畢 業(yè) 設(shè) 計 （論 文）題 目：轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻中重金屬鉛、鎘、銅、鉻、鐵含量的測定英文題目：determination of pb, cd, cu, cr and fe in transgenic insect-resistant rice by atomic absorption spectrometry學(xué)生姓名 學(xué) 號 指導(dǎo)老師 職稱 專 業(yè) 二 零 零 九 年 四 月 十 日graduation project (paper)title: determination of pb, cd, cu, cr and fe in transgenic insect-resistant rice by atomic absorption spectrometryname number instructor title r major food nutrition and detection on april 10，2009東華理工大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（論文） 摘要轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻中重金屬鉛、鎘、銅、鉻、鐵含量的測定摘要：本實驗對轉(zhuǎn)bt抗蟲品種的轉(zhuǎn)基因水稻進行濕法消解預(yù)處理，處理液采用石墨爐和火焰原子吸收光譜法進行檢測，測定重金屬鉛、鎘、銅、鉻、鐵的含量，并做加標(biāo)回收實驗。按照相同方法處理非轉(zhuǎn)基因水稻，并測定其重金屬的含量，通過比較，發(fā)現(xiàn)該品種的轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)基因水稻中這五種重金屬的含量沒有明顯差別。關(guān)鍵詞: 轉(zhuǎn)基因水稻 ；重金屬；原子吸收光譜法 i東華理工大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（論文） abstractdetermination of pb, cd, cu, cr and fe in transgenic insect-resistant rice by atomic absorption spectrometryabstract ：a simple procedure was developed to determine contents of heavy metals in bt to transgenic insect-resistant rice varieties. after wet digestion of samples, five heavy metals, such as pb, cd, cu, cr and fe were determined by flame atomic absorption spectrometry (faas)or graphite furnace atomic absorption spectrometry (gfaas) with regard to their concentrations, respectively. the experimentsof standard addition were carried out to validate the proposed method, and good recoveries are present. according to theobtained concentrations of pb, cd, cu, cr and fe in the transgenic rice and the non-transgenic rice, a conclusion canbe made that there is no obvious difference in the contents of heavy metals between the two types of tested samples. key word: transgenic rice ; heavy metals；atomic absorption spectrometry24東華理工大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（論文） 緒論 目 錄摘要關(guān)鍵詞abstract keywords緒論11轉(zhuǎn)bt抗蟲品種的轉(zhuǎn)基因水稻的介紹和研究現(xiàn)狀. 11.1轉(zhuǎn)bt抗蟲品種的轉(zhuǎn)基因水稻的介紹11.2轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的研究進展22重金屬檢測方法研究42.1樣品前處理.42.2檢測方法.53本研究的目的意義.81 實驗部分91.1儀器和試劑91.1.1儀器91.1.2試劑和材料91.2 實驗方法91.2.1原料處理91.2.2樣品測定條件91.2.3樣品預(yù)處理111.2.4工作曲線的繪制121.2.5樣品測定121.2.6數(shù)據(jù)分析122實驗結(jié)果與分析122.1測定條件的優(yōu)化.122.1.1鉛、鎘、銅和鉻測定條件的優(yōu)化. 122.12鐵測定條件的優(yōu)化.142.2共存離子干擾.152.3檢出限及精密度.152.4樣品測定結(jié)果.163結(jié)論164發(fā)展前景17致謝.18參考文獻19緒論:隨著對轉(zhuǎn)基因食品研究的不斷深入，人們逐漸認識到轉(zhuǎn)基因食品是一把“雙刃劍”，在帶來巨大經(jīng)濟效益的同時，也帶來一些負面問題，尤其是人們?nèi)找骊P(guān)注的食品安全問題1-2。