摘要 馬鈴薯( s o l a r i u mt u b e r o s u ml ) 是繼小麥、玉米、水稻之后的世界第四大作物，在世界的食 品安全體系中具有重要的作用。由青枯病菌r a l s t o n i a s o l a n a c e a r u m 引起的馬鈴薯青枯病是僅次于 馬鈴薯晚疫病的世界性病害，目前尚沒(méi)有行之有效的化學(xué)藥劑防治辦法，嚴(yán)重影響了馬鈴薯的生 產(chǎn)。培育抗病品種已成為防治馬鈴薯青枯病的根本手段。長(zhǎng)期以來(lái)人們對(duì)馬鈴薯青枯病的研究和 探討主要集中在病菌的病理學(xué)機(jī)制、分類(lèi)學(xué)、流行病學(xué)等方面，而在馬鈴薯本身的抗病遺傳特性、 馬鈴薯青枯病抗性相關(guān)基因的種類(lèi)、數(shù)量及其表達(dá)調(diào)控途徑等方面還不清楚。本研究旨在通過(guò)馬 鈴薯青枯病抗性相關(guān)基因的分離和分析，初步揭示參與青枯病抗性的基岡種類(lèi)與數(shù)量，為進(jìn)一步 深入開(kāi)展青枯病的抗病機(jī)制研究及利用抗性資源進(jìn)行抗病品種選育奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如 下： 1 建立了快速可靠的馬鈴薯抗青枯病鑒定新方法。并篩選出了1 3 份抗或高抗青枯病和高感 青桔病的二倍體材料。采用傳統(tǒng)方法和改進(jìn)方法對(duì)馬鈴薯二倍體c e 和e d 群體、番茄抗病和感 病品系進(jìn)行了青枯病抗性鑒定和評(píng)價(jià)，建立了更加簡(jiǎn)便快速、經(jīng)濟(jì)和可重復(fù)的病菌鑒定新方法一 莖枝菌液共培養(yǎng)法，該方法對(duì)于茄科作物的種質(zhì)資源抗病性評(píng)價(jià)和篩選，特別是對(duì)于病菌誘導(dǎo)產(chǎn) 生抗性的抗( 感) 病植株的快速鑒定及其幼苗的先期快速篩選具有重要意義。同時(shí)利用該方法篩 選出了6 份抗或高抗青枯病材料和7 份高感青枯病材料( 見(jiàn)表2 4 ) ，其中6 個(gè)材料( 如商抗青桔 病基因型e d l 3 、高感青枯病基因型e d 2 5 等) 已被用于親本構(gòu)建作圖群體，為今后開(kāi)展馬鈴薯 的抗病遺傳研究奠定了基礎(chǔ)。 2 建立了富集差異表達(dá)基因的s s h 文庫(kù)并獲得了4 4 個(gè)病菌侵染早期馬鈴薯抗青枯病相關(guān)基 因。以抗青枯病二倍體基因型e d l 3 為材料，青枯病菌小種3 號(hào)p 0 4 1 為供試菌株，利用抑制差減雜 交( s s h ) 和微陣列雜交篩選技術(shù)相結(jié)合，獲得了1 2 3 個(gè)差異表達(dá)的非重復(fù)的早期抗病相關(guān)基因 e s t 片段，其中9 9 i ( 8 0 ) e s t 可找到與其具有較高同源性的序列( o e - 值 l o ”) ，s 個(gè)( 7 ) 無(wú)同源序列。這些無(wú)同源序列或具有較低同 源性的序列可能代表新基因。在1 2 3 個(gè)差異表達(dá)的e s t 中，除2 2 的功能未知或已知功能而朱分類(lèi) 和8 的無(wú)同源序列外，其余7 0 的e s t 分屬于初級(jí)代謝、能量代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、調(diào)控、蛋白合成 膨飾，加工、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)、抗病防御、轉(zhuǎn)錄相關(guān)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命過(guò)程。 在獲得的1 2 3 個(gè)差異表達(dá)e s t 中，至少有4 4 個(gè)( 約3 5 8 ) 參與了馬鈴薯的抗青枯病反應(yīng)。這 些e s t 對(duì)應(yīng)的基因涉及到信號(hào)識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、過(guò)敏( h r ) 反應(yīng)、系統(tǒng)獲得性抗性( s a r ) 、 細(xì)胞自救與抗病防御等抗病反應(yīng)的基本過(guò)程。這些抗病相關(guān)基因中大部分與已知基因高度同源， 預(yù)示著這些基因較為保守，在不同植物種的抗病反應(yīng)中可能具有重要的作用。 3 構(gòu)建了一個(gè)富集青枯病抗性相關(guān)基因的s m a r te d n a 文庫(kù)。以青枯病菌小種3 號(hào)( p 0 4 1 ) 誘導(dǎo)2 4h 1 1 4 8h 的馬鈴薯高抗青枯病二倍體基因型e d l 3 的葉片為材料，利用s m a r t 和l d p c r 技 術(shù)相結(jié)合構(gòu)建了一個(gè)富集青枯病抗性相關(guān)基因的全長(zhǎng)c d n a 文庫(kù)，為進(jìn)行重要基因全長(zhǎng)c d n a 的克 隆奠定了基礎(chǔ)。所建文庫(kù)的原始文庫(kù)和擴(kuò)增文庫(kù)滴度分別為4 4 x 1 0 6 和1 8 ) 1 0 ”p f u m l ，重組率為 9 6 ，插入片段大小分布在4 0 0 - 1 8 0 0b p ，平均大小為7 0 0 - 1 0 0 0b p 。 4 獲得了三個(gè)基因的全長(zhǎng)c d n a 、四個(gè)基因的r a c e 產(chǎn)物及它們的誘導(dǎo)表達(dá)模式。利用r a c e 與l d p c r 方法和c d n a 文庫(kù)相結(jié)合，快速獲得了三個(gè)具有完整開(kāi)放閱讀框架基因的全長(zhǎng)c d n a ( 受用、s t p m e i 和s t d n a j ) 和四個(gè)抗病相關(guān)基因( z j j 、l 7 7 l 1 8 1 和耶6 2 ) c d n a 的5 和3 r a c e 的p c r 產(chǎn)物，同時(shí)研究了這些基因的誘導(dǎo)表達(dá)。