摘要 透明質(zhì)酸( h a ) 是一種廣泛存在于人和動(dòng)物體各組織中的酸性粘多糖，具 有重要的生理功能，己被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥及化妝品等各領(lǐng)域。但目前我國(guó)的 h a 生產(chǎn)主要是通過(guò)組織提取法獲得，其產(chǎn)品不能滿足市場(chǎng)曰益增長(zhǎng)的對(duì)h a 的 需求，因此開(kāi)發(fā)先進(jìn)的發(fā)酵法生產(chǎn)h a 的技術(shù)就十分必要，而開(kāi)發(fā)出一套完整的 h a 下游分離工藝則是將發(fā)酵法應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的關(guān)鍵。 目的：研究出一條可用于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)h a 的完整的下游分離工藝路 線及其技術(shù)參數(shù)，使發(fā)酵的h a 產(chǎn)品達(dá)到化妝品級(jí)h a 的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用 獸疫鏈球菌s t r e p t o c o c c u sz o o e p i d e m i c u s 進(jìn)行分批補(bǔ)料式發(fā)酵培養(yǎng)。對(duì)得到的發(fā) 酵液進(jìn)行h a 分離提??；分別對(duì)發(fā)酵液的預(yù)處理、除菌體、分離、純化、干燥、 粉碎等工藝條件進(jìn)行了研究。通過(guò)檢測(cè)h a 得率，分子量損失和蛋自去除率等指 標(biāo)，選擇出最佳的提取方法和條件，并通過(guò)中試檢驗(yàn)其效果。結(jié)果：得到了一條 適用于發(fā)酵法生產(chǎn)h a 的工藝路線及相關(guān)工藝條件，并通過(guò)了中試檢驗(yàn)。最后得 到的h a 產(chǎn)品為白色粉末，h a 得率約7 0 ，分子量高于1 4 1 0 6 ，蛋白含量低 于o 5 ，葡萄糖醛酸含量為3 9 1 ，并經(jīng)紅外，紫外光譜分析，基本達(dá)到了化 妝品級(jí)h a 的要求。結(jié)論：獲得了一套可用于發(fā)酵法生產(chǎn)h a 的下游分離工藝路 線和技術(shù)參數(shù)，對(duì)h a 的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)具有實(shí)用意義。 關(guān)鍵詞：透明質(zhì)酸；發(fā)酵；中試；分離提?。夯瘖y品級(jí) a b s t r a c t h y a l u r o n i ca c i d ( h a ) i so n ek i n do fa c i d i cm u c o p o l y s a c c h a r i d ow h i c he x i s t s e x t e n s i v e l yi nm a n yt i s s u e s o fp e o p l ea n da n i m a l s h ah a sm a n yi m p o r t a n t p h y s i o l o g i c a la c t i o n s s o i t i s a p p l i e dt o s u c he v e r yf i e l d s a st h em e d i c i n e sa n d c o s m e t i c s b u tt h em a i np r o d u c t i v em e t h o d o l o g yo fh ai no u rc o u n t r ys t i l lr e m a i n s e x t r a c t i o nm e t h o da tp r e s e n t i tc a n tm e e tt h ei n c r e a s i n gd e m a n df o rh ad a yb yd a y , s o i ti sv e r ye s s e n t i a lt o p o p u l a r i z et h ea d v a n c e dt e c h n o l o g yo fp r o d u c i n gh a f e r m e n t a t i o nm e t h o d d e v e l o p i n go n ed o w n s t r e a mc r o f tw h i c hc o a td r a wh af r o m t h ef e r m e n t a t i o nb r o t hi st h ew a yb yw h i c hf e r m e n t a t i o nm e t h o dc a nb eu s e di n c o m m e r c i a lp r o d u c t i o n p u r p o s e ：d e s i g n i n ga s e to fd o w n s t r e a me x t r a c t i n gc r a t ta n dt e c h n i c a l p a r a m e t e r st h a tc a nb eu s e di nc o m m e r c i a lp r o d u c t i o n m a k i n gt h eh ap r o d u c tr e a c h t h eq u a l i t yr e q u i r e m e n t so fc o s m e t i cg r a d eh a m e t h o d ：u s i n go n ek i n do fb a c t e r i a s s t r e p t o c o c c u sz o o e p i d e m i c u s ，f e r m e n t a t i o n b r o t hc a r lb e g o tb y b a t c ha n d s u p p l e m e n t a r yf o o di nf e r m e n t o r s t u d y i n gt h es i xs t e p so fe x t r a c t i n g ：p r e t r e a t m e n t ，g e t r i do fi m p u r i t y ，d i s e n g a g e m e n t ，p u r i f i c a t i o n ，d r y n e s sa n dg r i n d w h i l es t u d y i n ge v e r y s t e p ，m e a s u r i n gt h eh ar e c o v e r yr a t e ，t h el o s sr a t eo fm o l e c u l a rw e i g h t ，a n dt h e e l i