,第七章 細(xì)胞融合與體細(xì)胞雜交,酸酸 甜甜 才是 生活！細(xì)胞工程技 術(shù) 可以 改變 生活！,雜交,1.通過不同的基因型的個體之間的交配而取得某些雙親基因重 新組合的個體的方法。2.兩條單鏈DNA或RNA的堿基配對。 雜交優(yōu)勢：兩個遺傳基礎(chǔ)不同的植物或動物進(jìn)行雜交，其雜 交后代所表現(xiàn)出的各種性狀均優(yōu)于雜交雙親，比如抗逆性強(qiáng) 、早熟高產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)良等。,一般情況下，通過生殖細(xì)胞相互融合而達(dá)到這一目的過程稱 為雜交。較多的是種間、種內(nèi)雜交。,由體細(xì)胞相互融合達(dá)到這一結(jié)果的過程稱為體細(xì)胞雜交。,部分野生品種的塊莖、果實雖不能 食用，但它們的植株具有較強(qiáng)的抗 病蟲害、抗鹽堿性和耐寒能力。因 此，用野生馬鈴薯和番茄分別與馬 鈴薯、番茄作物雜交，培育出了生 存能力較強(qiáng)的雜交系植物。 雜交玉米等雜交植物比它們的親本 更為健壯，產(chǎn)量更高。,雜交擬南芥（中間）比其親 本（左和右）要大,自然（Nature）2008年11月23 日：中美科學(xué)家近日研究發(fā)現(xiàn)雜交 植物比其親本生長更大更好的原因 ：負(fù)責(zé)光合作用和淀粉代謝的基因 在白天要更為活躍。,騾子：雄驢和雌馬交配所產(chǎn)的雜 種叫驢騾。雌驢和雄馬交配所產(chǎn) 的雜種叫馬騾。,狼狗：狗與狼的雜交后代。,雜交斑馬：由斑馬和馬科動物雜 交產(chǎn)物,獅虎：獅子和老虎的雜交產(chǎn)物。,豹獅：美洲豹與獅子的后代。,不親和性,不親和性：在有性生殖過程中，由于生物個體的細(xì)胞或組織水 平上的不協(xié)調(diào)而使受精或接合不能正常進(jìn)行，或是受精后不能 產(chǎn)生后代的現(xiàn)象。例如：生殖細(xì)胞不能融合，或受精卵不能發(fā) 育，或子代無繁殖能力等。,是雙親個體間基因型的不協(xié)調(diào)或是染色體組非同源性在生殖生 理表型上的一種反映。不親和性是穩(wěn)定物種的重要機(jī)理之一。,種間不親和性：異種、異屬生物個體之間的生殖不親和現(xiàn)象常 由染色體組的不同所造成。一般地說，越是遠(yuǎn)緣則不親和性越 高，直到完全不能受精。,種內(nèi)不親和性：種內(nèi)個體間的不親和現(xiàn)象往往是受不親和基因 所制約而并不是染色體組不同的結(jié)果。,遠(yuǎn)源雜交,遠(yuǎn)緣雜交：不同種屬之間，或是地理上遠(yuǎn)緣的種內(nèi) 亞種之間個體的交配稱為遠(yuǎn)緣雜交。,由于種屬間存在著種種隔離機(jī)制，致使遠(yuǎn)緣雜交常 表現(xiàn)不親和或獲得的遠(yuǎn)緣雜種表現(xiàn)不育。,體細(xì)胞雜交是解決遠(yuǎn)源雜交不親和性的有力手段之 一，更好地利用自然界基因資源，培育新物種。,問 題 ：有沒有可能培育出 地下結(jié)土豆，地上結(jié)番茄 的超級植物？,1978年德國科學(xué)家梅歇 爾斯將番茄與馬鈴薯進(jìn)行 體細(xì)胞雜交育成薯番茄“ 泡馬豆”（po(tato)-,(to)mato）。馬鈴薯與番 茄兩種原生質(zhì)體的融合率 竟高達(dá)4050。,視頻：,/special/show_30437 14/ACRkYAQc9LIhIUwv.html,本節(jié)主要內(nèi)容： 1細(xì)胞融合,2體細(xì)胞雜交及其在育種中的應(yīng)用,關(guān)鍵問題：,細(xì)胞融合的原理、方法與關(guān)鍵環(huán)節(jié),第 一 部 分 細(xì)胞融合,一 定義與意義,細(xì)胞融合（Cell fusion）是指使用人工方法使兩 個或兩個以上的細(xì)胞合并形成一個細(xì)胞的技術(shù)。 