具體為： s t p i 編碼1 1 6 個(gè)氨基酸，與馬鈴薯蛋白酶抑制子i 前體c d n a 有較高的同源性( 核苷酸和 氨基酸序列的同源性分別為8 9 和7 4 ) 。該基因受青枯病菌的誘導(dǎo)和j a 的調(diào)節(jié)，均為上調(diào)。 推測(cè)s t p l 基因是馬鈴薯蛋白酶抑制子基因家族的重要成員，在馬鈴薯的抗青枯病的反應(yīng)中可能具 有重要作用。該基因已在g e n b a n k 注冊(cè)，序列號(hào)為d q 8 2 2 9 9 4 。 s t p m e i 編碼1 9 8 個(gè)氨基酸，與煙草果膠甲脂酶抑制子基因具有較高的同源性( 核苷酸和氨 基酸序列的同源性分別為8 5 和7 8 ) 。s t p m e i 基因的表達(dá)受青枯病菌侵染的抑制，可能與病 菌侵染早期促使果膠甲脂酶( p m e ) 表現(xiàn)活性，加固細(xì)胞壁有關(guān)；但該基因又受j a 的誘導(dǎo)可能 與病菌侵染后期細(xì)胞肇的擴(kuò)展和新細(xì)胞壁的建立有關(guān)。該基因已在g e n b a n k 注冊(cè)，序列號(hào)為 d q 8 2 2 9 9 3 。 s t d n a j f f i 碼1 7 7 個(gè)氨基酸，與擬南芥d n a j d l k e 基因的部分核苷酸具有8 4 的一致性，與其編碼 的氨基酸序列具有5 9 的一致性。該基因受青枯病菌的誘導(dǎo)，也受j a 的調(diào)節(jié)。但j a 誘導(dǎo)后其上調(diào) 表達(dá)明顯比青桔病菌誘導(dǎo)提前，且其維持高表達(dá)水平的時(shí)間也明顯縮短。該基因已在c , e a b a n k 注 冊(cè)，序列號(hào)為d q 8 8 5 3 6 0 。 l s i ( m e t h y l - c p g - b i n d i n g d o m a i n - e n n t a i n i n g p r o t e i n ) 和l 7 7 ( p u t a t i v e l y e n c o d i n gr e c e p t o r - l i k e k i n a s er h g l ) 均受青枯病菌的誘導(dǎo)，但它們的受誘導(dǎo)速度不同。l 5 j 在6 - 1 2 d 、時(shí)內(nèi)表達(dá)最即達(dá)到 最高；l 7 7 約需4 8 小時(shí)才可達(dá)到最高表達(dá)量。這兩個(gè)基岡均不受j a 的調(diào)節(jié)。 l 1 8 1 ( p h o s p h a t a 2 c ) 同時(shí)存在于抗病基因瓔和感病基因型中，在抗病基因型e d t 3 中受青 枯病菌的誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)，與此相反卻受j a 的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；在感病基因型e d 2 5 中，該基因不受j a 調(diào)節(jié)。預(yù)示著對(duì)于l 1 8 1 而言，病菌處理和j a 刺激可能采用不同的調(diào)節(jié)途徑，并且該基因在抗病材 料中因受誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)而參與抗病反應(yīng)。 婦6 2 ( p r o t e i n k i n a s e p t i l ) 同時(shí)受青枯病菌的誘導(dǎo)和j a 的調(diào)節(jié)，其表達(dá)模式與s t d n a j 相似， 均為上調(diào)表達(dá)。在處理2 4 小時(shí)之前該基因的m r n a 積累暈即達(dá)到最高，并且l 3 6 2 在j a 誘導(dǎo)后 其上調(diào)表達(dá)明顯比青枯病菌的誘導(dǎo)提前。p t i l 基因?yàn)閜 t o 基岡的下游基因，參與番茄的抗病反應(yīng)， 推測(cè)1 3 6 2 也可能參與了馬鈴薯的抗青枯病反應(yīng)。 總之本研究不僅為我們提供了一些有益的數(shù)據(jù)( e s t s ) ，還有助于提高我們對(duì)馬鈴薯與青枯 病菌互作本質(zhì)的認(rèn)識(shí)，并且有些e s t 將可能被轉(zhuǎn)化為分子標(biāo)記進(jìn)行馬鈴薯抗青枯病的標(biāo)記輔助育 種。 關(guān)鍵詞：馬鈴薯青枯病，e d n a 文庫(kù)，抗病相關(guān)基因，基因表達(dá) a b s t r a c t p o t a t o ( s o l a n u m t u b e r o s u m l ) a s o o e o f t o p f o u r i m p o r t a n t c r o p s i n t h e w o r l da f t e r w h e a t , t o ma n d r i c e 。