m i n a t i o nr a t eo fp r o t e i n s c h o o s i n gt h eb e s tm e t h o d sa n dc o n d i t i o n s j o i n i n gt h e m i n t oo n er o u t e ，a n de x a m i n ei t sr e s u l tt h r o u g ht h ep i l o tt e s t r e s u l t ：h a dg o tac r a f t r o u t ea n ds o m et e c h n i c a lp a r a m e t e r s i nt h ep i l o tt e s t ，t h eh a p r o d u c ti sw h i t ep o w d e r , t h eh a r e c o v e r yr a t ei s7 0 ，t h em o l e c u l a rw e i g h ti sh i g h e rt h a n1 4 1 0 6 t h ec o n t e n t o fp r o t e i ni sl o w e rt h a n0 5 。t h ec o n t e n to fg l u c u r o n a t ei s 3 9 1 a n a l y s i n gw i t h i n f r a r e da b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p ya n du l t r a v i o l e rs p e c t r o s c o p y , i tc a nb es e e nt h a tt h e p r o d u c t sh a v er e a c h e dt h eq u a l i t yr e q u i r e m e n to fc o s m e t i cg r a d eh a c o n c l u s i o n ： g e t t i n ga s e to fd o w n s t r e a me x t r a c t i n gc r a f ta n dt e c h n i c a lp a r a m e t e r st h a tc a nb eu s e d i nt h eh a p r o d u c t i o np r o c e s st h r o u g hf e r m e n t a t i o n i th a sp r a c t i c a lm e a n i n gf o rt h e f e r m e n t a t i o nm e t h o do fh a p r o d u c t i o n k e yw o r d s ：h y a l u r o n i ca c i d ；f e r m e n t a t i o nm e t h o d ；p i l o tt e s t ；e x t r a c t i o n ；c o s m e t i c g r a d e ； 西北大學(xué)學(xué)位論文知識(shí)產(chǎn)權(quán)聲明書(shū) 本人完全了解學(xué)校有關(guān)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)鮑規(guī)定，即：研究生在校攻讀 學(xué)位期間論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬于西北大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó) 家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版。本人允許論文被查閱和 借闋。學(xué)?？梢詫⒈緦W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢 索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。同 時(shí)，本人保證，畢業(yè)后結(jié)合學(xué)位論文研究課題再撰寫(xiě)的文章一律注明作 者單位為西托大學(xué)。 莖差蓑妻纂：蘭霎? 疆指導(dǎo)教師簽名：絲 學(xué)位論文作者簽名： 鱒指導(dǎo)教師簽名：絲 6 f 年6 強(qiáng)( 一疆口，每其勿b 西北大學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明：所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作 及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外， 本論文不包含其飽入已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含力獲褥西 北大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的 同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝 意。 學(xué)位論文作者簽名： p 才年 日嗚幻 第一部分前言 1 透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì) 1 1 透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu) 透明質(zhì)酸c h y a l u r o n i ca c i d ，簡(jiǎn)稱h a ) 又名玻璃酸，是由m e y e r 1 1 于1 9 3 4 年 首先從牛眼玻璃體中分離得到的一種直鏈酸性粘多糖。分子量為1 0 1 0 5 4 0 1 0 6 d a 之間。其分子結(jié)構(gòu)是由n 乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸通過(guò)p l ，4 和p l ，3 糖菅鍵反復(fù)交替連接而成。分子中兩種單糖p - d 一葡萄糖醛酸( g l u c u r o n i ca c i d ) 和 n 乙酰氨基d 葡萄糖胺甜a c e t y lg l u c o s a m i n c ) 按1 ：1 的摩爾比組成。其雙糖結(jié) 構(gòu)如下圖： 1 2 透明質(zhì)酸的理化性質(zhì) h a 為白色、無(wú)定形固體、無(wú)臭無(wú)味。其具有強(qiáng)烈的吸濕性、溶于水、不溶 于有機(jī)溶劑，水溶液的比旋度為- - 7 0o 一8 0 0 ，在氯化鈉溶液中由于葡萄糖醛酸 中的- - c o o h 基解離，產(chǎn)生h + 使得h a 呈現(xiàn)為酸性多聚陰離子狀態(tài)，賦予了h a 酸性粘多糖的性質(zhì)。