HBV感染培養(yǎng)人胎肝細胞后差異應答基因的初步分離和鑒定【摘要】目的：建立培養(yǎng)人胎肝細胞感染HBV后差異應答基因的消減文庫，并從中克隆鑒定出新的應答基因.方法：分別從HBV感染及未感染的胎肝細胞中提取總RNA，用SMARTPCR技術合成全長雙鏈cDNA，經(jīng)Rsa酶切后將感染細胞的cDNA分為兩組，分別銜接兩個不同的接頭，再與未感染細胞的cDNA進行兩輪抑制性雜交及兩輪抑制性PCR，將產(chǎn)物與T/A載體連接構建成消減cDNA文庫，并轉染大腸桿菌進行文庫擴增，挑取克隆進行篩選排除假陽性，再行序列分析，鑒定胎肝細胞感染HBV后的差異應答基因.結果：成功構建高效消減的HBV感染胎肝細胞cDNA文庫，得到158個白色的克隆，隨機選擇了128個克隆經(jīng)PCR擴增獲得含有明確單一目的片斷的克隆99個，長約100400bp，經(jīng)篩選后得到70個克隆，測序表明有16個差異表達的基因，其中可能的新基因有5個.結論：用抑制性消減雜交技術成功建立了HBV感染培養(yǎng)人胎肝細胞的消減cDNA文庫，為進一步大規(guī)模篩選HBV感染后的應答基因奠定了基礎，初步篩選出的新基因片斷為進一步研究宮內(nèi)感染的分子機制提供了依據(jù).【關鍵詞】HBV胎肝細胞雜交消減文庫克隆0引言慢性乙型肝炎易形成長期免疫耐受和復雜疾病譜，從HBsAg攜帶、慢性乙型肝炎到肝硬化、肝癌等，宿主對病毒的反應在發(fā)病機制中起重要作用.HBV與宿主相互作用不僅僅發(fā)生在細胞表面，很可能是一個非常復雜的相互作用網(wǎng)絡，HBV與宿主組織細胞之間這種特定的相互作用決定著病毒的存活與疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉歸，而這種相互作用反映在基因水平上則表現(xiàn)為病毒感染后宿主細胞基因表達譜的改變.完整的HBV感染肝細胞基因表達譜的研究有可能使我們更深入地認識HBV的分子致病機制，從而發(fā)現(xiàn)更多、更有效的抗病毒作用靶標.本研究我們用抑制性消減雜交技術克隆并鑒定HBV感染胎肝細胞后的應答基因，為闡明HBV宮內(nèi)感染的分子機制奠定基礎.1材料和方法1.1材料DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自Highclone公司，總RNA提取試劑盒購自Promega公司，SMARTPCRcDNA合成試劑盒、PCRSelectcDNA消減雜交試劑盒、Advantage2cDNAPCR試劑盒、PCRSelectDifferentialScreening試劑盒、NucleoTrapPCR純化試劑盒及尼龍膜、單面乳膠膠片均購自Clontech公司，32PdATP購自北京福瑞生物工程公司核酸研究室.1.2方法1.2.1HBV感染培養(yǎng)人胎肝細胞1-2用纖維連接素包被培養(yǎng)皿，將凍存的22wk人胎肝細胞復蘇，加入經(jīng)過純化的人血清來源的HBVDNA病毒，檢測培養(yǎng)上清中HBcAg和細胞中HBVcccDNA同時陽性的胎肝細胞做為感染組，同時培養(yǎng)的未感染細胞做為陰性對照組，收集細胞進行后續(xù)的實驗.1.2.2抑制性消減雜交用總RNA提取試劑盒抽提兩組細胞的總RNA,按說明書操作并進行定性定量分析.用SMARTPCRcDNA合成試劑盒合成長距離dscDNA，按說明書操作，用CHROMASPIN1000進行純化，按說明書操作.取36LRsaI消化緩沖液和1.5LRsaI酶（166.7nkat）；混勻后于37孵育3h.以NucleoTrapPCR純化試劑盒純化消化后的cDNA樣品，按說明書操作，經(jīng)乙醇沉淀后，溶于6.7L雙蒸水中，用紫外分光光度計定量，將濃度調(diào)節(jié)為300mg/L.以感染細胞為檢測方，以未感染細胞為驅動方，加T4DNA連接酶1L（6.66kat），分別與接頭1和2連接，16h反應過夜后進行接頭連接效率檢測.