對于植物也叫“原生質(zhì)體融合”。親本細(xì)胞是體 細(xì)胞，也叫“體細(xì)胞雜交（somatic cell hybridization）”。,由于它不僅能產(chǎn)生同種細(xì)胞融合，也能產(chǎn)生種間 細(xì)胞的融合，因此細(xì)胞融合技術(shù)在創(chuàng)造新細(xì)胞、 培育新品種方面意義重大。,二 細(xì)胞融合的分類,1.材料：原生質(zhì)體（去除了細(xì)胞壁的裸露的細(xì)胞）、動物細(xì)胞,2.從親本來源：,（1）同核體（Homokaryon）：基因型相同的細(xì)胞融合成的融 合細(xì)胞稱為。,（2）異核體（Heterokaryon）：來自不同基因型的融合細(xì)胞 。,3.從融合效果：,（1）對稱融合（Symmetric fusion）：兩個完整的細(xì)胞間的融 合。,（2）不對稱融合（Asymmetric fusion）：利用物理或化學(xué)方 法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再與另外一個完整細(xì)胞進(jìn)行 融合,三 發(fā)展歷史,自發(fā)融合現(xiàn)象最初在動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。1858年發(fā)現(xiàn) 正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞情 況。動物體內(nèi)的破骨細(xì)胞也是自發(fā)融合形成的多核 細(xì)胞。,1962年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)一種叫日本血凝性病毒(HVJ) 能引起艾氏腹水瘤細(xì)胞融合成多核細(xì)胞的現(xiàn)象。 20世紀(jì)70年代初，華裔加籍科學(xué)家高國楠發(fā)現(xiàn)聚乙 二醇(PEG)能促使植物原生質(zhì)體融合，開拓了植物 細(xì)胞融合的研究。,20世紀(jì)80年代，齊默曼（Zimmerman）等建立電場 誘導(dǎo)細(xì)胞融合方法。,四 細(xì)胞融合原理 1細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能,細(xì)胞膜磷脂分子,擾動出現(xiàn)通道,細(xì)胞橋,主要環(huán)節(jié),（1）親本選擇（單細(xì)胞或原生質(zhì)體制備） （2）兩原生質(zhì)體或細(xì)胞互相靠近，粘附 （3）質(zhì)膜融合形成細(xì)胞橋 （4）胞質(zhì)滲透,（5）細(xì)胞核融合,（6）融合細(xì)胞篩選,原生質(zhì)體及其制備,（1）定義：,去除細(xì)胞壁后裸露的細(xì)胞稱之為原生質(zhì)體 （protoplast）。 （2）特點：,無細(xì)胞壁，可以方便地進(jìn)行遺傳操作、人工誘變 、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移、細(xì)胞融合等操作。 具有全能性，能再生細(xì)胞壁。,（ 3）制備與純化,酶解法的建立,1960年，英國科金第一次采用 酶方法從番茄幼苗大量制備出 原生質(zhì)體。使植物細(xì)胞融合技 術(shù)得以建立。,植物細(xì)胞的細(xì)胞壁主要成分是 纖維素（纖維素微纖絲,Cellulose microfibrils ）、 果膠（pectin）、多糖 （glycan）。,果膠酶、纖維素酶等處理植物 組織，可以破壞胞間層和去掉 細(xì)胞的纖維素外壁，得到游離 的裸露原生質(zhì)體。,4 分離、鑒定與活力分析,（1）分離,飄浮法：常用的飄浮劑有蔗糖、Percoll、Ficoll等。 離心法：低速離心，收集沉淀。 （2）鑒定與活力分析,低滲爆破：爆破后是無形的。滲透壓調(diào)節(jié)劑：葡萄糖、甘 露醇、山梨醇等。