轉(zhuǎn)基因食品中重金屬含量的檢測及影響也逐漸引起人們的關(guān)注。diopan 等3研究表明，mt- 轉(zhuǎn)基因植物能評價重金屬累積的能力；芮玉奎等4借助icp-ms 測定轉(zhuǎn)基因玉米及其親本中重金屬的含量。結(jié)果顯示，外源基因的整合導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因玉米重金屬(ni、c u 、cd 、as 、cr 、z n 和hg) 含量顯著低于親本對照，兩對轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米及其親本對比結(jié)果相似；但是有的重金屬(v、co、pb)含量與對照相比變化沒有明顯規(guī)律；他還系統(tǒng)研究了轉(zhuǎn)基因棉花和對照纖維中重金屬含量影響結(jié)果說明，外源基因的導(dǎo)入能夠顯著改變轉(zhuǎn)基因棉花纖維中微量元素和重金屬的累積5。目前我國對水稻的轉(zhuǎn)基因研究相當(dāng)活躍，水稻的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)也已經(jīng)比較成熟6。水稻作為人類主要糧食作物之一，直接參與人的食物鏈，也就是說水稻中的重金屬也會進入人體并有可能蓄積。國內(nèi)外學(xué)者曾對非轉(zhuǎn)基因的水稻進行過研究7，但有關(guān)轉(zhuǎn)基因水稻中重金屬含量的研究目前尚未見報道。本實驗采用濕法消解-原子吸收光譜法測定轉(zhuǎn)bt抗蟲品種的轉(zhuǎn)基因水稻中的鉛、鎘、銅、鉻、鐵五種重金屬的含量，并做了加標(biāo)回收實驗。用相同的方法處理及測定非轉(zhuǎn)基因水稻中五種重金屬的含量，通過兩者結(jié)果進行比較，分析它們積累重金屬的能力差別，以此為轉(zhuǎn)基因水稻的食用安全性提供基本的參考依據(jù)。轉(zhuǎn)bt抗蟲品種的轉(zhuǎn)基因水稻的介紹和研究現(xiàn)狀轉(zhuǎn)bt抗蟲品種的轉(zhuǎn)基因水稻的介紹 在過去的30 多年中,國際水稻所對30 000 多份水稻品種資源進行了抗蟲鑒定,但沒有發(fā)現(xiàn)一份理想的抗螟蟲材料。隨著植物細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展,利用生物基因工程技術(shù)將外源抗蟲基因?qū)胨?使水稻自身產(chǎn)生抗蟲蛋白而達到抗蟲目的成為可能,這項研究吸引了國內(nèi)外眾多科學(xué)家。生物工程技術(shù)是傳統(tǒng)作物改良方法的補充和完善,它使得任何兩個物種都可自由地得到彼此基因庫的基因而不受進化方式或血緣關(guān)系的限制。國家自然科學(xué)基金會把轉(zhuǎn)基因技術(shù)列為我國植物遺傳學(xué)和植物遺傳改良的近中期戰(zhàn)略目標(biāo)與研究重點8 。在本世紀80 年代初,人們克隆了幾種蘇云金桿菌基因,并把這些基因?qū)肓藷煵?、西紅柿等高等植物,但由于所得轉(zhuǎn)基因植株的b. t . 毒蛋白基因轉(zhuǎn)錄的mrna 不穩(wěn)定,以及翻譯水平低等原因,轉(zhuǎn)基因植物的殺蟲能力較低。90 年代以來,科學(xué)家們對b. t . 毒蛋白基因進行了修飾,逐步提高了b. t . 基蛋白基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達水平911 。蘇云金桿菌( bacillus thuringiensis ,簡寫為b. t . ) 是一種能產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白的土壤桿菌。這種細菌作為一種生物殺蟲劑已使用了近30 年。b. t . 能產(chǎn)生一種使害蟲消化道喪失功能的蛋白質(zhì),害蟲取食后在堿性的腸道中被溶解為前毒素單體,然后經(jīng)腸道蛋白酶活化降解成具有毒性的多肽,活化的毒素作用于中腸上皮細胞,從而引起明顯的病理變化,例如腸細胞壁破裂,腸壁崩裂12 。目前,從b. t . 克隆的cryl (a) b 和cryl (a) c 基因用于導(dǎo)入水稻,這兩個基因僅3端的495 個堿基存在差異10 。轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的研究進展比利時adang 在1985 年首次報道了轉(zhuǎn)b. t . 基因的煙草植株 ,之后美國孟山都公司、中國農(nóng)科院以及江蘇農(nóng)科院經(jīng)作所也先后把b. t . 基因?qū)朊藁ā?989 年中國農(nóng)科院生物技術(shù)中心楊虹等首次報道了用原生質(zhì)體電融合技術(shù)將b. t . 基因?qū)胨尽芭_粳209” ,1991年謝道昕又用花粉管通道技術(shù)將b. t . 基因?qū)胨驹耘嗥贩N“中花11 號”。楊虹、謝道昕所用b. t . 基因是直接從蘇云金桿菌中分離純化得到的,經(jīng)分子生物學(xué)檢驗,證明b. t . 基因已整合到水稻基因組中13 。但是,這些開創(chuàng)性的研究未見后續(xù)報道。