銅對(duì)wnt6基因表達(dá)及鵝羽絨生產(chǎn)性能影響的試驗(yàn)方法趙明(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院長(zhǎng)春吉林130118)摘要本文以吉林白鵝為研究對(duì)象，飼喂不同添加量銅日糧，結(jié)合Wnt6基因表達(dá)測(cè)定試探討銅對(duì)鵝羽絨的促生長(zhǎng)作用，重點(diǎn)介紹試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)方法，并提出試驗(yàn)難點(diǎn)和試驗(yàn)預(yù)期。關(guān)鍵詞銅羽絨生產(chǎn)Wnt6基因表達(dá)試驗(yàn)方法前言銅是人類歷史上最早使用的金屬，銅大量存在于各種巖石和礦物中，自然界中銅以CuO、Cu+、Cu2+二種氧化態(tài)形式互相轉(zhuǎn)化。在生物體中，銅是最基本的微量營(yíng)養(yǎng)元素之一，大量研究表明1，2，銅至少存在于30多種酶中，銅通過多種酶參與機(jī)體的代謝、氧化磷酸化、自由基解毒、黑色素合成等過程，并能維持組織細(xì)胞的穩(wěn)定性。在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育，免疫功能等方面有重要作用3，4。自20世紀(jì)80年代以來，銅一直作為一種有效的促生長(zhǎng)劑在畜禽養(yǎng)殖中被廣泛利用，高劑量銅己被認(rèn)為是一種高效、廉價(jià)、使用方便的促生長(zhǎng)劑。然而，不少的飼料添加劑廠家、畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)者為了追求效益，在飼料中盲目添加高銅，造成了畜禽銅中毒、亞臨床中毒的發(fā)生。2004年1月，歐盟法規(guī)限制了飼料中銅的添加量標(biāo)準(zhǔn)，鵝最大耐受量100mg/kg5,6。鵝羽絨品質(zhì)和產(chǎn)量是一類非常重要的經(jīng)濟(jì)性狀，在性狀的形成過程中遺傳因素發(fā)揮著主要作用，但目前關(guān)于鵝羽絨性狀形成的遺傳調(diào)控機(jī)理和分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究尚不多見。近幾年，在哺乳動(dòng)物、人類和雞方面的研究表明Wnt/-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑是調(diào)控毛囊形態(tài)發(fā)生和生長(zhǎng)的核心通路，它所涉及的有關(guān)因子的基因變異及其表達(dá)調(diào)控對(duì)絨毛的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的影響。然而，有些調(diào)控通路及其相關(guān)基因的分子生物學(xué)作用和調(diào)節(jié)機(jī)制仍然不清楚，而且有些信號(hào)分子在哺乳動(dòng)物與禽類之間存在著較大差異7，8。因此，筆者依據(jù)自己的碩士論文，從銅的促羽絨生長(zhǎng)和19種Wnt基因9選取Wnt6做基因表達(dá)試驗(yàn)，試探討不同日糧銅添加量對(duì)鵝羽絨的促生長(zhǎng)作用，以供有關(guān)專業(yè)同學(xué)參考，下面介紹實(shí)驗(yàn)方法。1.材料與方法1.1試驗(yàn)動(dòng)物從100只2025周齡吉林白鵝中隨機(jī)選取24只，分為4組，每組6只，分別編號(hào)，稱體重，采用翻肛鑒別性別。1.2技術(shù)路線注示：CK（對(duì)照組）：試驗(yàn)日糧0mg/kg銅添加量。T1（試驗(yàn)一組）：試驗(yàn)日20mg/kg銅添加量。T2（試驗(yàn)二組）：試驗(yàn)日50mg/kg銅添加量。T3（試驗(yàn)三組）：試驗(yàn)日80mg/kg銅添加量。附：不同Cu添加量日糧配置方法先根據(jù)整個(gè)試驗(yàn)期計(jì)算好基礎(chǔ)日糧的總體飼喂量，根據(jù)下圖配方配好基礎(chǔ)日糧，再根據(jù)各試驗(yàn)組不同的Cu添加量計(jì)算出每組試驗(yàn)日糧的CuSO4.5H2O需要量，研磨成極細(xì)的粉末后采用逐級(jí)預(yù)混的方法配置，最后用混料機(jī)混合10分鐘以上，以保證Cu充分混勻，防止部分飼料中Cu含量超標(biāo)，引起銅中毒。如果是夏天可以采用噴霧法配置，這樣保證銅混合充分均勻，但要及時(shí)對(duì)試驗(yàn)日糧進(jìn)行干燥處理，防止其受潮霉變。1.3基礎(chǔ)日糧配方1.4飼養(yǎng)試驗(yàn)飼喂：第一次上料給水，8：00，只鵝給料量100150g；第二次上料給水，12：00，只鵝給料量100150g；第三次上料給水：16：00，只鵝給料量150200g。要求：（1）每天早晨上料前要清除前一天剩余飼料，并稱重。（2）每天早晨要清洗飲水器，然后一天三次加注凈水。（3）打掃衛(wèi)生、消毒：每天早晨飼喂前清除舍內(nèi)糞便，清除的糞便堆積到指定地點(diǎn)，鵝舍每周消毒12次。（4）記錄：試驗(yàn)期間（包括試驗(yàn)準(zhǔn)備期、預(yù)試期、試驗(yàn)期、試驗(yàn)后處理）。1.5試驗(yàn)方法1.5.1拔毛部位劃分背部，包括頸部以后，翅膀與骼骨聯(lián)線以上的部位；胸部，在背部以下，后面以龍骨劍突為界；腹部，龍骨劍突以后，骸骨與坐骨聯(lián)線以下的部位10。1.5.2拔毛和采血1.5.2.1預(yù)試期(15天)結(jié)束后第一次拔毛，測(cè)量羽毛相關(guān)數(shù)據(jù)。試驗(yàn)期(45天)結(jié)束后第二次拔毛，測(cè)量羽毛相關(guān)數(shù)據(jù)。