在鑒定連接效率滿意（>；25%）后，將連接有接頭1和2的檢測方dscDNA1.5L分別與1.5L驅動方dscDNA在68下雜交8h后，立即將經(jīng)過第一次消減雜交的兩組體系混合，另加新變性的驅動方cDNA1L，68雜交12h，稀釋（1200）.取1L稀釋后的第二次雜交后產(chǎn)物做模板，在50advantageTaq聚合酶作用下，以接頭1和2的外側序列分別為5及3引物，進行第1次PCR擴增；取第一次PCR產(chǎn)物3L，10倍稀釋后取1L做模板，以接頭1和2內(nèi)側序列分別為5及3的巢式PCR引物，進行第二次PCR擴增，并進行PCR產(chǎn)物消減效率檢測.1.2.3cDNA消減文庫的構建及PCR鑒定克隆取3LPCR產(chǎn)物及2L線性化質(zhì)粒載體，在1LT4DNA連接酶的作用下，14反應12h后，-20保存.取2L連接反應產(chǎn)物轉染200L感受態(tài)大腸桿菌，225r/min搖菌1.5h，取200L菌液種植于含氨芐青霉素的LB/Xgal/IPTG培養(yǎng)板上，37培育18h.計數(shù)培養(yǎng)板中直徑>；1mm清晰的白色及藍色菌落數(shù).隨機挑取128個白色菌落于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37搖菌過夜，取菌液1L做模板，以接頭1和2內(nèi)側序列分別為5及3的PCR引物，進行PCR擴增，選取含有明確單一目的片斷的克隆99個進行雜交篩選.1.2.4斑點雜交法進行差異篩選取鑒定過的含有單一明確目的片斷克隆的PCR反應液5L加5L0.6mol/LNaOH，混勻變性；取2L新鮮變性cDNA，分別點樣于尼龍膜上；0.5mol/LTrisCl（pH7.6）中和，雜交爐中70烤膜2h固定.預雜交1h后加入32P標記的4種探針：正向消減探針、檢測相未消減探針、反向消減探針、驅動相未消減探針進行雜交過夜，加入探針的cpm值為107.洗膜后進行放射自顯影，選取差異表達的克隆.用（-20）引物測序，由北京鼎國公司代理.2結果2.1總RNA的定性定量分析紫外分光光度計檢測檢測相和驅動相胎肝細胞總RNA量分別為500和150g/L，A260/280>；1.8，10g/L瓊脂糖凝膠電泳見RNA的28S和18S亞單位十分清晰，二者比例約為1.51，證實RNA質(zhì)優(yōu)量足.2.2SMARTPCR合成長距離dscDNA在10g/L瓊脂糖凝膠電泳上見dscDNA為0.58.0kb的彌漫性條帶.2.3RsaI酶切可見dscDNA由0.58.0kb的彌漫性條帶降解為約0.22.0kb的條帶（圖1），證實酶切十分成功.圖1DscDNA樣品經(jīng)RsaI消化前后20g/L瓊脂糖凝膠電泳2.4DscDNA兩端接頭連接效率檢測將連接有接頭1和2的兩組胎肝細胞dscDNA分別用G3PDH3,5引物及以G3PDH3引物和接頭上5引物進行PCR擴增.結果顯示兩組胎肝細胞接頭連接效率均>；50%,即50%以上dscDNA已與接頭連接.2.5兩次抑制性PCR后的電泳兩次抑制性PCR后分別取8L擴增產(chǎn)物在15g/L瓊脂糖凝膠電泳上可見正向和反向消減后的產(chǎn)物為約100600bp的彌漫性條帶,而未消減前的產(chǎn)物為較大分子質(zhì)量的彌漫性條帶（圖2）.圖2第2次PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳2.6cDNA消減文庫消減效率鑒定消減后PCR產(chǎn)物中G3PDH在28個循環(huán)后可見弱的條帶,而消減前G3PDH在18個循環(huán)后即可見明顯條帶（圖3），說明所構建的消減文庫具有很高的消減效率.18,23,28,32:PCR循環(huán)數(shù).圖3擴增看家基因G3PDH檢測消減效率凝膠電泳2.7PCR鑒定克隆中插入的目的片斷cDNA消減文庫包含158個白色克隆，克隆飽滿清晰.