p l a y sm o r ea n dm o r ei m p o r t a n tr o l e i nf o o ds e c u d t y b a c t e r i a lw i l tc a u s e db yr a l s t o n i a s o l a n a c e a r u m ( j 婦) i so n eo fd e v a s t a t i n gd i s e a s e so fp o t a t o a sas o i l - b o r n ed i s e a s e , t h e r ea r en oa n y e f f i c i e n tc h e m i c a lm e t h o d st oc o n t r o li t p r o b a b l y ，t h em o s tp r o m i s i n gw a yi st od e v e i q ，r e s i s t a n t c u l t i v a r s d u r i n gt h ep a s ty e a r s ，r e s e a r c hm a i n l yf o c u s e do np a t h o l o g y ，t a x o n o m ya n de p i d e m i o l o g yo f t h ep a t h o g e n t h eg e n e t i c so fh o s t r e s i s t a n c ea n dt h em e c h a n i s mo fp o t a t o - r si n t e r a c t i o na l o n gw i t h r e g u l a t i o no fg e n ee x p r e s s i o nm s t i l lp o o r l yu n d e r s t o o d i nt h i ss m d y g e n ee x p r e s s i o no ft h e i n c o m p a t i b l ei n t e q a c t i e no fp o m t o - r aw a ss u r v e y e d t h em a i nr e s u l t so ft h i si n v e s t i g a t i o na r ea s f o o w s ： 1 af l e wi n o c u l a t i o nm e t h o d , n a m e d 雒 s t e mc u l t u r ei nb a c t e r i a ls o l u t i o nm e t h o d w a s e s t a b l i s h e d t w oc o n v e n t i o n a lm e t h o d sa n dt h en e wm e t h o dw e u s e dt oe v a l u a t et h er e s i s t a n c ea g a i n s t 西i nt w op o t a t op o p u l a t i o n s 勰w e l l 勰i ns e v e nt o m a t of i n e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h en e wm e t h o di s m o r ee c o n o m i ca n dr e p r o d u c i b l e ，s i m p l e ra n de a s i e rt oo p e r a t et h a nt h et w oc o n v e n t i o n a lm e t h o d s s i x r s - r e s i s t a n ta n ds e v e nr s s u s c e p t i b l ep o t a t og e n o t y p e sw e r eo b t a i n e d s i xg e n o t y p o s ( e g t h em o s t r e s i s t a n tc l o n ee d l 3a n ds u s c e p t i b l ec l o n ee d 2 5 ) h a v eb e e nu s e da sp a r e n t st oe n n s 仃i l c tm a p p i n g p o p u l a t i o n s w h i c ha r eu s e f u lt 0s t u d yt h ei n h e r i t a n c eo f r s - r e s i s t a n c ei nf u t u r e 2 as u b t t a c t i v ee d n al i b r a r yo fr s - r e s i s t a n tp o t a t oa t e a r l y s t a g ew a sc o n s t r u c t e du s i n g s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ( s s h ) a n dm a c r o a r r a y s t o t a l l y1 2 3d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e d u n i - g e n ef r a g m e n t sw e r ei d e n t i f i e d n i n t y - n i n ee s t s ( 8 0 ) h a v eh i g hs i m i l a r i t yw i t hg e n e s ( f r a g m e n t s ) i nt h en c b id a t a b a s e ( o ( e - v a l u e 1 0 1 0 ) ，e i g h t ( 8 ) h a v en om a t c h t h eg e n e sw i t hl o wi d e n t i t ya n dn om a t c ht ok n o w ng e n e sm a yr e p r e s e n tn o v e lg e n e s s e v e n t yp e r c e n to f1 2 3e s t sw e r er e l a t e dt ot h ep r i m a r ym e t a b o l i s m , e n e r g y ，c e l ls h a e t o r e ，g e n e r e g u l a t i o n ，p r o t e i ns y n t h e s i