h a 具有高分子量和大分子體積的特性，分子在溶液中高度 伸展與隨機(jī)卷曲的構(gòu)型使其占有很大區(qū)域，其流體力學(xué)體積較未水化時(shí)所占空間 大1 0 0 0 倍。并且由于直鏈軸上單糖之間氫鍵的作用，h a 分子在空間上呈剛性的 螺旋柱型【2 】，其半徑為2 0 0 r i m ，柱的內(nèi)側(cè)由于存在大量的羥基而產(chǎn)生強(qiáng)烈的親水 性；同時(shí)羥基的連續(xù)定向排列，又在分子鏈上形成高度的憎水區(qū)，h a 分子的親 水和憎水特性，使得濃度低于l 的h a 也能形成連續(xù)的三維蜂窩狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu) 3 1 ， 水分子則在網(wǎng)絡(luò)內(nèi)通過(guò)極性鍵和氫鍵與h a 分子相結(jié)合，使得這些水在柱內(nèi)固定 不動(dòng)，不易流失。從而使h a 像“分子海綿”樣，可以吸收與保持其自身重量 上千倍的水分，是國(guó)際上公認(rèn)的最好的保濕劑 4 1 。 h a 最突出的特點(diǎn)是有較高的粘度特性，其溶液的粘度，遇到下述條件( 1 ) p h 低于或高于7 ；( 2 ) 透明質(zhì)酸酶的存在；( 3 ) 許多還原性物質(zhì)如半胱氨酸， 焦性沒(méi)食子酸，維生素c 或金屬離子存在：( 4 ) 紫外線，電子束照射等。可發(fā) 生不可逆的下降。( 1 ) 和( 2 ) 可能是因引起糖苷鍵的水解造成的，還原劑的作 用機(jī)制還不十分清楚，輻射破壞可能是因分子之間的解聚造成的。在h a 及其制 劑的生產(chǎn)中，應(yīng)盡量減少分子鏈的降解，保持其大分子特性【5 l 。 2 透明質(zhì)酸的用途 2 1 透明質(zhì)酸的生理功能 h a 廣泛存在于各種組織細(xì)胞間質(zhì)中，如皮膚、臍帶、關(guān)節(jié)滑液、軟骨、眼 玻璃體、卵細(xì)胞、血管壁等。在不同的組織中h a 的生理作用也有所不同：在皮 膚中主要表現(xiàn)為保水作用；在關(guān)節(jié)滑液中主要為潤(rùn)滑作用；在血管壁中主要調(diào)節(jié) 通透性。在結(jié)締組織中，透明質(zhì)酸可以與蛋白結(jié)合成分子量更大的蛋白多糖分子， 它是保持疏松結(jié)締組織中水分的重要成分。若將蛋白多糖的糖鏈分解，則喪失保 持細(xì)胞外水分的能力。分布在結(jié)締組織中的蛋白多糖，通過(guò)氨基多糖與水結(jié)合， 這種透明質(zhì)酸一蛋白質(zhì)一水形成的凝膠狀態(tài)將細(xì)胞粘合在一起，發(fā)揮正常的細(xì)胞 代謝作用及組織保水作用并保護(hù)細(xì)胞不受病原菌的侵害，防止感染，使皮膚具 有一定的韌性與彈性。另外h a 作為聚陰離子電解質(zhì)，分子上所帶的大量負(fù)電荷， 可調(diào)節(jié)周圍正負(fù)離子的濃度，抑制多種酶的活性。 2 2 透明質(zhì)酸在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 h a 本身就是人和動(dòng)物體內(nèi)的組成成分，無(wú)毒，無(wú)免疫原性，具有生物相容 性和降解性【6 j ，作為醫(yī)藥原料安全可靠，因此其是深受歡迎的新型生物醫(yī)學(xué)材料， 具有很高的醫(yī)用價(jià)值。 明質(zhì)酸在i 缶床醫(yī)學(xué)方面也有廣泛的應(yīng)用。m i l l e r 和s t e g m a r m l 7 1 曾把h a 用于 眼外科人工晶體植入手術(shù)，發(fā)現(xiàn)它能保護(hù)角膜內(nèi)皮，也能保護(hù)虹膜免受人工晶體 支撐袢損傷。在其它眼科手術(shù)中h a 的使用可使成功率增高，并發(fā)癥減少。特別 是對(duì)于粘性手術(shù)來(lái)說(shuō)，h a 是理想的和唯一使用的材料。預(yù)計(jì)對(duì)視網(wǎng)膜剝離手術(shù)、 開(kāi)放性玻璃體切除術(shù)、外傷眼球的修復(fù)、角膜移植術(shù)和抗青光眼手術(shù)等，h a 可 能會(huì)有更重要的價(jià)值 8 】【9 】。 用h a 治療骨關(guān)節(jié)疾病，主要利用h a 獨(dú)特的流體力學(xué)性質(zhì)。它的主要作用 在于保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，潤(rùn)滑關(guān)節(jié)腔，改善關(guān)節(jié)液和抑制疼痛，而且外源性高分子量 2 的透明質(zhì)酸注射在關(guān)節(jié)腔內(nèi)，改善了關(guān)節(jié)腔的生物環(huán)境，促進(jìn)患者自身合成高分 子量的h a 。r y d e u 等【l o 】用粘稠的h a 溶液治療關(guān)節(jié)炎并取得了很好的療效，這 種方法后為許多同類治療方法所證實(shí)。 1 9 9 1 年k i n g 等發(fā)現(xiàn)，h a 有益于傷口愈合。這種作用的機(jī)制尚不清楚。但 認(rèn)為h a 在組織的再生，重塑和愈合過(guò)程中具有促進(jìn)作用。 在外科手術(shù)后，可應(yīng)用h a 作為手術(shù)后防治組織粘連，使粘結(jié)的發(fā)生率大大 降低。h a 防治術(shù)后組織粘連的機(jī)理是：h a 具有高分子纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，涂布于 組織表面起到阻隔作用，在腹膜修復(fù)期起到一個(gè)臨時(shí)的屏障；抑制術(shù)后出血和滲 血，減少能形成永久粘連骨架的數(shù)量，避免組織接觸面的纖維蛋白沉著；高濃度， 高分子量的h a 能抑制粒性白細(xì)胞遷徙和巨噬作用，并且抑制血小板的沉積顯示 出h a 的抗炎特性；h a 與間質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表面的高親和力和h a 受體蛋 白相互作用，提高這些細(xì)胞的遷徙能力并使其遷徙定向，從而改善內(nèi)源性修復(fù)過(guò) 程；h a 凝膠覆蓋于創(chuàng)傷漿膜表面，維持充分的時(shí)間不降解代謝，使早期的刨傷 組織修復(fù)規(guī)則而有序地生長(zhǎng)，直至形成連續(xù)的間皮細(xì)胞層覆蓋于刨傷表面，達(dá)到 生理性修復(fù)】。 h a 還可作為疾病診斷指標(biāo)。因?yàn)檠械膆 a 很容易檢測(cè)，于是它可作為一 種觀察指標(biāo)輔助診斷某些疾病?，F(xiàn)已證實(shí)，h a 是反映肝內(nèi)皮細(xì)胞功能和肝硬化 的有實(shí)用價(jià)值的新指標(biāo)【1 2 ?；紣盒阅[瘤時(shí)，h a 的量變與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)有關(guān)。 