日本植物研究科學(xué)家fujimoto1993 年用原生質(zhì)體電激法獲得了轉(zhuǎn)b. t . 基因粳稻植株,并檢測出b. t . 蛋白量占可溶性總蛋白的0. 05 % ,對水稻二化螟和縱卷葉螟二齡幼蟲的最高致死率分別達45 %和55 % ,并首次報道了經(jīng)修飾的cryl (a) b 基因能在轉(zhuǎn)基因植株中高效表達,并能穩(wěn)定地遺傳到r2代,也首次提出了昆蟲對b. t . 基因產(chǎn)生抗性的預(yù)防策略 9 。瑞士蘇黎士植物科學(xué)研究所wnn1996 年報道了用基因槍法將cryl (a) b 基因?qū)攵i稻“ir58”,在r0 、r1 、r2代對鱗翅目水稻害蟲有明顯殺蟲效果,對二化螟、三化螟的最高致死率為100 % ,并從葉片中檢測出b. t . 蛋白量占可溶性蛋白的0. 009 % ,還指出b. t . 蛋白表達量隨著水稻的生長發(fā)育而呈逐漸增加的趨勢14 。印度持續(xù)農(nóng)業(yè)與農(nóng)村發(fā)展研究中心nayak 1997 年報道了用基因槍法將cryl (a) c 基因?qū)攵i稻“ir64”,同時選擇了玉米ubi 基因(玉米泛素轉(zhuǎn)移蛋白基因) 作為cryl (a) c 的啟動子。研究指出cryl (a) c基因在“ir64”中表達更有效,檢測出毒蛋白量約為可溶性蛋白的0. 02 %0. 025 % ,對三化螟的最高致死率為92. 4 % ,并對cryl (a) c 基因的遺傳行為作了研究,f1測交抗感比例為11 ,f1自交f2抗感比例為31 ,故cryl (a) c 基因表現(xiàn)為單基因顯性遺傳15 。國際水稻所( irri) ghareyazi1997 年報道了用基因槍法得到轉(zhuǎn)cryl (a) b 基因的香粳品系“827”,能表達分子量為67kda 的毒素蛋白,表達量相當(dāng)于可溶性蛋白的0. 1 % ,t2代植株葉片對一齡二化螟、三化螟有高度抗性,同時, irri 的這項研究用玉米c4pep 羧化酶基因為啟動子,并指出該啟動子使cryl (a) b 基因在水稻籽粒灌漿期功能葉片中高效表達,而在水稻籽粒中即胚和胚乳中不表達,這項研究結(jié)果對解決人類食用抗蟲水稻稻谷的安全性問題提供了思路16 。1998 年加拿大渥太華大學(xué)生化系農(nóng)業(yè)生物技術(shù)實驗室cheng 等報道,用“農(nóng)桿菌介導(dǎo)法”將以玉米ubi 基因為啟動子的cryl (a) b、cryl (a) c 基因?qū)胨?獲得了b. t . 蛋白高效表達的轉(zhuǎn)基因植株。在r0代檢測出高達1 %3 %的可溶性蛋白含量,較以往的報道高出10100倍,r1代植株高抗二化螟、三化螟,致死率為97 %100 %10 。浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)1998 年也用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功地將加拿大渥太華大學(xué)惠贈的b. t . 基因?qū)胨驹耘嗥贩N“秀水11”,并獲得穩(wěn)定的b. t . 轉(zhuǎn)基因品系“ts5”、“ts9”,并檢測出b. t . 毒蛋白的含量占可溶性蛋白的0. 5 %3 % ,對二化螟、稻縱卷葉螟的15 齡幼蟲有100 %的毒殺作用。遺傳研究認為轉(zhuǎn)基因表現(xiàn)為單位點顯性遺傳,并首次報道了轉(zhuǎn)基因已穩(wěn)定地遺傳到第5代11 。渥太華大學(xué)和浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)所得轉(zhuǎn)基因品系b. t . 毒蛋白的高效表達,可能與所用轉(zhuǎn)基因技術(shù)、啟動子、b. t . 基因中g(shù)+ c 堿基含量等因素有關(guān)。此外,1997 年國際水稻所植物遺傳育種和生物化學(xué)系報道了用基因槍法把以水稻actl 基因作為啟動子的b. t . 基因?qū)刖酒贩N“臺粳309”,對三化螟高抗,最高致死率為100 %。同年中國中山大學(xué)生物工程中心許新萍也報道了將以actl 為啟動子的cryl (a) b 基因?qū)搿芭_粳309”。這兩篇報道都沒有檢測轉(zhuǎn)基因植株的b. t . 毒蛋白表達量,對所用的啟動子的應(yīng)用前景未作評價。綜上所述,自80 年代以來,國內(nèi)外的轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻育種研究發(fā)展經(jīng)歷了3 個階段,即應(yīng)用野生型b. t . 基因階段、對b. t . 基因進行修飾階段和啟動子選擇階段,通過這些研究,逐步提高了轉(zhuǎn)基因水稻的抗蟲水平。但從事這些研究的人員主要是分子生物學(xué)家,缺乏遺傳育種和昆蟲專家參與合作,故對育種利用有關(guān)的遺傳問題及開發(fā)這些轉(zhuǎn)基因材料的實用價值未作深入研究。重金屬檢測方法研究 目前,重金屬尚沒有嚴格的統(tǒng)一定義,一般指比重大于5 的金屬,約有45 種,如銅、鉛、鋅、鐵、鈷、鎳、錳、鎘、汞、鎢、鉬、金、銀等。盡管錳、銅、鋅等重金屬是生命活動所需要的微量元素,但大部分重金屬如汞、鉛、鎘等并非生命活動所必需,而且所有重金屬超過一定濃度對人體都有毒。在環(huán)境污染方面的重金屬主要是指汞、鎘、鉛、鉻以及類金屬砷等生物毒性顯著的重金屬元素。如果重金屬元素未經(jīng)處理就直接排入河流、湖泊或海洋,或者進入土壤中,由于它們不能被生物降解而使這些河流、湖泊、海洋和土壤受到污染。