s ，p r o t e i nm o d i f i c a t i o na n dp r o c e s s i n g ，t r a n s p o r t e r s ，d i s e a s ed e f e n c e , t r a n s c r i p t i o na n ds i g n a lt r a n s d u c t i o n e t c w h i l et h er e m a i n i n g3 0 w e f u n c t i o nu n k n o w no r u n c l a s s i f i e d f o u r t y - f o u re s t so u to ft h e 1 2 3 d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e df r a g m e n t s w c l ec o n s i d e r e d r s - r e s i s t a n c er e l a t e de s t sa n dw e r ec l a s s i f i e di n t os i xg r o u p s ，w h i c ha r ci n v o l v e di nb a s a ld i s e a s e r e s i s t a n c ep r o c e s s ，i n c l u d i n gs i g n a lr e c o g n a t i o n ，s i g n a lt r a n s u d a t i o n ，h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e ，s y s t e m i c a c q u i r e dr e s i s t a n c e 。c e l lr e v u ea n dp r o t e c t i o n ，a n dr e s i s t a n c eo rd e f e n s e ，c l c m o s to ft h e s ee s t ss h a r e d h i g hs i m i l a r i t yw i t hk n o w ng e n e s i n d i c a t i n gt h a tt h e s eg e n e sm a yb ec o n s e r v a t i v ei nf u c t i o na n dp l a y i m p o r t a n tr o l e si nd i s e a s er e s i s t a n c ei nd i f f e r e n tp l a n ts p e c i e s 3 af u l l - l e n g t he d n al i b r a r yo fr s - r e s i s t a n tp o t a t ow a sc o n s t r u c t e db a s e do ns m a r t ( s w i t c h i n g i n c h a n i s ma t5 。e n do fr n at r a n s c r i p t ) a n dl d - p c r ( 1 0 n gd i s t a n c ep c r ) t e c h n i q u e s 。t h et i t e r so f u n a m p l i f i e d a n da m p l i f i e d e d n a l i b r a r y w e r e 4 4 x 1 0 6 p f u m l a n d1 8 x 1 0 1 0 p f a t r a lr e s p e c t i v e l y t h er a t e o fr e c o m b i n a t i o nw a s9 6 t h el e n g t ho fi n s e r t e df r a g m e n t sw a s4 0 0 - 1 8 0 0b pa n dt h ea v e m g es i z ew a s 7 0 0 - 1 0 0 0b p 4 t h r e ef u l l l e n g t hc d n a s ( s t p ls t p m e ia n ds t d n a j ) w i t hc o m p l e t e do p e nr e a d i n gf r a m e ( o r d w e l ec l o n e df r o mr s - r e s i s t a mp o t a t ol e a v e su s i n gr a c em e t h o dc o m b i n e dw i t hl d p e ra n de d n a l i b r a r y 觴w e l l f o u ro t h e rg e n e s r a c ep c rp 刪u c t s e x p r e s s i o np a t t e r n so ft h e s eg e n e sw e r ea l s o c o n f w m e du s i n gn o r t h e r nb l o ta n ds e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c r s t p ig e n ee n c o d e sap r o t e i no f11 6a m i n oa c i d s ，a n ds h a r e s8 9 i d e n t i t yw i t hp o t a t op r o t e i n a s e i n h i b i t o rip r e c n r g o ri nn u c l e o t i d ea n d7 4 i na n l i n oa c i d s t p ig e n ew a si n d u c e db y 船a n da l s o