h a 加藥物可作緩釋試劑或靶向誘導(dǎo)【1 i i 。h a 作為一種載體，可將各釉藥物 導(dǎo)向各病理部位，讓藥物定位于作用部位同時(shí)緩慢釋放，這樣可大大增加藥物的 療效【7 1 。 2 3 透明質(zhì)酸在化妝品工業(yè)中的應(yīng)用 h a 既具有強(qiáng)吸水性，又有調(diào)節(jié)人體表皮水分的特殊功能。它可以吸收超過(guò) 自身重量1 0 0 0 倍的水分，但在外部環(huán)境濕度變化時(shí)，它的保濕性又可調(diào)節(jié)至適 度，這也是h a 較其它保濕劑的最大優(yōu)越性。h a 具有較強(qiáng)的消皺功能，可增加 皮膚彈性，延緩皮膚衰老，使皮膚柔嫩、光滑，在保濕的同時(shí)又是良好的透皮吸 收促進(jìn)劑，這就是h a 保濕性和營(yíng)養(yǎng)性的雙重作用，是其它任何保濕劑無(wú)法比擬 的。同時(shí)，h a 是具有直鏈結(jié)構(gòu)的生物高分子制品，其水溶性具有很高的粘度， 可使水相增稠，與油相乳化后的膏體細(xì)膩均勻，具有穩(wěn)定乳化作用。由于h a 的 營(yíng)養(yǎng)性、增稠性，特別是其良好的保濕性使其成為化妝品，特別是高檔化妝品不 可缺少的主要保濕成分。 2 0 世紀(jì)8 0 年代初，h a 優(yōu)異的保濕功能受到了國(guó)際化妝品界的廣泛關(guān)注。 在國(guó)際化妝品行業(yè)中，許多著名的化妝品生產(chǎn)商都在競(jìng)相開(kāi)發(fā)含h a 系列的護(hù)膚 品當(dāng)今在國(guó)內(nèi)外化妝品市場(chǎng)上添加h a 的高檔化妝品日益增多，含有h a 的化 妝品被公稱為“仿生化妝品”，添加h a 的化妝品已成為國(guó)際日化界的主流產(chǎn)品。 有關(guān)文獻(xiàn)資料和國(guó)內(nèi)外近幾十年大量的應(yīng)用表明，h a 可以用于膏霜、乳液、面 膜、美容液、化妝水、口紅、粉底、精華素等護(hù)膚化妝品中，也可以用于洗發(fā)、 護(hù)發(fā)、摩絲、洗面奶等產(chǎn)品。如日本資生堂公司的“b h 2 4 ”精華素，美國(guó)r e v l o n 公司的“m o o n d r o p 5 ”保濕劑，法國(guó)m a y b e u i n 公司的h y d r o b e u a 潤(rùn)膚露， 國(guó)內(nèi)的永芳、自然美等品牌的化妝品都添加有h a t l 3 】，盡管產(chǎn)品價(jià)格昂貴，仍深 受消費(fèi)者的喜愛(ài)。 化妝品對(duì)h a 分子量和添加量的要求，因產(chǎn)品的特性不同而有所差異，分子 量越大，成膜性越好，但滲透性相對(duì)欠佳；分子量較低的產(chǎn)品，成膜性相對(duì)較差， 但滲透作用明顯。因此，應(yīng)根據(jù)化妝品的不同需要選擇不同分子量的h a 。添加 量一般在l 左右，特殊用途的化妝品添加量高達(dá)5 。一般來(lái)說(shuō)，抗皺去皺類、 防曬類化妝品應(yīng)選擇分子量較高的產(chǎn)品，添加量應(yīng)在l o a o 至5 范圍內(nèi)。而洗面 奶、面膜等化妝品，主要利用h a 的通透性，分子量應(yīng)選擇低一些，添加量一般 在1 左右【1 4 】。 h a 還可作為口服美容保健食品【嘲。其理論依據(jù)是：h a 通過(guò)口服經(jīng)消化吸 收，增加體內(nèi)h a 合成的前體，使皮膚和其他組織的合成量增加，從而使皮膚 的保水性能增加，富有彈性，皺紋減少。口服h a 可補(bǔ)充體內(nèi)h a 的不足，預(yù)防 老化，維持老齡化人群的健康。 2 4 透明質(zhì)酸的市場(chǎng)價(jià)值 2 0 0 4 年全球的h a 在化妝品和醫(yī)療用途上，銷售總值高達(dá)3 0 , - 4 0 億美元， 每年以很高的速率增長(zhǎng)，估計(jì)在未來(lái)的幾年內(nèi)，每年將超過(guò)1 0 0 億美元。h a 的 級(jí)別不同，售價(jià)差額很大；化妝品級(jí)的h a 的價(jià)格已由5 0 0 0 美元k g ( 8 0 年代) 降 至目前的3 0 0 0 4 0 0 0 美元k g ，醫(yī)用級(jí)h a 的價(jià)格為2 6 萬(wàn)美元k g 。1 9 8 5 年國(guó)際 市場(chǎng)h a 的總銷售額達(dá)1 億美元，1 9 9 0 年達(dá)2 億美元，1 9 9 5 為6 億美元1 9 9 7 年 4 全世界僅用于眼科手術(shù)中的h a 產(chǎn)品已超過(guò)1 億美元且每年都有上升趨勢(shì)美國(guó) l 5 f e c o r e 公司認(rèn)為僅作為外科手術(shù)防粘連產(chǎn)品這一項(xiàng)h a 在世界市場(chǎng)上每年就可 高達(dá)1 2 億美元國(guó)外的焦點(diǎn)已集中在醫(yī)藥級(jí)的h a 的研發(fā)上美國(guó)b j o m s a r i 公 司采用h y l a n 技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種商品名為s y n v i s c 的產(chǎn)品，用于補(bǔ)充人體骨關(guān)節(jié)滑 液并可治療關(guān)節(jié)炎、肩周炎等疾病，1 9 9 6 年1 2 月份德國(guó)b i o m s a r t 公司以8 0 0 萬(wàn)美元的代價(jià)向b i o m s s r i 公司購(gòu)買了s y n v i s c 的部分專營(yíng)權(quán)，1 9 9 7 年初 b i o m s a r t 公司又以2 3 0 0 萬(wàn)美元的價(jià)格將s y n v i s c 的部分專營(yíng)權(quán)賣給了美國(guó)的 w y c a y c 公司據(jù)市場(chǎng)預(yù)測(cè)分析表明、這種產(chǎn)品全球每年能有5 萬(wàn)美元的銷售市 場(chǎng)m s a t r i 公司目前正在對(duì)原有發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行政造，同時(shí)在興建新的生產(chǎn)工廠， 建成投產(chǎn)后能使產(chǎn)量增加4 倍加拿大h y a l 制造公司開(kāi)發(fā)的一種名叫5 0 1 r a s e 的 藥物，用于治療角膜化病、皮膚病，抑制癌病變h y a l 公司估計(jì)s 0 1 r a s e 僅在 美國(guó)的年銷量就可達(dá)2 億多美元呻i 。 而我國(guó)化妝品級(jí)h a 市售價(jià)1 3 萬(wàn)元k g ，醫(yī)藥級(jí)h a 市售價(jià)8 萬(wàn)元k g 。我 國(guó)目前的h a 年需求量從上世紀(jì)9 0 年代中期的i - 2 噸已經(jīng)增長(zhǎng)到現(xiàn)在的5 - 6 噸， 并且將會(huì)繼續(xù)大幅度增長(zhǎng)叩1 。 