在食物鏈的生物放大作用下,它們成千百倍地富集,最后進入人體。如魚類或貝類積累的重金屬被人類所食,或重金屬被稻谷、小麥等農(nóng)作物吸收后被人類食用,重金屬就會進入人體,使人產(chǎn)生重金屬中毒,輕則發(fā)生怪病(水俁病、骨痛病等) ,重則導(dǎo)致死亡。其次,重金屬在人體內(nèi)能和蛋白質(zhì)及酶等發(fā)生強烈的相互作用,使它們失去活性,也可在人體的某些器官中累積,造成慢性中毒,重金屬超標(biāo)引起的中毒事件不勝枚舉。樣品前處理在樣品中,重金屬一般以化合態(tài)形式存在。因此,在檢測時需要對樣品進行前處理,使重金屬以離子狀態(tài)存在于試液中才能進行客觀準(zhǔn)確地分析。此外,樣品的前處理是為了去除干擾因素,保留完整的被測組分,或使被測組分濃縮。傳統(tǒng)的方法主要有濕法消化和干法灰化。濕法消化是在適量的食品樣品中加入硝酸、高氯酸、硫酸等氧化性強酸,結(jié)合加熱來破壞有機物。由于高氯酸濕法消解便于普及,已被廣泛采用。但在消化過程中,該法易產(chǎn)生大量的有害氣體,存在爆炸的潛在危險;同時,在消解過程中要消耗大量的酸而可能引起較大的空白值。干法灰化是在高溫灼燒下使有機物氧化分解,剩余的無機物供測定。此法能降低污染,但消化周期長、耗電多、被測成分易揮發(fā)損失;坩堝材料有時對被測成分有吸留作用,致使回收率降低,因此又有很多改進的干法與濕法處理過程。微波消解作為樣品分析的新技術(shù),由于具有消化樣品能力強、速度快、消耗化學(xué)試劑少、金屬元素不易揮發(fā)損失、污染小及空白值低等優(yōu)勢,一次樣品處理后就可同時測定幾種元素。通常取很少量即可達到分析的靈敏度,如王國玲等人用微波消解結(jié)合原子熒光光譜法測定化妝品中的鉛,方法簡便快捷、精密度和準(zhǔn)確度好、靈敏度高、線性范圍寬以及節(jié)省試劑等特點適用于各類化妝品中鉛量的測定17。軍國建立了一種梯度升壓微波消解樣品、氫化物原子英光光度法同時測定水樣中的砷、汞方法。在優(yōu)化條件下,水樣中砷的回收率為95. 9 % 102 %、汞的回收率為98 % 105 %18,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7 %。李俊玲等應(yīng)用微波消解前處理測定保健食品中鉛、砷和汞的含量。同時將本方法測定結(jié)果與國標(biāo)法規(guī)定的方法進行比較,差異無顯著性,但是本方法要簡便得多,便于一般實驗室進行保健食品的定量分析19。檢測方法1、原子熒光光度法(afs) 是通過測量待測元素的原子蒸汽在輻射能激發(fā)下所產(chǎn)生熒光的發(fā)射強度來測定待測元素的一種分析方法。翟毓秀等人應(yīng)用afs 2201 型雙道原子熒光光譜儀進行了氫化物發(fā)生原子熒光法測定食品和飼料中的鉛。采用高氯酸做介質(zhì),并對各種最佳分析條件進行了探討和驗證。檢出限為0. 3ug/l , 線性范圍為1. 00 500ug/ l , 回收率為87 %98 %。原子熒光光度法的檢出限低于原子吸收法,譜線簡單且干擾少,但線性范圍較寬,應(yīng)用元素有限,僅用于砷、銻、秘、硒、磅、鍺、錫、鉛、鋅、錫、汞的分析。2、火焰原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法是基于物質(zhì)所產(chǎn)生原子蒸汽對特定譜線（通常是待測元素的特征譜線）的吸收作用來進行定量分析的一種方法。火焰原子化法是使試液變成原子蒸汽的一種理想方法。火焰原子吸收分光光度法操作較簡單，測試速度快，對大多數(shù)元素有較高的靈敏度和檢測極限但檢出限較高等優(yōu)點，因而至今使用仍最廣泛。3、石墨爐原子吸收分光光度法石墨爐原子吸收分光光度法與火焰原子吸收分光光度法同屬原子吸收分光光度計法，只是兩者使試樣原子化的方法不同，石墨爐原子吸收分光光度法屬于無火焰原子化。該方法具有較高的原子化效率、靈敏度高和低檢出限，因而發(fā)展很快。4、電感藕合等離子體質(zhì)譜( icp ms) 分析技術(shù)將電感藕合等離子體與質(zhì)譜聯(lián)用,利用電感藕合等離子體使樣品汽化,將待測金屬分離出來,從而進人質(zhì)譜進行測定。icyms 可通過離子荷質(zhì)比進行無機元素的定性分析、半定量分析、定量分析,同時進行多種元素及同位素的測定、可激光采樣、氫化物發(fā)生、低壓色譜、高效液相色譜、氣相色譜、毛細管電泳等進樣或分離技術(shù)聯(lián)用,具有比原子吸收法更低的檢測限,是痕量元素分析領(lǐng)域中最先進的方法,但其價格昂貴,易受污染,可用于除汞以外的絕大多數(shù)重金屬的測定。5、電感藕合等離體原子發(fā)射光譜( icp aes) 高頻感應(yīng)電流產(chǎn)生的高溫將反應(yīng)氣加熱、電離,利用元素發(fā)出的特征譜線進行測定譜線強度與重金屬量成正比。icp aes 具有靈敏度高,干擾小,線性寬,可同時或順序測定多種金屬元素,有對高溫金屬元素進行快速分析的特點。但檢測靈敏度較icp ms 略差,可用于除鎘、汞等絕大部分金屬元素的測定。近年來新發(fā)展的技術(shù)置矩端視icp aes ,采用軸向測光,增強了取樣信號量,提高了靈敏度和信噪比。而流動注入( fi hg) 進樣技術(shù)與icp aes 儀器聯(lián)用,有效地解決了其試劑用量大、靈敏度低的問題。陳世忠采用該法測定黃姜中微量元素,獲得砷、銻和鉍的檢出限分別為1. 810 - 9 、2. 4 10 - 9和3. 1 10 - 9 ,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)分別為3. 