,染色發(fā)法：有活力的原生質(zhì)體吸收不同染料顯示與死亡細(xì) 胞不同的顏色來分析。FDA（二乙酸熒光素）能自由地穿 越細(xì)胞質(zhì)膜，在活細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)DA被酯酶裂解即發(fā)熒光（熒 光素），由于熒光素不能自由通過質(zhì)膜，因而可以在熒光 顯微鏡下通過具熒光的細(xì)胞的觀察確定細(xì)胞活性。,關(guān)鍵： 細(xì)胞核的融合,若是沒發(fā)生細(xì)胞核的融合，僅發(fā) 生了細(xì)胞質(zhì)的融合，則可能成為 嵌合細(xì)胞。,含有多個核的異核細(xì)胞合并后形 成的單核細(xì)胞稱為合核細(xì)胞。,細(xì)胞核的合并發(fā)生在有絲分裂過 程中。但是這種有絲分裂只有當(dāng) 兩個核的DNA合成基本同步時才 能發(fā)生：兩個核同時進(jìn)行有絲分 裂，形成一個紡錘體，全部染色 體都排列在一個赤道板上，結(jié)果 伴隨著細(xì)胞分裂就形成了單核的 子細(xì)胞，其細(xì)胞核中含有雙親細(xì) 胞的染色體。,五 細(xì)胞融合方法,1.生物法,病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合：研究最早的細(xì)胞融合誘導(dǎo)方法。主要是由于 病毒會與宿主細(xì)胞膜直接融合，同時進(jìn)入兩個細(xì)胞就會打破兩個 細(xì)胞膜的隔閡，引發(fā)細(xì)胞質(zhì)的交流，進(jìn)而達(dá)到細(xì)胞融合的目的。 原因可能是病毒的磷脂外衣與動物細(xì)胞膜相似，病毒外殼上的某 些糖蛋白有促進(jìn)細(xì)胞融合的功能。,仙臺病毒、皰疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒等。仙臺病毒（ HAJ）是兩層磷脂組成的外膜包裹著RNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合體。因 HAJ病毒毒力弱，易被滅活而常采用。,缺點：要提前大量培養(yǎng)病毒，并且滅活后才能作為融合劑使用， 操作繁瑣，而且一旦滅活不充分的話，病毒還可能感染操作者與 親本細(xì)胞。因此，目前已經(jīng)很少使用病毒誘導(dǎo)法進(jìn)行細(xì)胞融合。,原理與過程,（1）足夠量的病毒顆粒附著在 細(xì)胞膜上起搭橋作用，使細(xì)胞 聚集在一起。,（2）通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì) 胞膜的作用使兩個細(xì)胞膜間互 相滲透，胞質(zhì)互相融合。粘結(jié) 部位質(zhì)膜被破壞，不同細(xì)胞間 形成通道，細(xì)胞質(zhì)流通并融合 （病毒也隨之進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)）。,（3）有絲分裂，細(xì)胞核融合， 形成雜種細(xì)胞。,2化學(xué)法,可以采用的化學(xué)誘導(dǎo)劑包 括：,NaNO3、高pH的高濃度Ca2+,離子、聚乙二醇（PEG） 、溶菌酶、明膠、抗體、 植物凝血素伴刀豆球蛋白 A等。,細(xì)胞膜電荷平衡被打破。,（ 1） NaNO3誘導(dǎo)融合,1909年，凱斯特（Kuster）發(fā)現(xiàn)機(jī)械分離的發(fā)生,了質(zhì)壁分離的洋蔥表皮細(xì)胞原生質(zhì)體在NaNO3溶,液中可以恢復(fù)并伴隨著細(xì)胞融合。,1972年，卡爾森（Carlson）利用NaNO3誘導(dǎo)融,合了粉蘭煙草和郎氏煙草原生質(zhì)體，培育出世界 第一株體細(xì)胞雜種。,NaNO3的鈉離子可以中和原生質(zhì)體表面負(fù)電荷， 引起原生質(zhì)體聚集，促進(jìn)細(xì)胞融合。