3 透明質(zhì)酸的制備方法 制備h a 主要有兩種途徑：一種是從動(dòng)物組織中提??；一種是通過(guò)微生物發(fā) 酵獲得【1 8 】，其比較見(jiàn)表1 1 。 表1 i 提取法與發(fā)酵法生產(chǎn)h a 的比較 t a b l 1t h ec o n t r a s to f e x t r a c t i o nm e t h o da n df e r m e r l t a t i o nm e t h o d 其中從動(dòng)物組織提取的工藝已相當(dāng)成熟，是目前生產(chǎn)h a 的主要手段，而發(fā) 酵法由于菌種和生產(chǎn)工藝的限制，尚未得到廣泛應(yīng)用。 3 1 從動(dòng)物組織中提取透明質(zhì)酸 國(guó)內(nèi)目前有十幾家透明質(zhì)酸的生產(chǎn)廠家，如山東福瑞達(dá)公司、山東東營(yíng)東辰 集團(tuán)公司、上海聚源生物科技公司、廣州申強(qiáng)化工有限公司、浙江瑞邦制藥廠、 江蘇無(wú)錫柯蘭精細(xì)化學(xué)制品廠、重慶團(tuán)結(jié)生化制品有限公司、江蘇吳江振興生物 制品廠、杭州嘉偉生物制品有限公司等，他們大都是用動(dòng)物組織提取法【1 5 】。從動(dòng) 物組織中提取h a 常用的原料有雞冠( 公雞冠中h a 含量達(dá)7 5 啦g ) 、臍帶、豬皮 等岬】 2 q ，主要工藝過(guò)程包括脫水、磨碎、浸泡、提取、除雜、沉淀和分離。從動(dòng) 物組織提取h a 的一般過(guò)程如下：先將組織勻漿，再用水和稀鹽溶液提??；提取 液用氯代十六烷基毗啶或十六烷基三甲基溴化銨沉淀；將所得的沉淀溶解除渣 后，用2 3 倍乙醇沉淀即得粗產(chǎn)品【7 l o 純化可用乙醇或季銨鹽反復(fù)沉淀進(jìn)行處 理，或采用酶解、超濾【2 1 1 、離子交換田1 等技術(shù)進(jìn)一步去雜質(zhì)及蛋白。這種方 法的特點(diǎn)是工藝流程簡(jiǎn)單，適用于原料來(lái)源分散的小規(guī)模生產(chǎn)。但由于原料有限， 且原料中h a 的含量低，同時(shí)h a 又還與硫酸軟骨素等粘多糖共存于生物組織中， 致使其收率低，提純難，成本過(guò)高，產(chǎn)品質(zhì)量差，且難于應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。隨 著h a 需求量的不斷增大，迫切要求生產(chǎn)大量的高質(zhì)量h a ，動(dòng)物組織提取法已 不能適應(yīng)這種要求，需要有新的方法來(lái)替代它。 3 2 發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的現(xiàn)狀 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)h a 是開(kāi)發(fā)h a 生產(chǎn)的一個(gè)新途徑，該方法具有原料來(lái)源 豐富、成本低、提制工藝簡(jiǎn)便、產(chǎn)品純度高、易形成規(guī)?；a(chǎn)等特點(diǎn)嘲，因而 具有廣泛的市場(chǎng)應(yīng)用前景。 可產(chǎn)生h a 的微生物主要為鏈球菌的a 組和c 組菌【2 鍆，如釀膿鏈球菌( a 群) 、 獸疫鏈球菌( c 群) 、馬鏈球菌( c 群) 、類馬鏈球菌( c 群) 、缺乳鏈球菌( c 群) ，a 組菌群是人類致病菌，較少用作菌種大規(guī)模的發(fā)酵；c 組致病性較弱，從大量的 報(bào)道資料看，大部分的研究者所采用的c 組菌種，如馬腺疫鏈球菌 ( s t r e p t o c o c c u s e q u i ) 、獸疫鏈球菌( s t r e p t o c o c c u s z o o e p i d e m i c u s ) 、類馬鏈球菌等。 直接用野生菌發(fā)酵，發(fā)酵液中會(huì)有一定量的h a ，但含量極低，一般情況下不會(huì) 超過(guò)2 l ，得到的h a 分子量也很低。因此必須經(jīng)過(guò)誘變、篩選等手段選育出優(yōu) 6 良菌種1 2 5 l ，才能在發(fā)酵液中得到大量的高分子量h a ，為以后的工業(yè)化生產(chǎn) 打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 國(guó)外自上世紀(jì)7 0 年代開(kāi)始研究利用發(fā)酵法生產(chǎn)h a 。日本資生堂在上世紀(jì) 8 0 年代后期實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵法生產(chǎn)h a 的工業(yè)化，并將h a 成功地應(yīng)用于其生產(chǎn)的 各種化妝品中。至今國(guó)際上發(fā)酵水平已達(dá)到6 7 l p ”。 我國(guó)的h a 年產(chǎn)量在2 噸左右，山東福瑞達(dá)等幾家已開(kāi)始通過(guò)發(fā)酵法生產(chǎn) h a ，但總體規(guī)模較小，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求，每年還需從國(guó)外進(jìn)口透明 質(zhì)酸以彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)需求。 發(fā)酵法之所以沒(méi)有得到廣泛應(yīng)用其原因是多方面的，其中對(duì)發(fā)酵液中h a 產(chǎn) 物的提取工藝不成熟是一個(gè)重要方面。具體表現(xiàn)在缺少一條被廣泛認(rèn)可和接受的 完整的可用于工業(yè)生產(chǎn)的下游分離工藝，分離純化發(fā)酵液中的h a 有多種報(bào)道， c i f o n e l l i 3 2 傭活性炭和纖維素粉末混合制成吸附柱：而w a r r e m 采用丙酮濃縮， 冰乙酸和乙醇沉淀法；t h o n a r d t 3 3 】等先用5 0 的( n h 4 ) 2 s 0 4 除雜蛋白，將( n h 4 ) 2 s 0 4 的濃度增至6 5 ，通過(guò)鹽析作用沉淀h a ，用氯仿一丁醇混合液洗滌，1 5 倍體 積的乙醇沉淀h a 。但這些方法多是用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模分離，并沒(méi)有真正用于工 業(yè)生產(chǎn)，現(xiàn)有的用于工業(yè)生產(chǎn)分離的方法多是從動(dòng)物組織提取h a 的方法借鑒來(lái) 的，如乙醇沉淀、離子交換等。但發(fā)酵法生產(chǎn)h a 有其自身的特點(diǎn)，如發(fā)酵液體 積大，且其中含有大量的菌體及其代謝物等，這就決定了從發(fā)酵液中分離h a 的 處理量和復(fù)雜程度要比組織提取法大的多，完全照搬組織提取的方法是不可行 的，必須根據(jù)發(fā)酵法的具體情況設(shè)計(jì)出一條新的工藝路線。 