r e g u l a t e db yj a s t p ig e n ei so n eo ft h em e m b e r si np o t a t op m t e i n a s oi n h i b i t o rg e n ef a m i l y ，a n dm a y p 王a ya ni m p o r t a n tr o l ei np o t a t o sr e s i s t a n c et or s t h i sg e n eh a sb e e nr e g i s t e r e di ng a n b a a ka n dt h e a c c e s s i o nn u m b e ri sd q 8 2 2 9 9 4 s t p m e ig e n ee n c o d e sap r o t e i no f1 9 8a m i n oa c i d s ，a n ds h a r e s8 5 i d e n t i t yw i t ht o b a c c o i n v e r t a s e p e e t i nm e t h y l e s t e r a s ei n h i b i t o ri nn u c l e n t i d ea n d7 8 i na m i n oa c i d t h ee x p r e s s i o no f s t p m e lw a si n h i b i t e db yr s ，w h i c hm i g h tr e s u l ti ni m p r o v i n gt h ea c t i v i t yo fp e c t i nm e t h y l e s t e r a s e f p m e ) a n ds t i f f e n i n gt h ec e l lw a l li ne a r l ys t a g ep o s tr s - i n v a s i o n w h e r e a ss t p m e ig e n ew a s u p - r e g u l a t e db yj a ，w h i c hm a yh er e l a t e dt oc e l lw a l le x t e n s i o na n db u i l d i n gu pi nl a t e rs t a g e t h i sg e n e h a sb e e nr e g i s t e r e di ng e n b a n ka n dt h ea c c e s s i o nn u m b e ri sd q 8 2 2 9 9 3 s t d n a jg e n ee n c o d e sap r o t e i no f1 7 7a m i n oa c i d s ，a n ds h a r e s8 4 i d e n t i t yw i t hd n a j 1 i k e2 0o f a r a b i d o p s i st h a l i a n ai nn u c l e o t i d ea n d5 9 i na m i n oa c i d s t d n a jg e n ew a si n d u c e db yr sa n da l s o r e g u l a t e db yj a 。t h i sg e n ew a si n d u c e de a r l i e ra n di t sh i g he x p r e s s i o nl e v e lp e r s i s t i n gt i m ew a s o b v i o u s l ys h o r t e rt r e a t e dw i t hj at h a nt h a ti n f e c t e db yr s s t d n a jg e n eh a sb e e nr e g i s t e r e di ng e n b a n k a n dt h ea c c e s s i o nn u m b e ri sd q 8 8 5 3 6 0 l 5 1 ( m e t h y l - c p g b i n d i n gd o m a i n - c o n t a i n i n gp r o t e i n ) a n dl 7 7 ( e n c o d i n gr e c e p t o r - l i k ek i n a s e r h g i ) h a v ed i f f e r e n tr s - i n d u c e de x p r e s s i o np a t t e r n s l 5 1r e a c h e dt h eh i g h e s te x p r e s s i o nl e v e li n6 - 1 2 h p i w h i l el 7 7d i dg oi n4 8 hp i t h e s et w og e n e sw e r en o tr e g u l a t e db yj a l 1 8 1 ( p h o s p h a t a 2 c ) e x i s t sb o t h i nr e s i s t a n ta n ds u s c e p t i b l eg e n o t y p e s t h i sg e a ew a s d o w n - r e g u l a t e db yr si nr e s i s t a n tg e n o t y p e ，w h e r e a su p - r e g u l a t e db yj a ，b u tw 鷂n o tr e g u l a t e db ，i ai n s u s c e p t i b l eg e n o t y p e ，i n d i c a t i n gt h a tr si n v a s i o nm a yh a v ed i f f e r e n ts i g n a lt r a