隨機挑取128個白色克隆，用巢式引物進行PCR擴增后，在20g/L瓊脂糖凝膠電泳上可見大小不等的插入片斷，約100400bp.2.8斑點雜交法進行差異篩選結果顯示：正向雜交陽性而反向雜交為陰性或正向雜交信號比反向雜交高5倍以上的克隆有70個（圖4）.2.9克隆的序列分析經(jīng)過差異篩選后的70個克隆測序表明插入cDNA片段大小為80400bp，部分基因為多拷貝，經(jīng)GenBank(/BLAST)檢索有11個cDNA片段和已知基因同源性為100%，其中6個功能已知，5個功能未知；5個cDNA片段和已知基因同源性為50%84%，可能代表新基因(表1).112,AI:樣品序號.圖4斑點雜交篩選目的基因表1和已知基因完全同源的cDNA片段3討論目前控制乙型肝炎流行的最主要手段是用乙型肝炎疫苗進行預防接種.隨著乙肝疫苗的普遍使用，乙型肝炎的水平傳播已基本得到控制，而宮內(nèi)感染，新生兒出生后用乙肝疫苗和特異性高效價免疫球蛋白不能阻斷其傳播，因而成為我們國家乙型肝炎傳播的主要途徑.近幾十年來，關于HBV宮內(nèi)感染發(fā)生率的報道較多，然而對其具體機制研究較少3-6.本研究選擇胎肝細胞作為研究HBV宿主相互作用的模型，用抑制性消減雜交技術鑒定HBV感染胎肝細胞后的差異應答基因譜變化，經(jīng)序列分析和同源性比較分析發(fā)現(xiàn)HBV感染胎肝細胞的過程可能涉及到物質(zhì)代謝和信號傳導過程.部分功能已知的差異應答基因包括編碼合成甲氨酰磷酸合成酶1(CPS1)的基因，該酶參與催化尿素循環(huán)的起始步驟7；編碼乳酸脫氫酶的基因，該酶為糖代謝不可缺少的酶類；編碼CD59抗原的基因，CD59是一種廣泛分布于組織細胞表面的GPI錨固糖蛋白，是一個重要的信號轉導分子8；編碼3甲基3羥基戊二酸輔酶A合成酶(HMGCoAs)的基因,該酶與膽固醇和酮體的代謝有關9；編碼核受體結合蛋白(NRBP)的基因，NRBP參與調(diào)節(jié)細胞的信號傳導通路及亞細胞內(nèi)的運輸10-11，據(jù)Chua等12報道，NRBP與登革熱病毒的NS3蛋白相互作用而參與登革熱病毒的致病過程.還有5個和已知基因100%同源的cDNA片段功能未知；另有5個cDNA片段和已知基因同源性為50%84%，可能代表新基因，我們正在進一步驗證.我們研究結果表明這些基因可能在HBV感染胎肝細胞的過程中構成一個相互作用的網(wǎng)絡系統(tǒng)，但是他們的具體作用機制，仍需大量的實驗證實，這也是我們今后要做的重點工作之一.【參考文獻】1王方,王宇明,湯勃,等.纖維結合素對HBV感染原代培養(yǎng)人胎肝細胞的影響J.解放軍醫(yī)學雜志,2004,29（5）:400-402.2王方,王宇明,湯勃,等.HBV體外感染培養(yǎng)人胎肝細胞的鑒定方法比較J.第三軍醫(yī)大學學報,2004,26（1）:74-77.3OhtoH,LinHH,KawanaT,etal.IntrauterinetransmissionofhepatitisBvirusiscloselyrelatedtoplacentalleakageJ.JMedVirol,1987,21(1):1-6.4XuDZ,YanYP,ZouS,etal.RoleofplacentaltissuesintheintrauterinetransmissionofhepatitisBvirusJ.AmJObstetGynecol,2001,185(4):981-987.5XuDZ,YanYP,ChoiBC,etal.RiskfactorsandmechanismoftransplacentaltransmissionofhepatitisBvirus:AcasecontrolstudyJ.JMedVirol,2002,67(1):20-26.6劉穎琳，鄺健全，張睿，等.胎兒感染乙型肝炎病毒的臨床研究J.中華婦產(chǎn)科雜志,2002,37(8):465-468.7K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