對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)h a 進(jìn)行分析可以知道：從發(fā)酵液中提取h a 首先要解決發(fā)酵 液中有大量菌體的問(wèn)題，這些菌體可以分泌一種可解離h a 的透明質(zhì)酸酶，降低 h a 分子量，從而影響到h a 產(chǎn)品的質(zhì)量，所用進(jìn)行下游分離純化時(shí)，必須盡快 殺滅和除去發(fā)酵液中的菌體，并使酶失活，所以必須經(jīng)過(guò)預(yù)處理步驟。其次是發(fā) 酵液中的h a 含量高、分子量大，所以發(fā)酵液的粘度很高，這就給分離的過(guò)程帶 來(lái)許多不便，如不能用離心法除菌體，收率會(huì)因h a 的黏附而降低等。最后，由 于對(duì)h a 產(chǎn)品分子量有十分嚴(yán)格的要求( 5 1 0 5 1 5 1 0 6 d a ) 3 4 ，而h a 易因 酸、堿或加熱處理而分解：在鐵、銅等金屬離子和抗壞血酸或半胱氨酸等還原劑 共存下，經(jīng)氧自由基、x 射線、y 射線、紫外線和超聲波作用而降解；它還可被 透明質(zhì)酸酶和硫酸軟骨素酶分解。因此，對(duì)h a 的提取就要求在分離純化的同時(shí)， 嚴(yán)格控制條件，減少h a 分子的降解，保證產(chǎn)物的高分子量。 4 透明質(zhì)酸生產(chǎn)待解決的問(wèn)題 綜上所述，h a 產(chǎn)業(yè)前景廣闌，而發(fā)酵法生產(chǎn)h a 的工藝急待完善。要加快 發(fā)酵法生產(chǎn)h a 的研究開(kāi)發(fā)，應(yīng)主要從以下幾個(gè)方面著手： ( 1 ) 篩選性能優(yōu)良的菌株，并通過(guò)誘變、基因工程等手段構(gòu)建新的工程菌， 為工業(yè)化合成大分子、純度高的透明質(zhì)酸提供基礎(chǔ)。 ( 2 ) 以現(xiàn)有工藝為基礎(chǔ)，優(yōu)化工藝條件，開(kāi)發(fā)高效專用的生物反應(yīng)器建立完 善的在線監(jiān)測(cè)、將i t 技術(shù)引入發(fā)酵工藝的控制過(guò)程中。 ( 3 ) 加強(qiáng)提取工藝的開(kāi)發(fā)，得到一條易于工業(yè)化的下游分離工藝路線。 ( 4 ) 開(kāi)發(fā)快速、簡(jiǎn)便的分析技術(shù)。 本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)從分離提取工藝入手，通過(guò)對(duì)不同h a 提取工藝的比較，期望能 找到一條在保持h a 高分子量和高得率的前提下，盡量降低產(chǎn)品中的蛋白含量的 分離工藝路線，使最后分離得到的h a 產(chǎn)品能滿足化妝品級(jí)h a 的要求( 分子量 大子1 0 1 0 e d a ，蛋白含量在0 5 左右) 閣，從而能作為化妝品級(jí)h a 原料， 并為進(jìn)一步純化為醫(yī)用級(jí)h a 打下基礎(chǔ)。 第二部分材料與方法 1 試劑 h a 標(biāo)準(zhǔn)樣 葡萄糖醛酸內(nèi)酯 四硼酸鈉 咔唑 三氯乙酸 考馬斯亮藍(lán) 牛血清蛋白 氯代十六烷基吡啶( c p c ) 硅藻土 珍珠巖 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 a r a r a r a r a r a r a r 上海華東理工大學(xué)提供 s i g m a 太倉(cāng)化工二廠 上海技術(shù)開(kāi)發(fā)經(jīng)營(yíng)公司 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司 上海技術(shù)開(kāi)發(fā)經(jīng)營(yíng)公司 上海技術(shù)開(kāi)發(fā)經(jīng)營(yíng)公司 上海青浦合成試劑廠 上海大合化學(xué)品有限公司 信陽(yáng)崇真助濾劑有限公司 上海華震科技貿(mào)易公司 表2 1 硅藻土的型號(hào)及主要指標(biāo) t a b 2 1t h et y p ea n dm a j o ri n d e xo f s u r p e r - c e l l 型號(hào) 粒度 o 6 u m 6 2 0 1 a m 2 0 4 0 9 m 4 0 u m s h - 2 0 0 b5 0 6 04 0 5 01 0 1 5l 2 s h - 5 0 0 b s h - 5 0 0 c s h 8 0 0 a 化學(xué)純 2 5 3 5 5 1 0 3 5 3 5 4 5 5 5 4 0 5 0 2 5 3 5 6 0 7 0 1 5 2 0 2 5 - - 3 0 3 5 5 0 2 0 2 5 5 2 0 5 1 0 表2 2 珍珠巖的型號(hào)及主要指標(biāo) 1 h b 2 2t h et y p ea n dm a j o ri n d e xo f p e r l i t e 表2 3陽(yáng)離子變換樹(shù)脂的型號(hào)及主要指標(biāo) 1 1 b 2 3 t h et y p ea n dm a j o ri n d e xo f c a t i o ne x c h a n g er e s i n 2 儀器 5 l 發(fā)酵罐上海伯瑞生物技術(shù)發(fā)展有限公司 5 0 l 發(fā)酵罐 上海華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 7 2 1 型分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠 咖烏氏黏度計(jì) 上海人和科學(xué)儀器有限公司 離心沉淀器上海手術(shù)器械廠 2 z 一2 型旋片真空泵 上海真空泵廠 板框壓濾機(jī)c r l o c 一0 l o 。一1 1 上海萃工機(jī)械有限公司 紫外分光光度計(jì)u v - - p c i 6 0 1日本s h i m a d z u 紅外分光光度計(jì)e q u i n o x德國(guó)b r u k e r 3 ，菌種與培養(yǎng)基 菌種為獸疫鏈球菌s t r e p t o c o c c u s z o o e p i d e m i c u s ( 華東理工大學(xué)保藏) - 種子培養(yǎng)基( ) ：葡萄糖o 2 ，牛肉膏1 ，蛋白胨2 0 ，酵母膏0 5 ，n a c l0 2 ， n a 2 h p o 。1 2 h 2 0o 1 ，k h 2 p 0 4 0 0 1 2 ，p h 7 0 - 7 2 ，1 2 1 滅菌3 0 分鐘。 發(fā)酵培養(yǎng)基( ) ：蛋白胨2 ，酵母膏1 ，n a c l0 2 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 1 0 , ，k2 h p 0 4 o 2 5 ，葡萄糖4 ，1 2 1 滅菌3 0 分鐘。