知，重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物略小于100bp，與目的片段（92 bp）長度相符。 2.2.2 酶切鑒定 酶切后鑒定結(jié)果如圖3，重組載體雙酶切（1、2泳道）后出現(xiàn)略小于100bp片段，與插入目的基因大小一致。 2.2.3 重組載體序列測定 將PCR、酶切鑒定的陽性重組載體送寶生物（大連）公司進(jìn)行序列測定，結(jié)果表明，目的基因正確重組至表達(dá)載體pGEX4T1，無點突變、移碼突變。 圖 1 質(zhì)粒pGEX4T1的提取 M：DNA Marker；12：pGEX4T1 圖2 重組載體PCR鑒定 M：DNA Marker；1：PCR鑒定產(chǎn)物；2：陰性對照 圖 3 重組載體酶切鑒定 M：DNA Marker；12： 重組載體 EcoR I+Bam H I雙酶切 3 討 論 HRP5是一種具有細(xì)菌毒性的蛋白，對大腸桿菌有一定殺傷作用，不宜選擇組成性表達(dá)的原核載體。本實驗選用的表達(dá)載體pGEX4T1在酶切位點的5 端帶有編碼谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）基因，將目的片段插入其下游，可與其融合表達(dá)。由于GST可干擾HRP5的空間結(jié)構(gòu)的形成，屏蔽或降低HRP5對大腸桿菌的細(xì)胞毒作用，以利其在細(xì)胞中高效表達(dá)，同時利用GST與標(biāo)記有谷胱甘肽的的凝膠進(jìn)行親和層析，便于融合蛋白表達(dá)后分離純化。 HRP5基因不足100bp，只占重組載體分子量的極小部分，酶切后電泳條帶不明顯，應(yīng)增加酶切體系中重組載體量，保證有足量的酶切片段，增強(qiáng)鑒定目的片段亮度，以便確認(rèn)重組與否。 pGEX4T1載體在GST近BamH I位點處有凝血酶（Thrombin）水解位點，可水解融合蛋白，獲取重組HRP5?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Oppenheim FG，Xu T，McMillian FM,et alHistatins，a novel fa