n s d u e t i o np a t h w a yw i t h j a - t r e a t m a n tf o rt h i sg e n ea n dt h i sg e n es h o wi t sf u n c t i o nd u et os l r e s si n d u c t i o n 1 2 1 6 2 ( p r o t e i nk i n a s ep t i l ) w a su p - r e g u l a t e db yr sa n dj a ，a n di t se x p r e s s i o np a t t e r nw a ss i m i l a rt o t h a to fs t d n a 2 t h em r n aa c c u m u l a t i o no fl 3 6 2r e a c h e dt h eh i g h e s tl e v e lb e f o r e2 4 hp o s tt r e a t e db y r sa n dj a a l s ot h i sg e n ew a si n d u c e de a r l i e rt r e a t e dw i t hj at h a nt h a ti n f e c t e db yr s p t i lg e n ei s i v l o c a t e dd o w n s t r e a mo f p r oa n di n v o l v e di nd i s e a s er e s i s t a n c ei nt o m a t o s u g g e s t i n gt h a tl ；6 2m a ya l s o p l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nr s - r e s i s t n c er e a c t i o ni np o t a t o t h i si n v e s t i g a t i o n ，a l t h o u g l if a rf r o mb e i n ge x h a u s t i v e ，h a sp r o v i d e dl l e wm o l e c u l a ri n s i g h t si n t o t h en a t l l r eo f f i c ep o t a t o - r si n t e r a c t i o ni np o t a t ol e a v e s t h ee s t sr e p o r t e dh e r em a yp r o v i d eu s e f u ld a t a f o ri m p r o v i n go u rk n o w l e d g eo fp o t a t or e s i s t a n c et op a t h o g e n s ，a n dm a ya l s ob eu s e da sc a n d i d a t e g e n e sf o rd e v e l o p i n gm o l e c u l a rm a x 蛔 8t oa s s i s tp o t a t og e n e t i cb r e e d i n gi nf u t u r e k e yw o r d s ：p o t a t ob a c t c r i a lw i l t , e d n al i b r a r y ，r e s i s t a n c e - r e l a t e dg e n e ，g e n ee x p r e s s i o n v 縮略語(yǔ) v i 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除 了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不 包含為獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志 對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。 研究生簽名： 李于梧 時(shí)間： 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國(guó)農(nóng)業(yè)科 學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮 印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不 同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 ( 保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議) 研究生簽名：垂7 稻 名：尾舌辦 時(shí)間：步一歹年礦月l o 日 時(shí)間：渺6 年d 月1 3 ：日 第一章前言 1 1 課題的提出 馬鈴薯主要起源于南美洲安第斯山區(qū)，散見(jiàn)于中美洲加勒比地區(qū)、墨西哥及美國(guó)南部地區(qū)， 目前發(fā)現(xiàn)的野生種和栽培種超過(guò)2 2 0 個(gè)，新“種”的發(fā)掘和鑒定工作還在繼續(xù)進(jìn)行中( h a w k e s ， 1 9 9 0 ) 。用于生產(chǎn)的僅8 個(gè)種，除普通栽培種( & t u b e r o s u ms s p t u b e r o s u r a ) 在世界各地廣泛種植 外，其他種限于安第斯山區(qū)( h u a m m 。1 9 8 6 ) ，栽培馬鈴薯1 7 世紀(jì)引入中國(guó)( 佟屏誣等，1 9 9 1 ) 。 