其中葡萄糖單獨(dú)滅菌，在接種時(shí)加入，1 2 1 滅菌3 0 分鐘。 4 培養(yǎng)方法 甘油管中保存的獸疫鏈球菌一平皿涂布培養(yǎng)( 2 4 小時(shí)，3 76 c ) 一 斜面 培養(yǎng)( 2 4 小時(shí)，3 7 c ) 一種子培養(yǎng)( 8 小時(shí)，3 7 。c ) 一搖瓶發(fā)酵或小罐發(fā)酵( 接 種量為5 ) 。 發(fā)酵方式為分批補(bǔ)料式培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為6 0 0 7 0 0 r m i n ，通氣量2 0 l m i n ， 每1 小時(shí)補(bǔ)葡萄糖糖，控制葡萄糖含量約4 左右。 5 分離步驟 發(fā)酵液一預(yù)處理一除菌體一分離一純化一干燥一粉碎 6 陽(yáng)離子樹(shù)脂的預(yù)處理 由于蛋白質(zhì)是生物大分子，所以選擇d 1 5 5 、d 0 0 1 、h d 8 這三種大孔型陽(yáng) 離子交換樹(shù)脂，其中d 0 0 1 和h d 8 是強(qiáng)酸性交換樹(shù)脂，d 1 5 5 是弱酸性樹(shù)脂。采 用靜態(tài)交換法，陽(yáng)離子交換樹(shù)脂預(yù)處理方法為： 1 稱一定量的濕樹(shù)脂于三角瓶?jī)?nèi)，7 0 8 0 c 水洗7 次 2 強(qiáng)酸陽(yáng)離子樹(shù)脂用二倍體積1 n 鹽酸分兩次浸泡，每次1 h ，弱酸性陽(yáng)離子樹(shù) 脂用三倍體積1 n 鹽酸分三次浸泡，每次1 h ，甩去離子水洗至上清液p h 5 0 3 強(qiáng)酸陽(yáng)離子樹(shù)脂用二倍體積1 nn a o h 分兩次浸泡，每次1 h ，弱酸性陽(yáng)離子 樹(shù)脂用三倍體積1 nn a o h 分三次浸泡，每次1 h ，用去離子水洗至上清液p h 9 0 4 強(qiáng)酸陽(yáng)離子樹(shù)脂用二倍體積1 n 鹽酸分兩次浸泡，每次1 5 h ，弱酸性陽(yáng)離子 樹(shù)脂用三倍體積l n 鹽酸分三次浸泡，每次1 5 h ，轉(zhuǎn)換為h 型，用去離子水洗至 上清液p h 6 0 5 使用時(shí)倒掉瓶中的去離子水，加入濾液 7 測(cè)定方法 7 1 透明質(zhì)酸含量測(cè)定 采用b i t t e r - m u i r 的咔唑法【3 ”。 7 1 1 原理 在沸水中h a 被濃硫酸分解成葡萄糖醛酸，在酸性條件下與咔唑結(jié)合形成鮮 艷的玫瑰紅色，且顏色的深淺與糖醛酸含量成正比關(guān)系，再由糖醛酸含量除以 0 4 6 4 3 ，( 糖醛酸在h a 中含量為4 6 4 3 ) 即可知樣品中h a 的量【l6 。 7 1 2 試劑的配制 ( 1 ) 4 0 b g m l 葡萄糖醛酸內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取2 0 m g 葡萄糖醛酸內(nèi)酯( a r t ) ， 溶于苯甲酸飽和溶液中。 ( 2 ) 0 0 2 5 m 硫酸硼砂溶液：稱取四硼酸鈉4 7 7 9 ，溶于濃硫酸( a r ) 5 0 0 m l 中即得。 ( 3 ) 0 1 2 5 咔唑試劑：稱取咔唑0 1 2 5 9 ，溶于無(wú)水乙醇( a r ) l o o m l 中， 置于棕色瓶中冰箱內(nèi)保存。 7 1 3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別配葡萄糖醛酸內(nèi)酯濃度為0 、8 、1 6 、2 4 、3 2 、4 0 i t g m l 的標(biāo)準(zhǔn)溶液， 以l m l 蒸餾水為空白對(duì)照，慢慢加入5 m l 濃硫酸硼砂溶液，搖勻，放入冰浴中冷 卻至4 c 左右，置沸水中煮沸l(wèi) o 分鐘，放入冰浴冷卻，然后每根試管各加入o 2 m l 咔唑試劑，搖勻再次煮沸1 5 分鐘，冰浴冷卻后在5 3 0 r i m 測(cè)定吸光度以o d 5 3 0 n m 吸光度為縱坐標(biāo)，以葡萄糖醛酸內(nèi)酯濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 n g m l 圖2 1 葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 f i 9 2 1 s t a n d a r dc u r v eo f g l u c u r o n a t e 1 2 l 8 6 4 2 0 2 0 0 0 0 0 o 囂8 7 1 4 樣品測(cè)定 取樣品溶液l m l ，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法測(cè)定5 3 0 h m 的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲 線上查出對(duì)應(yīng)的葡萄糖醛酸濃度乘以稀釋倍數(shù)，由于葡萄糖醛酸的含量占整個(gè) 產(chǎn)量的4 6 4 3 ，因此測(cè)得醛酸的含量除以4 6 4 3 ，就可以得到h a 的產(chǎn)量。 h a 得率= ；：i 需蘭h 壘a 耄：；燃x t o o 處理前含量樣品液體積 7 2 透明質(zhì)酸分子量的測(cè)定 高粘度是h a 溶液的最重要的物理性質(zhì)之一，其分子量越大，粘度越高研 究發(fā)現(xiàn)，多種高分子聚合物的特性粘度n 】的對(duì)數(shù)值，與其分子量的對(duì)數(shù)值成線 性關(guān)系：【n = k m r ，k 和a 為常數(shù)，在一定測(cè)定條件下，只與聚合物的種類有關(guān)， 每種聚合物都有特定的k 值和a 值。對(duì)于h a 來(lái)說(shuō)，其k 值和a 值主要與溶劑的 離子強(qiáng)度和測(cè)定溫度有關(guān)，在通常的測(cè)定條件下，k 值取0 0 3 6 ，a 值取o 7 8 。 采用一點(diǎn)法測(cè)量【3 6 1 。將樣品配成一定濃度，使得n r _ 1 3 0 1 5 0 按多點(diǎn)法測(cè) 定樣品液的相對(duì)粘度r t ，和比粘度n 。，按下式計(jì)算特性粘度： 【r 】- 1 f , 2 1 , 7 。一l n r ，) 然后按照公式h 】= o 0 3 6 m o7 8 計(jì)算分子量 分子量損失率；( 1 一竺墨生坌王量) 。1 0 0 7 3 蛋白含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法”1 ，以牛血清蛋白( b s a ) 為標(biāo)準(zhǔn)品。 7 3 1 標(biāo)準(zhǔn)益線的繪制 配含牛血清蛋白o(hù) ，5 ，1 0 ，2 0 ，4 0 。