1.5.2.2羽絨生長(zhǎng)性狀的測(cè)量方法測(cè)量絨朵長(zhǎng)：用千分卜尺量取絨朵根部至尖部長(zhǎng)度。測(cè)量絨朵羽小枝的細(xì)度：將絨朵制成游離纖維玻片標(biāo)本，用顯微纖維投影儀測(cè)每根羽枝的直徑，個(gè)個(gè)體每個(gè)部位測(cè)定50根羽小絲。測(cè)量千朵重：在每個(gè)部位隨機(jī)抽取1000個(gè)絨朵用力分之電子天平稱重。測(cè)定自然含水量：自然含水量(%)=原毛重量(g)-絕對(duì)干燥羽毛重量(g)/原毛重量(g)100測(cè)定耗氧指數(shù)：耗氧指數(shù)(氧的毫克數(shù)/100克試樣)=8100(A-B)N。測(cè)定含脂率：含脂率(%)=(抽提后+包重)-(抽提前十包重)/試樣重。附：鵝活體拔毛的方法：先給要拔絨的鵝用10ml注射器灌喂20ml高度白酒，觀察3-5分鐘后，等鵝反應(yīng)遲緩后再進(jìn)行拔絨，可以使鵝比較老實(shí)便于拔絨，酒精也可以使毛孔擴(kuò)張方便拔絨，防止拔斷絨毛，保存絨朵完整。1.5.2.3采血：分離血清，檢測(cè)不同銅含量對(duì)血液乳酸脫氫酶(LDH)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、銅藍(lán)蛋(CP)、谷朧甘膚過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)活性的影響11。采集皮膚、提取毛囊RNA：分析不同劑量的銅對(duì)wnt6基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。1.5.3實(shí)驗(yàn)室線圖采樣提取RNAOD值及濃度調(diào)濃度值（按最小濃度）翻轉(zhuǎn)成CDNA設(shè)計(jì)引物普通PCR摸索條件上機(jī)（熒光定量PCR）數(shù)據(jù)（分析）附：基因表達(dá)相關(guān)試驗(yàn)采用試劑盒方法，對(duì)照試劑盒說明書按步驟進(jìn)行即可。1.5.4資料處理對(duì)小同部位及各周齡絨朵長(zhǎng)、羽小枝細(xì)度、千朵重進(jìn)行差異顯著性比較。全部數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析由SPSS11.0軟件的One一二yANOVA程序完成。2.試驗(yàn)的難點(diǎn)和預(yù)期2.1難點(diǎn)(1)添加多種維生素復(fù)合添加劑可以減少試驗(yàn)鵝分組、飼喂不同日糧和第一次拔絨后的應(yīng)激反應(yīng)。(2)在低溫條件下要防止拔絨時(shí)傷到皮膚，使鵝凍傷，要保留羽毛。(3)提取RNA時(shí)要防止變性。2.2預(yù)期(1)在防止畜禽產(chǎn)品重金屬Cu殘留超過100mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，討論試驗(yàn)組鵝羽絨促生長(zhǎng)最佳添加量是試驗(yàn)設(shè)計(jì)的哪個(gè)梯度，更具體的銅添加量有待進(jìn)一步研究。(2)通過基因表達(dá)試驗(yàn)測(cè)試wnt6是否是wnt基因組控制鵝羽絨生長(zhǎng)的主控基因。Wnt6調(diào)節(jié)鵝近軸外胚層體節(jié)的發(fā)育和細(xì)胞的組織，是分化完成的關(guān)鍵，鳥類胚發(fā)育過程中，Wnt6誘導(dǎo)神經(jīng)脊的形成，如Wnt信號(hào)受到抑制則擾亂神經(jīng)脊的形成。在鵝的Wnt信號(hào)家族中，共存在多少種Wnt分子，其中哪幾種Wnt分子參與了羽絨發(fā)育調(diào)控過程，相應(yīng)Wnt分子的激活和抑制因子如何，該途徑下游還與哪些調(diào)控因子有關(guān)等，有待于進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)1BonhamM，O，connorJM，HanniganBM，eta1.TheimmunesystemasaphysiologicalindicatorofmarginalcopperstatusJ.BritishJournalofNutrition.2002，87(3):393-403.2柴春彥，石發(fā)慶，劉國(guó)艷.搖擺病奶牛體內(nèi)銅狀態(tài)及其與NO水平的關(guān)系J.黑龍江畜牧獸醫(yī).2001，7，1-3.3StabelJR，SpearsJW.EffectofcopperonimmuneFunctionanddiseaseresistanceJ.AdvancesExperimentalMedicineandBiology.1989，258(2):243-252.4PercivalSS.CopperandimmunityJ.AmericanJournalOfClinicalNutrition.1998，67(9):1064-1068.5丁伯良.動(dòng)物中毒病理學(xué)M.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001，189-190.6鄧科敏.實(shí)驗(yàn)性鵝銅中毒機(jī)理研究D.西南大學(xué)，2008.7徐日福，吳偉，高光.鵝羽絨發(fā)生發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理研究進(jìn)展.經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)，第10卷，第2期.8徐日福，吳偉，徐慧.鵝羽絨生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)理研究進(jìn)展.中國(guó)家禽，2006年，第28卷，第20期.9向陽，