馬鈴薯以其適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)全面、適于加工等特點(diǎn)，在世界各地迅速推廣種植，已 成為繼小麥、玉米、水稻之后的世界第四大作物，種植面積達(dá)到1 8 6 5 2 4 萬(wàn)公頃，年總產(chǎn)量為 3 2 1 9 7 4 2 萬(wàn)噸，平均單產(chǎn)為1 7 2 6 噸，公頃( f 舳，2 0 0 5 ) 。中國(guó)馬鈴薯栽培面積最大達(dá)4 4 0 1 5 萬(wàn)公 頃，占世界的2 3 6 年總產(chǎn)量為7 3 7 7 6 5 萬(wàn)噸，為世界的2 2 9 1 ；平均單產(chǎn)為1 6 7 6 噸，公頃( f a o 。 2 0 0 5 ) 。自1 9 6 1 年至今，馬鈴薯在發(fā)達(dá)國(guó)家的栽培面積總體呈下降趨勢(shì)，觚1 9 6 1 年的1 8 7 9 9 3 萬(wàn) 公頃減少到了2 0 0 5 年的9 1 4 9 2 萬(wàn)公頃；而在發(fā)展中國(guó)家卻呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，從1 9 6 1 年的3 3 4 8 7 萬(wàn) 公頃增加到了2 0 0 5 年的9 5 0 3 2 萬(wàn)公頃，平均年增長(zhǎng)1 3 6 8 萬(wàn)公頃；但由于生產(chǎn)水平的提高，世 界馬鈴薯總產(chǎn)量仍然呈逐漸上升趨勢(shì)。據(jù)國(guó)際馬鈴薯中心( c 口) 和國(guó)際糧食政策研究所( i f p r i ) 預(yù)測(cè)，1 9 9 3 至2 0 2 0 年，全球馬鈴薯產(chǎn)量的平均年增長(zhǎng)率為2 7 ，遠(yuǎn)高于水稻、玉米、小麥等作 物，世界人口達(dá)到高峰時(shí)，馬鈴薯和其他塊根、塊莖類(lèi)作物將成為世界糧食安全保障體系中的重 要作物( g r e g o r y , e ta 1 2 0 0 0 ) 。 盡管目前我國(guó)的馬鈴薯種植面積和產(chǎn)量均居世界首位，但單產(chǎn)與世界發(fā)達(dá)國(guó)家相比( 如單產(chǎn) 最高的英國(guó)為4 5 0 0 噸公頃( e a o ，2 0 0 5 ) ) 還有相當(dāng)大的差距，并且我國(guó)各地區(qū)的生產(chǎn)水平也 很不均衡，發(fā)展?jié)摿薮?，同時(shí)馬鈴薯品質(zhì)也有待進(jìn)一步提高。專(zhuān)家預(yù)測(cè)，中國(guó)將成為啞太地區(qū) 最重要的生產(chǎn)中心( 屈冬玉等，2 0 0 1 ) ，是2 1 世紀(jì)全球最大的馬鈴薯快餐食品消費(fèi)市場(chǎng)，由此可 見(jiàn)馬鈴薯加工領(lǐng)域的巨大潛力也不容忽視。 由青枯病痛原菌( r a l a t o n i as o l a n a c e a r u m 餌f s m i t h ) c o m b n o v ，原名為p s e u d o m o n a s a o l a n a c e a r u m ，以下簡(jiǎn)稱(chēng)為青枯病菌) 引起的馬鈴薯青枯病( b a c t e r i a lw n ) 是世界性的細(xì)菌性 病害( y a b u u c h i ，e t a l 1 9 9 5 ) ，其危害程度僅次于馬鈴薯晚疫病，可通過(guò)土壤，灌溉、植株、種薯 等進(jìn)行傳播。該病菌寄主范圍，“，可侵染5 0 個(gè)科的數(shù)百種植物，尤其是茄科植物，如馬鈴薯、 番茄等( m a r t i n ，e t a l 1 9 8 5 ) ，防治非常困難，特別是在溫暖潮濕的環(huán)境中，發(fā)病率更高，嚴(yán)重者 可使馬鈴薯減產(chǎn)8 0 ，甚至絕產(chǎn)( h e ，1 9 8 7 ) ，嚴(yán)重威脅著我國(guó)乃至世界的馬鈴薯生產(chǎn)。 此病目前尚沒(méi)有行之有效的化學(xué)藥荊防治辦法，盡管與其他作物輪作、間套作及調(diào)整播種時(shí) 期等綜合防治措施在一時(shí)間可較有效的防治該病的發(fā)生和蔓延，但防治馬鈴薯青枯病的根本手段 還是培育抗病品種。長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外科技工作者對(duì)馬鈴薯青枯病的研究和探討主要集中在該病 的病理學(xué)機(jī)制、分類(lèi)學(xué)及流行病學(xué)、品種資源評(píng)價(jià)及雜交篩選等方面，但在抗性遺傳機(jī)制方面卻 知之不多，控制馬鈴薯對(duì)青枯病的抗性基因種類(lèi)和數(shù)量以及它們的表達(dá)調(diào)控機(jī)制還不清楚。同時(shí) 由于可供利j ；i 的抗病育種材料有限，普通四倍體葳培品種遺傳背景復(fù)雜，又缺乏優(yōu)良酌抗病基因 源，嚴(yán)重影響了抗病育種工作的進(jìn)程。因此深入研究馬鈴薯的抗青桔病機(jī)制和進(jìn)行抗病相關(guān)基因 的分離將有助于了解和揭示復(fù)雜的抗病防御反應(yīng)機(jī)理。對(duì)確定更有效的抗病育種途徑，培育高抗 青枯病的馬鈴薯新品系( 品種) 具有重要的理論與實(shí)踐意義。 1 2 青枯病研究進(jìn)展 1 2 1 青枯病菌的研究概況 1 2 1 1 病菌的分類(lèi) 青枯病菌具有明顯的生理分化或菌系多樣性。不同地區(qū)或寄主植物來(lái)源的分離物在寄主范圍 上、致病力強(qiáng)弱上或細(xì)菌學(xué)特性上并不完全相同。目前國(guó)際上公認(rèn)的主要有兩個(gè)亞分類(lèi)系統(tǒng)。一 是美國(guó)的b u d d e n h a g e n 、s e q u e i m 和k e l m a n 于1 9 6 2 年根據(jù)不同來(lái)源菌株對(duì)不同植物種類(lèi)的致病 性差異，將青枯病菌劃分為三個(gè)生理小種( r a c c ) ：可高度侵染茄科植物( 包括馬鈴薯、番茄、 茄子、辣椒和煙草等) 和其它植物，寄主范圍較廣的為小種l 號(hào)；只侵染香蕉、大蕉和海里康 ( h e l i c o n i a ) 的為小種2 號(hào)；只侵染馬鈴薯和偶爾侵染番茄、茄子的為小種3 號(hào)。