3 %、5. 4 %和4. 0 % , 回收率為90 % 108 %20 。6、高效液相色譜法痕量金屬離子與有機試劑形成穩(wěn)定的有色絡(luò)合物,然后用hplc 分離,紫外可見檢測器檢測,可實現(xiàn)多元素同時測定。卟啉類試劑具有靈敏度高,能和多種金屬元素生成穩(wěn)定的絡(luò)合物,目前已廣泛用作hplc 測定金屬離子的衍生試劑。但絡(luò)合試劑的選擇有限,給hpcl 的廣泛應(yīng)用帶來了局限性。7、酶抑制法隨著人們對環(huán)境質(zhì)量的要求不斷提高,需要建立現(xiàn)場快速檢測重金屬的方法,因此環(huán)境污染物的快速檢測技術(shù)應(yīng)運而生。與傳統(tǒng)檢測技術(shù)相比,雖然對環(huán)境污染物的檢測只能定性,靈敏度和準(zhǔn)確性也低于傳統(tǒng)檢測技術(shù),但是快速檢測技術(shù)具有方便、快速、經(jīng)濟的優(yōu)點,非常適合現(xiàn)場檢測。酶抑制法測定重金屬的基本原理就是重金屬離子與形成酶活性中心的巰基或甲巰基結(jié)合后,改變了酶活性中心的結(jié)構(gòu)與性質(zhì),引起酶活力下降,從而使底物酶系統(tǒng)中的顯色劑顏色、ph、電導(dǎo)率和吸光度等發(fā)生變化,這些變化可直接通過肉眼或借助于電信號、光信號等加以區(qū)別。與傳統(tǒng)的重金屬分析方法相比,酶抑制法具有快速、簡便、對所分析的樣品需要量少等優(yōu)點,受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。目前用于痕量重金屬測定的常用酶有脲酶、過氧化物酶、黃嘌呤氧化酶、葡萄糖氧化酶、丁肽膽堿脂酶和異檸檬酸脫氫酶等。由于脲酶廉價易得,故使用最廣泛。脲酶抑制法也可與薄層色譜法聯(lián)_合測定重金屬含量,檢測限可達0. 02 3ug/ l ,其中檢測限較低的是hg2 + ,cu2 + 和ag + ,分別為0. 02ug/ l 、0. 06ug/ l和0. 13ug/ l ,對氯化甲基汞和乙酸苯汞等有機汞化合物的檢測限為0. 03ug/ l 。此外,脲酶測溫滴定法和電勢滴定法分別可以測定濃度為1mg/ l 的ag+和1 10mg/ l 的cd2 + 。重金屬對酶的抑制效應(yīng)往往與它們的生物毒性相關(guān),因此酶抑制法還可用于對污染環(huán)境重金屬的風(fēng)險評價。此外,使用傳感器件還能放大重金屬離子對酶的抑制效應(yīng),從而大幅度提高檢測靈敏度。8、免疫分析法免疫分析法是一種具有高度特異性和靈敏度的分析方法,在環(huán)境分析領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。用免疫分析法對重金屬離子進行分析,首先必須進行兩方面的工作:第一是選用合適的絡(luò)合物或其它化合物與金屬離子結(jié)合,使其獲得一定空間結(jié)構(gòu),從而產(chǎn)生反應(yīng)原性;第二是將結(jié)合了金屬離子的化合物連接到載體蛋白上,產(chǎn)生免疫原性,其中與金屬離子結(jié)合的化合物的選擇是能否制備出特異性抗體的關(guān)鍵。wiley d e 等21最先用谷胱甘肽hg 復(fù)合物免疫小鼠制備了2 株對hg( ) 有特異性的單克隆抗4a10 和1f10。酶聯(lián)免疫吸附實驗( elisa) 表明,對兩株抗體汞的解離常數(shù)分別為2. 3nmol/ l 和3. 7nmol/ l ,谷胱甘肽、其它金屬陽離子和抗體均不發(fā)生交叉反應(yīng)。blake d a 等22發(fā)現(xiàn),金屬絡(luò)合物也可以被用來作免疫動物制備金屬的特異性抗體,因此只要少數(shù)幾種絡(luò)和劑就可完成多數(shù)重金屬離子單克隆抗體的制備和樣品的免疫分析。但是,金屬離子單克隆抗體的制備非常困難,而較容易制備的多克隆抗體又難以滿足對金屬離子的特異性要求,這在很大程度上限制了汞等重金屬離子的免疫分析方法的研究與發(fā)展。9、生物傳感器近20 年來,人們不斷開發(fā)多種生物傳感器用于測定水溶液中的毒性化合物,因此研制酶傳感器來檢測環(huán)境重金屬成為生物傳感器研究熱點。本研究的目的和意義雖然高效液相色譜法、共振瑞利散射法具有分離能力好、靈敏度高、分析速度快、操作方便等優(yōu)點，但儀器過于昂貴、使用費用高。電感耦合等離子體發(fā)射光譜法雖具有檢出限低，檢出靈敏度高，分析精密度高，分析動態(tài)范圍小，基體效應(yīng)小等優(yōu)點，但以icp為原子化器的原子熒光光譜儀對難熔元素的測定靈敏度不高。若采取極譜法和比色法, 在分析測定過程中都需用硫酸、硝酸或高氯酸, 試劑用量大， 分析速度慢，手續(xù)沉長， 且污染環(huán)境1- 2。經(jīng)過多種方法對比，本實驗采用濕法消解-原子吸收光譜法測定轉(zhuǎn)bt抗蟲品種的轉(zhuǎn)基因水稻中的鉛、鎘、銅、鉻、鐵五種重金屬的含量，并做了加標(biāo)回收實驗。用相同的方法處理及測定非轉(zhuǎn)基因水稻中五種重金屬的含量，通過兩者結(jié)果進行比較，分析它們積累重金屬的能力差別，以此為轉(zhuǎn)基因水稻的食用安全性提供基本的參考依據(jù)。1 實驗部分1.1儀器和試劑1.1.1儀器實驗室常規(guī)玻璃器皿，使用前先用自來水洗凈，然后在hno3 (10%)中浸泡2 4 h 以上，再用去離子水沖洗。