6 0 p g 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入考馬斯亮藍(lán)試 液4 m l ，立即混勻，5 m i n 后在5 9 5 n m 波長(zhǎng)處用l c m 比色池測(cè)定吸光度，以b s a 微克 數(shù)對(duì)吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 o1 02 03 04 05 06 07 0 u g 圖2 2 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線 f i 9 2 2 s t a n d a r dc u r v eo f p r o t e i n 7 3 2 樣品測(cè)定 樣品測(cè)定是取h a 5 0 0 m g 精密稱定，置于l o o m l 量瓶中，加水溶解至刻度，取l m l 于具塞試管中，以下同標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到蛋白質(zhì)的質(zhì)量，以 此計(jì)算h a 樣品的蛋白質(zhì)含量。 蛋白去除率：( 1 一竺翌星蘭魚(yú)魚(yú)量! 堂曼墊堡墼) 。1 0 0 處理前蛋白含量樣品液體積 7 4 菌體量測(cè)定 分光光度計(jì)法 在九= 6 6 0 n m 的條件下測(cè)定菌體的光密度。 7 5 紅外光譜 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均采用k b r 壓片，用e q u i n o x 紅外分光光度計(jì)，在 4 0 0 0 - - - 4 0 0 c m 。范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。 7 。6 紫外光譜 分別將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品配成2 5 r a g 1 的水溶液，用u v - - p c i 6 0 1 紫外分光光度 計(jì)，在波長(zhǎng)2 0 0 - - 4 0 0 n m 范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。 1 4 4 5 3 5 2 5 l 5 0 吣c；呲m叭n郵 凸o 1 h a 的發(fā)酵工藝 第三部分結(jié)果與討論 h a 發(fā)酵的一般工藝流程為：試管菌署中接入三角搖瓶中3 7 c 振蕩培養(yǎng)8 h ， 按入種子罐中，接種比例為5 左右，培養(yǎng)8 h ，鏡檢確認(rèn)菌體生長(zhǎng)良好、無(wú)雜菌 后，接入發(fā)酵罐中，接種比例為5 左右。采用通氣式分批補(bǔ)料發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程 中，維持p h 為7 0 、攪拌轉(zhuǎn)速7 0 0 r r a i n 、葡萄糖含量4 ，沒(méi)小時(shí)取樣檢測(cè)h a 含量和菌體密度等。菌體密度( 以o d 6 6 0 來(lái)表示) 及h a 的產(chǎn)量和分子量隨時(shí)間 變化的情況見(jiàn)圖3 1 、3 2 。 8 6 o 鎏4 。 2 0 012 3 456 7 8 91 01 l1 21 31 4 】51 6 t i m e ( h ) 圖3 1 發(fā)酵生長(zhǎng)曲線 m 9 3 1t h ep r o f i l e so f h af e r m e n t a t i o n t i m e ( h ) 一m 含量- - 一分子量 圖3 2 姒含量和分子量的變化 f i g s 2 t h ec h a n g eo f h ac o n c e n t r a t i o na n dm o l e c u l a rw e i g h t 結(jié)果表明，在發(fā)酵至1 6 h 時(shí)，h a 含量和分子量達(dá)到最大，可放罐，褥到的 發(fā)酵液h a 濃度在4 9 l 左右，分子量為2 0 2 2 1 0 6 d a ，蛋白含量為2 5 左右。 2 發(fā)酵液的預(yù)處理 h a 發(fā)酵液粘稠，不易將h a 與菌體快速有效地分離，而菌本身產(chǎn)生的透明 質(zhì)酸酶，會(huì)使h a 降解，從而降低h a 的分子量。因此在從發(fā)酵液中提取h a 之 前，需要對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，使其中的透明質(zhì)酸酶失活，防止h a 分子量損失。 故分別研究比較了熱處理法和酸處理澍5 1 使酶變性失活的最適條件。 2 1 熱處理 2 1 1 最佳熱處理溫度的選擇 加熱可使透明質(zhì)酸酶失活，但溫度過(guò)高會(huì)引起糖苷鍵的降解而使h a 分子量 降低，而溫度過(guò)低則酶不會(huì)完全滅活，故選擇合適的預(yù)處理溫度對(duì)h a 分子量的 影響較大。將發(fā)酵液( h a 分子量約2 0 1 0 6 d a ) 用不同的溫度熱處理1 h ，冷卻 至室溫，測(cè)分子量，計(jì)算各處理溫度下h a 分子量的損失率，并以標(biāo)準(zhǔn)h a ( 分 子量約1 8 1 0 6 d a ) 作對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表3 1 。 表3 1 熱處理溫度對(duì)h a 分子量損失率的影響 t a b3 1 t h ee f f e c to f t h e r m o - t r c a t m e n tt e m p e r a t u r e s o i lt h el o s sr a t eo f m o l e c u l a rw e i g h to f h a 由表可知，標(biāo)準(zhǔn)h a 溶液，處理溫度在5 0 。c 7 0 c 時(shí)，h a 的分子量損失 較小，當(dāng)溫度升高到8 0 時(shí)，分子量的損失率升高，說(shuō)明在高溫條件下，h a 會(huì) 發(fā)生降解。發(fā)酵液的h a ，處理溫度為5 0 、6 0 時(shí)，分子量的損失較大，7 0 c 時(shí)降低，8 0 時(shí)分子量損失率又升高。比較兩組樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)處理溫 度為5 0 0 、6 0 0 ，標(biāo)準(zhǔn)h a 的分子量損失率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于發(fā)酵液中h a 的分子量損 失，這是由于發(fā)酵液中的酶沒(méi)有完全失活，而使h a 降解所致；而當(dāng)處理溫度為 7 0 、8 0 時(shí)，兩者的分子量損失率接近，推測(cè)在該溫度下，發(fā)酵液中的酶基本 失活，h a 分子量的損