另一個(gè)亞分類(lèi) 系統(tǒng)是澳大利亞h a y w a r d 根據(jù)不同菌株對(duì)3 種雙糖和3 種己醇氧化產(chǎn)酸能力的差異，將青枯病菌 劃分為四個(gè)生化變種( b i o v a r ，原先稱(chēng)生化型b i o t y p e ) ，即：生化變種l 一不能氧化3 種雙糖和3 種己醇；生化變種2 一只能氧化3 種雙糖，不能氧化3 種己醇；生化變種3 一能氧化3 種雙糖和3 種己醇；生化變種4 一只能氧化3 種己醇，不能氧化3 種雙塘。后來(lái)又發(fā)現(xiàn)兩個(gè)生理小種4 、5 和一個(gè)生化變種5 。生理小種和生化變種之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系如圖1 2 。 臥鼉扣 圖1 2 生理小種和生化變種之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系 n g 1 , 2c o r r e s p o n d i n gr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt w oc l a s s i f i e ds y s t e m ( r a c ea n db l o v a ro f r a h t o n as o l a n a c e a r u m ) 兩種分類(lèi)之間無(wú)一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，如小種1 號(hào)包括三個(gè)生化變種l 、3 和4 ，而這三個(gè)生化變種 又分屬于三種生理小種1 、2 、4 ，為進(jìn)行青枯病抗病研究和國(guó)際間的信息交流帶來(lái)了困難，并且 這兩種分類(lèi)方法都不符合通用的細(xì)菌命名法( c o d e o f n o m e n c l a t u r e o f b a c t e r i a ) 。因此統(tǒng)一和系統(tǒng) 分類(lèi)青枯病菌及弄清所研究病菌分屬于哪個(gè)生理小種和生化變種是必要的，未來(lái)青枯病菌的分類(lèi) 可能會(huì)分為2 個(gè)或更多的啞類(lèi)( h a y w a r d ，1 9 9 1 ) 。目前為害我國(guó)馬鈴薯的優(yōu)勢(shì)菌( 系) 是生化變 種2 ，它是一個(gè)低溫型菌系，在低溫下生化變種2 ( 小種3 ) 比生化變種3 和4 更具有侵染力( c i a m p i 。 甜a 1 9 8 0 ) ，嚴(yán)重威脅著馬鈴薯生產(chǎn)。 1 2 1 2 病菌的檢測(cè) 隨著青枯病菌的寄主越來(lái)越“泛及其本身的高變異性，診斷技術(shù)對(duì)于青枯病的鑒定、栽培材 2 料的帶菌檢測(cè)和控制病害蔓延傳播等具有重要作用。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的專(zhuān)家學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了大量的 研究和探討，并建立了多種方法用于土壤、水、雜草等的青枯病菌檢測(cè)。2 0 世紀(jì)9 0 年代，隨著 在西歐和北歐陸續(xù)發(fā)現(xiàn)青枯病菌小種3 號(hào)( 生化變種2 號(hào)) ，w u l l i n g s 等( 1 9 9 8 ) 建立了一種基 于f i s h 的檢測(cè)馬鈴薯青枯病菌的新方法：用特異探針r s o l a 和r s o l b 可有效檢測(cè)污染地區(qū) 的土壤、水及雜草寄主根組織中的青枯病菌。為提高病菌檢測(cè)的靈敏度，p o u s s i e r 等( 2 0 0 2 ) 優(yōu) 化了病菌提取程序，采用簡(jiǎn)單的p c r 方法可有效檢測(cè)來(lái)源不同的低含量的青枯病菌。同年，c a r u s o 等利用特異單克隆抗體8 b 一l a 可與1 6 8 個(gè)典型的青枯病菌系發(fā)生反應(yīng)，而與1 7 4 個(gè)其他病原 或源自馬鈴薯的未知病原不發(fā)生反應(yīng)的特性，建立了富集雙抗體夾心間接e l i s a 法。該方法引入 了一個(gè)病菌富集過(guò)程，靈敏度可達(dá)l 一1 0c f u m l ( 馬鈴薯塊莖提取物) ，可有效檢測(cè)馬鈴薯塊莖中 的病菌。2 0 0 3 年，s c h o n f c l d 等在p o u s s i e r 等報(bào)道的p c r 檢測(cè)方法基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)展了r s o l - f l i c p c r 系統(tǒng)，該方法不僅可快速檢測(cè)低含量的青枯病菌，而且對(duì)于不同地理起源的青枯病菌的檢 測(cè)同樣有效。同年c a r u s o 等也對(duì)p c r 方法檢測(cè)青枯病菌的靈敏度和檢測(cè)方法簡(jiǎn)單化方面進(jìn)行了 卓有成效的改進(jìn)：根據(jù)1 6 sr r n a 序列設(shè)計(jì)3 個(gè)p c r 引物，利用c o - p c r ( 在同一個(gè)反應(yīng)體系中 進(jìn)行多對(duì)引物的p c r 擴(kuò)增) 法可在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)對(duì)水中青枯病菌生化變種1 、2 和4 號(hào)進(jìn)行特 異檢測(cè)分析，靈敏度可達(dá)l c f u