儀器名稱儀器型號生產(chǎn)廠家原子吸收光譜儀(配有g(shù)fh-986石墨爐)tas-986北京普析通用儀器有限公司電子天平bs-223s北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司真空干燥箱2k-2bs天津市中環(huán)實驗電爐有限公司高速組織搗碎機ds-1上海標(biāo)本模型廠水循環(huán)式真空泵shz-iii上海亞榮生化儀器廠電熱板db-2常州德華電器有限公司純水儀milli-qmillipore公司數(shù)字式移液器finnpipette上海雷勃分析儀器公司1.1.2試劑和材料原料：轉(zhuǎn)bt抗蟲品種的轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻（由某種子公司提供）試劑名稱規(guī)格生產(chǎn)廠家鉛離子儲備液1 m g / m l鎘離子儲備液1 m g / m l銅離子儲備液1 m g / m l鉻離子儲備液1 m g / m l鐵離子儲備液1 m g / m l硝酸優(yōu)級純國藥集團化學(xué)試劑有限公司30%雙氧水分析純（ar）國藥集團化學(xué)試劑有限公司1.2 實驗方法1.2.1原料處理實驗前先將兩種樣品經(jīng)粉碎機粉碎后，烘干備用。1.2.2樣品測定條件 一、儀器工作條件（1）分析線原子吸收光譜法通常用于低含量的元素分析，一般選擇最靈敏的共振吸收譜線。選擇最適宜的分析線，一般應(yīng)視具體情況由試驗來決定。其方法是：首先掃描空心陰極燈的發(fā)射光譜，了解有幾條可供選擇的譜線，然后噴入適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，觀察這些譜線的吸收情況，選用不受干擾而吸收光度適宜的譜線為分析線。其中吸光度最大的吸收線是最適宜用于測定微量元素的分析線。（2）空心陰極燈的工作電流空心陰極燈一般需要預(yù)熱10 min30 min才能達到穩(wěn)定輸出。空心陰極燈的發(fā)射特性依賴于燈電流。因此，在原子吸收分析中，為了得到較高的靈敏度和精密度，要適當(dāng)選擇空心陰極燈的工作電流。每支陰極燈允許使用的最大工作電流與建議使用的適宜工作電流都標(biāo)示在燈上，對大多數(shù)元素而言，選用的燈電流是其額定電流的40%60%。在這樣的燈電流下，既能達到高的靈敏度，又能保證測定結(jié)果的精密度。（3）狹縫寬度狹縫寬度影響光譜通帶寬度與檢測器接受的能量。通帶寬，光強度大，信噪比高，靈敏度較低，標(biāo)準(zhǔn)曲線容易彎曲；通帶窄，光強度弱，信噪比低，靈敏度高，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性好。一般光源輻射較弱或者共振吸收線強度較弱的情況下，則應(yīng)選擇較窄的狹縫寬度。合適的狹縫寬度可用試驗方法確定：將試樣溶液噴入火焰中調(diào)節(jié)狹縫寬度，測定不同狹縫寬度的吸光度。當(dāng)有其他的譜線或非吸收光進入光譜通帶內(nèi)時，吸光度將立即減少。不引起吸光度減少的最大狹縫寬度，即為應(yīng)選取的合適的狹縫寬度。（4）原子化條件的選擇原子吸收信號大小直接正比于光程中待測元素的原子濃度。因此，原子化條件選擇合適與否，對測定的靈敏度和準(zhǔn)確度具有關(guān)鍵性的影響。在石墨爐原子化法中，合理選擇干燥、灰化、原子化及凈化的溫度與時間是十分重要的。干燥應(yīng)在稍低于溶劑沸點的溫度下進行，防止試液飛濺。灰化的目的是除去基體和局外組分，在保證被測元素沒有損失的前提下應(yīng)盡可能使用較高的灰化溫度。原子化時間的選擇原則是，選用達到最大吸收信號的最低溫度作為原子化溫度。原子化時間的選擇，應(yīng)保證完全原子化為準(zhǔn)。原子化階段停止通保護氣，以延長自由原子在石墨爐內(nèi)的平均停留時間。凈化的目的是為了消除濺留物產(chǎn)生的記憶效應(yīng)，凈化溫度應(yīng)高于原子化溫度。（5）進樣量進樣量過小，吸收信號弱，不便于測量；進樣量過大，在石墨爐原子化法中，會增加凈化的困難。在實際工作中，應(yīng)測定吸光度隨進樣量的變化，達到最大吸光度的進樣量，即為應(yīng)選擇的進樣量。3.6 干擾效應(yīng)及其消除方法原子吸收光譜分析中，總的來說干擾是比較小的。這是由方法本身的特點所決定的。由于該方法采用銳線光源，并應(yīng)用共振吸收線，因此共存元素的相互干擾很小，一般不用經(jīng)過分離就可以測定。這是原子吸收光譜的優(yōu)勢所在。原子吸收光譜儀工作條件見表1。表1 原子吸收光譜儀工作條件元素 波長(nm) 狹縫(nm) 燈電流(ma) 背景校正pb 283.3 0.4 1.5 ycd 228.8 0.4 1.5 ycu 324.7 0.4 2.0 ncr 357.9 0.4 3.0 nfe 248.3 0.4 3.5 y二、 石墨爐升溫程序石墨爐升溫程序見表2 。表2 石墨爐升溫程序元素 干燥 灰化 原子化 凈化pb 110 20/10s* 600 10/20s 1800 0/4s 2100 0/3scd 110 20/10s 600 10/20s 1500 0/4s 1800 0/3scu 110 20/10s 600 10/20s 1800 0/5s 2200 0/2scr 100 20/10s 1000 10/20s 2300 0/4s 2400 0/2s注：fe 采用火焰法測定；c 2h 2 流量：1500 ml/min；燃燒器高度：6mm；*x/ys 表示x 秒升溫到固定值維持y 秒。1.2.3 樣品預(yù)處理準(zhǔn)確稱取0.5 g 水稻種子樣品，放入到100ml 潔凈的錐形瓶中，加入8 m l 濃硝酸，蓋上表面皿，靜置一夜。