NaNO3對原,生質(zhì)體無損害，但融合效率低，一般小于4%。,（ 2）高pH的高濃度 Ca2+離子誘導(dǎo)融合,1973年，凱勒（Keller）和梅爾切斯（Melchers） 發(fā)現(xiàn)采用強(qiáng)堿性（例如pH10.5）的高濃度鈣離子溶,液（50mmol/LCaCl22H2O）在37下處理兩個品系,的煙草葉肉原生質(zhì)體，很容易促使融合，融合率可 以達(dá)到10%。,鈣離子中和原生質(zhì)體膜或細(xì)胞膜表明表面電荷，使 彼此緊密接觸，決定質(zhì)膜的穩(wěn)定性和可塑性；高pH 能改變質(zhì)膜的表面電荷，利于細(xì)胞融合。,（3）PEG誘導(dǎo),聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)是一種多聚化合物,，分子式為H(OHCH2-CH2)nOH)。常用的PEG平均分子量在,20020,000之間，分子量1,000以下者為液體，1,000以 上者為固體。,PEG分子具有輕微的負(fù)極性，可以與具有正極性基團(tuán)的水 分子、蛋白質(zhì)、碳水化合物形成氫鍵，在相鄰的原生質(zhì) 體間起到分子橋的作用，使原生質(zhì)體接觸。,當(dāng)PEG分子被洗脫時，膜電荷發(fā)生紊亂而重新分配。此時 ，一種原生質(zhì)體上帶正電的基團(tuán)可能與另外一個原生質(zhì) 體中帶負(fù)電的基團(tuán)相連，導(dǎo)致原生質(zhì)體融合。,（ 4）高Ca2+和pH誘導(dǎo)PEG結(jié)合誘導(dǎo),在高Ca2+和pH溶液的作用下，將 與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子洗脫，將 進(jìn)一步加劇電荷平衡失調(diào)，從而 提高融合的幾率。因此，PEG結(jié) 合高pH的高濃度Ca2+離子誘導(dǎo)融 合方法成為一種較常用的細(xì)胞融 合方法。,優(yōu)點：基于PEG的誘導(dǎo)融合優(yōu)點 是融合成本低，勿需特殊設(shè)備； 融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合 過程不受物種限制。,缺點：是融合過程繁瑣，PEG可 能對細(xì)胞有毒害。,細(xì)胞融合例子1 甘藍(lán)與大白菜的化學(xué)誘導(dǎo)融合,3 物理法,電融合誘導(dǎo)法（Electrofusion）：利用電場來誘導(dǎo)細(xì)胞彼此連接 成串，再施加瞬間強(qiáng)脈沖促使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，促進(jìn)細(xì)胞融 合的技術(shù)。,原理：在直流電脈沖的刺激下，細(xì)胞膜或原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷 和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞或原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜 瞬間破裂，進(jìn)而連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。 優(yōu)點：融合率高、重復(fù)性與可控制性強(qiáng)。 缺點：可能會造成不可恢復(fù)的細(xì)胞損傷。,棉花細(xì)胞電融合,BLS細(xì)胞融合儀 （1）聚集：在直流電脈沖 的誘導(dǎo)下，極化產(chǎn)生偶極子 ，彼此靠近，定向排列成串 球狀。 （2）細(xì)胞膜融合：在直流 電脈沖的誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體 膜兩側(cè)產(chǎn)生電勢，正負(fù)電荷 相吸，細(xì)胞膜變薄，觸發(fā)膜 的穿孔（質(zhì)膜瞬間破裂）。 （3）異核體：膜之間形成 通道，細(xì)胞質(zhì)等得以交換、 融合。 （4）融合細(xì)胞：細(xì)胞核融 合。,細(xì)胞融合舉例2 薄荷的電誘導(dǎo)融合,親本：E33、E47兩個薄荷親本原生質(zhì)體（5-9105） ，0.7M山梨醇。,儀器：Eppendorf電轉(zhuǎn)儀、融合杯（-250微升，-50微 升）,觀察：DAPI染色：4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚是一種常用 的熒光染料，與DNA的雙鏈緊密結(jié)合。結(jié)合后產(chǎn)生的 熒光基團(tuán)的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好 UV（紫外光）的激發(fā)波長正好是356nm。染色標(biāo)記細(xì) 胞核的位置。 參數(shù)：,電壓：1.5-3V，超過2V破裂，選1.5V。 脈沖電壓：0-300V。,脈沖時間：30-60S，每次增加10S，40S最佳。,融 合 率 達(dá) 到 16-27%， 原生質(zhì)體存 活率97%,六 融合細(xì)胞篩選,因融合的隨機(jī)性而成為細(xì)胞融合的關(guān)鍵而必需,的技術(shù),1篩選的原因與必要性,細(xì)胞融合是一個隨機(jī)的物理過程，經(jīng)融合后細(xì)胞 將以多種形式出現(xiàn)，需要通過培養(yǎng)和篩選，除去 不需要的細(xì)胞，分離出需要的雜種細(xì)胞，從而解 決融合細(xì)胞的選擇問題。,問 題 ：A 與B 融 合過程中，你能預(yù)見有哪些 形式的細(xì)胞嗎？ A-B，A-A，B-B。,A-A-A，B-B-B，A-A-B,B-B-A等多聚體。 未融合的A，B。,2雜種細(xì)胞篩選方法,（1）細(xì)胞形態(tài)大小差異,（2）選擇性培養(yǎng)基篩選法：利用原生質(zhì)體對培養(yǎng) 基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞的方法。 例如：利用抗性標(biāo)記、酶缺陷型、激素需求差異 等。親本原生質(zhì)體生長要求外源激素，而有的雜 種細(xì)胞由于雙親互補(bǔ)作用會產(chǎn)生內(nèi)激素，從而使 雜種細(xì)胞能在無激素的培養(yǎng)基上生長。 （3）再生后雜種與親本形態(tài)、性質(zhì)差異,細(xì)胞融合 例子3： 利用抗性標(biāo)記進(jìn)行的融合細(xì)胞篩選,七 細(xì)胞融合的應(yīng)用,植物：體細(xì)胞雜交培育新品種,動物：單克隆抗體生產(chǎn)（動物細(xì)胞生物制藥講授）,第 二 部 分 體細(xì)胞雜交,Somatic cell hybridization,一 體細(xì)胞雜交育種的意義,1克服有性不親和性，實現(xiàn)遠(yuǎn)源遺傳重組。,2問題：與基因工程改造相比有什么優(yōu)點？,植物的抗逆性多為多基因控制，因此易于實現(xiàn)多 基因控制性狀。,3細(xì)胞質(zhì)遺傳：由胞質(zhì)遺傳物質(zhì)引起的遺傳現(xiàn)象（ 又稱非染色體遺傳）。,二 技術(shù)路線,關(guān) 鍵 技 術(shù)： 細(xì)胞融合、組織培養(yǎng),三 植物新品種培育解析,文獻(xiàn)討論,子4,例子 ：屬間體細(xì)胞雜交,油菜屬于十字花科蕓薹屬,紫羅蘭屬于十字花科紫羅蘭屬,結(jié)果與討論,KM8P主要用于原生質(zhì)體培養(yǎng)，其特點是有機(jī)成分較復(fù) 雜，它包括了所有的單糖和維生素，呼吸代謝中的主要,有機(jī)酸。,雜種植物的鑒定,思考題,1.該論文的研究目的和意義是什么？ 22.作者如何優(yōu)化細(xì)胞