取下表面皿，放上小漏斗，置于電熱板上，在通風(fēng)櫥中慢慢加熱消解，溫度保持在150250，直至冒白煙，消化液呈透明或略帶黃色，取下放冷，加入2 m l雙氧水(30%)，繼續(xù)加熱直到溶液蒸發(fā)至近干，取下冷卻后用0.5mol/l硝酸溶液將消解液轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中并定容。1.2.4 工作曲線的繪制分別吸取適量1 m g / m l 的鉛、鎘、銅、鉻、鐵標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用0.5mol/l 稀硝酸溶液逐級稀釋成表3 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后在儀器最佳工作條件下進行測定，分別得到上述五種重金屬的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表3 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度編號 pb(ng/ml) cd(ng/ml) cu(ng/ml) cr(ng/ml) fe(g/ml)std1 10 1 10 10 1std2 20 2 20 20 2std3 40 4 40 40 4std4 60 6 60 60 6std5 80 8 80 80 8std6 100 10 100 100 101.2.5 樣品測定用數(shù)字式移液器吸取10l已定容好的樣品消解液在上述實驗條件下進行鉛、鎘、銅、鉻四種重金屬元素石墨爐原子吸收法測定；鐵元素的含量采用空氣- 乙炔火焰原子吸收光譜法測定。再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計算樣品中各金屬元素的含量。1.2.6 數(shù)據(jù)分析采用s a s 軟件分析結(jié)果。2 實驗結(jié)果與分析2.1 測定條件的優(yōu)化2.1.1 鉛、鎘、銅和鉻測定條件的優(yōu)化鉛和鎘測定條件的優(yōu)化：采用文獻23的優(yōu)化條件。銅和鉻測定條件的優(yōu)化：g f a a s 分析最主要的影響因素即為灰化溫度和原子化溫度，它們?nèi)Q于分析物和被測元素的性質(zhì)。要在灰化階段除去基體干擾又要避免目標(biāo)元素的損失。以濃度為100 ng/ml 的銅和鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液為測試溶液，固定各自的原子化溫度分別為1800和2300，選擇合適的灰化溫度；同時固定各自的灰化溫度分別為600 和1000，選擇合適的原子化溫度。結(jié)果如圖1 、2 所示。圖1 銅和鉻的灰化溫度選擇 圖2 銅和鉻的原子化溫度選擇由圖1 可知，cu 在600以上開始揮發(fā)損失；cr在1000以上開始損失，故cu 和cr 的灰化溫度分別選擇為600和1000。由圖2 可見，各元素隨著溫度的升高，吸光度增大?？紤]到過低的原子化溫度和時間會降低吸收信號強度，增大記憶效應(yīng)；過高的原子化溫度和過長的原子化時間又會縮短石墨管的使用壽命，所以選擇cu 和cr 的原子化溫度分別為1800和2300。在選擇的溫度條件下，原子化比較充分，同時又節(jié)約了電能和延長石墨管的壽命。2.1.2 鐵測定條件的優(yōu)化調(diào)節(jié)乙炔氣體流量，其他條件不變，f e 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為10mg/l，考察吸光度隨助燃比的變化；同時改變?nèi)紵鞲叨?，其他條件不變，考察吸光度隨燃燒器高度的變化。結(jié)果如圖3 、4 所示。圖3 乙炔流量對吸光度的影響圖4 燃燒器高度對吸光度的影響由圖3 可知，乙炔流量高于1500ml/min 時，吸光度較穩(wěn)定。故選擇乙炔流量為1500ml/min。從圖4 可以看出，當(dāng)燃燒器高度在6 m m 時，待測元素有較高的響應(yīng)值。故本實驗選擇燃燒器高度為6 m m 。2.2 共存離子干擾根據(jù)所測樣品的特點，在上述相同測定條件下，考察了幾種常見離子：k + 、n a + 、c a 2 + 、m g 2 + 、z n 2 + 、mn2 + 和ni 2+ 對本實驗的干擾情況。結(jié)果表明，在誤差 5% 的范圍內(nèi)，k+(106 倍)、na+(106 倍)、ca2+(106倍)、mg2+(104 倍)、zn2+(105 倍)、mn2+(105 倍)、ni2+(105倍) 對10 ng/ml 鉛的測定基本沒有干擾；k+(106倍)、na+(106 倍)、ca2+(106 倍)、mg2+(5 103 倍)、zn2+(104倍)、mn2+(105 倍)、ni2+(104 倍)對10ng/ml 鎘的測定基本沒有干擾；k+(104 倍)、na+(105 倍)、ca2+(2 105 倍)、mg2+(2 105 倍)、zn2+(500 倍)、mn2+(500 倍)、ni2+(500倍)對100 ng/ml 銅的測定基本沒有干擾；k+(105倍)、na+(105 倍)、ca2+(104 倍)、mg2+(104 倍)、zn2+(104 倍)、mn2+(104 倍)、ni2+(104 倍)對100ng/ml 鉻的測定基本沒有干擾；k+(4 103 倍)、na+(4 103 倍)、ca2+(4 103 倍)、mg2+(100 倍)，zn2+(800 倍)、mn2+(300 倍)、ni2+(400 倍)對5g/ml 鐵的測定基本沒有干擾。2.3 檢出限及精密度在與前面相同的工作條件下，對試劑空白溶液進行11 次吸光度的測定，根據(jù)dc=3 c/a(噪聲標(biāo)準(zhǔn)差的3 倍) ，求出各元素的儀器檢出限。式中，為測定空白樣品的信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差；c/a 為低濃度區(qū)校正曲線的斜率。再以0.5g 樣品，定容10ml 計，換算為本方法測定水稻種子的檢出限。所得結(jié)果見表4 。表4 各元素的線性范圍、回歸方程、檢出限及精密度 (n=11)元素 線性方程 線性范圍 相關(guān)系數(shù) 檢出限 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (ng/ml) (r) (%)pb y=0.0038x+0.0426 10100 0.9996 2.2ng/ml 44ng/g 7.0cd y=0.0206x+0.0305 110 0.9971 0.8ng/ml 16ng/g 11.0cu y=0.0029x+0.0472 10100 0.9966 12.2 ng/ml 244ng/g 12.0cr y=0.0049x+0.0497 1080 0.9971 15.9 ng/ml 318ng/g 5.6fe y=0.0106x+0.0191 110(g/ml) 0.9954 0.3g/ml 6g/g 2.02.4 樣品測定結(jié)果所測得樣品中五種重金屬的平均含量及加標(biāo)回收實驗結(jié)果見表5 。回收率在81% 120% 之間，測定滿足痕量分析要求。表5 樣品中重金屬含量及加標(biāo)回收結(jié)果(n=3) 轉(zhuǎn)bt抗蟲品種的轉(zhuǎn)基因水稻 非轉(zhuǎn)基因水稻元素 加入值 測定值 回收 加入值 測定值 回收(g/g) (g/g) 率(%) (g/g) (g/g) 率(%)pb 0.00 n d 0.00 n d 0.05 0.0483 96 0.05 0.0412 82cd 0.00 0.0549 0.00 0.0751 0.05 0.1151 120 0.05 0.1212 92cu 0.00 3.42 0.00 2.29 2.00 5.64 96 2.00 4.16 111cr 0.00 1.14 0.00 1.36 2.00 2.75 81 2.00 1.36 84fe 0.00 66.98 0.00 83.02 40.0 109.75 107 40.0 129.25 113注：與非轉(zhuǎn)基因水稻比較：p 0 . 0 5 ；n d ：未檢出。3 結(jié) 論轉(zhuǎn)bt抗蟲品種的轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)基因油水稻中的重金屬鉛均未檢出，其余四種重金屬鎘、銅、鉻、鐵的含量與非轉(zhuǎn)基因油菜籽中的沒有明顯區(qū)別。表明該轉(zhuǎn)bt抗蟲品種的轉(zhuǎn)基因水稻累積吸收這幾種重金屬的能力與非轉(zhuǎn)基因水稻無明顯差別，但是其食用安全性還是應(yīng)當(dāng)引起我們的重視，對于該品種的轉(zhuǎn)基因水稻的食用需要經(jīng)過嚴格審查。4 發(fā)展前景轉(zhuǎn)基因水稻的研究大部分還處在實驗室階段,能大規(guī)模應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因水稻品種還未見報道。近日，涉及上億元資金的國家重大科技專項“轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻新品種培育”課題在華中農(nóng)大啟動。據(jù)該課題第一主持人、華中農(nóng)大生科院教授林擁軍介紹，目前已培育成功的“轉(zhuǎn)bt抗蟲水稻”，其轉(zhuǎn)入的基因是從名為蘇云金芽胞桿菌（bt）的細菌身上分離出來的，對螟蟲等鱗翅目害蟲具有天然且專一的毒殺作用，但對人體安全無毒。自上世紀60年代起，用bt開發(fā)的生物農(nóng)藥已在全世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用，人們常聽說的無公害蔬菜就是用這類農(nóng)藥來防治蟲害的。他說，課題組前期已有了良好的研究基礎(chǔ)，在轉(zhuǎn)基因技術(shù)、新的抗蟲基因的開發(fā)、轉(zhuǎn)基因材料的創(chuàng)制和積累，以及轉(zhuǎn)基因基地建設(shè)等方面進展順利；轉(zhuǎn)bt抗蟲水稻已完成了嚴格的安全評估。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,轉(zhuǎn)基因技術(shù)越趨完善,水稻轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域?qū)訌V泛。水稻轉(zhuǎn)基因不僅能應(yīng)用于農(nóng)業(yè)研究,而且還能應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究(汪開治, 1999) 。將來人們有可能對水稻基因組進行有目的的基因操作,從而加速轉(zhuǎn)基因水稻在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用。東華理工大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（論文） 參考文獻致謝首先非常感謝我的導(dǎo)師劉云海老師，