密級： 論文編號： 中國農業(yè)科學院 博士學位論文 牛結核病 on on 國農業(yè)科學院博士學位論文 摘 要 I 摘 要 牛結核病是 主要 由牛分枝桿菌引起的一種慢性消耗性疾病，在許多國家尤其是發(fā)展中國家仍廣泛流行，該病不僅給畜牧業(yè)造成巨大的經濟損失，而且嚴重威脅 著 人類的身心健康。因此，控制牛結核病對防治人類結核病意義重大。然而，至今仍沒有一種疫苗可用于該病的預防。 本研究利用 術和重疊延伸剪接技術 (by 以牛分枝桿菌 菌株的基因組為模板 ， 擴增 因和 合基因，連接 到 真核表達載體 )中 ，稱 、 稱 、 稱 、簡稱 、 簡稱 、稱 和 稱 。轉染 細胞，檢測目的基因的表達。以各重組質粒和 )及 疫 c 小鼠，免疫 3次，每次間隔 2 周， 1 免后每周以 牛分枝桿菌 純化蛋白衍生物（ 包被抗原，間接 法檢測血清抗體水平 ； 以 牛分枝桿菌 刀豆蛋白 A（ ， 為刺激原， 檢測脾淋巴細胞增殖情 況。 3 免 2 周后以 劑盒檢測脾細胞分泌 的 情況。結果表明， 除 外，其他 各重組質粒免疫后小鼠血清抗體水平持續(xù)上升，與 )對照組和 照組相比差異顯著 （ p 下同。 In p 組別 一免疫一周 一免疫兩周 二免疫一周 二免疫兩周 ) 別 三免疫一周 三免疫兩周 三免疫三周 三免疫四周 ) 國農業(yè)科學院博士學位論文 第二章 牛結核病單價及二價融合 苗的初步研究 30 00 . 40 . 81 . 21 2 3 4 5 6 7 8 ( We e k ) E 6p C A H M D N A + )P 疫小鼠血清抗體動態(tài)變化圖 1he of of 表 1圖 1知，小鼠免疫后除 外其他 苗免疫組的抗體水平均呈現(xiàn)上升趨勢。一免 8 周后 的抗體水平稍低于 和 ； 低于 ； 和 ，因此小鼠經三次免疫后三種雙價融合基因 苗免疫組的血清抗體水平與單基因 苗免疫組無明顯差別，并不比單基 因 苗組高（ p 及空載體和 自始至終都維持在較低的水平。從一免后 2 周開始除 外，其他重組質粒免疫組血清抗體水平與空載體對照組和 照組相比均出現(xiàn)極顯著差異（ p 疫小鼠脾淋巴細胞增殖試驗 分別于一免 2 周，二免 2 周和三免 2 周后處死小鼠，無菌分離脾細胞，制備脾細胞懸液，調整細胞濃度為 1107/入 96 孔細胞培養(yǎng)板中，以牛型 為刺激物， 檢測其增殖活性，結果見表 1圖 1 表 1激后免疫鼠脾淋巴細胞增殖情況 (X1I in X 組別 一免疫 兩周 二免疫兩周 三免疫兩周 Bb ) 國農業(yè)科學院博士學位論文 第二章 牛結核病單價及二價融合 苗的初步研究 31 圖 1激后小鼠脾臟淋巴細胞增殖情況（ X 1he in X 從脾淋巴細胞增殖實 驗的結果（表 1圖 1看，經 激后各重組質粒免疫組T 淋巴細胞的增殖水平始終高于對照組。 激值（ ）在二免 2周時處于較高水平，三免后均稍有下降；而 始終呈上升趨勢；+）組和 始終處于較低水平。一免 2 周后各組之間均無明顯差異（ p 二免 2 周后各重組質粒組與兩對照組相比差異顯著（ p 二免后各重組質粒免疫組的 與對照組相比差異顯著（ p 疫小鼠脾淋巴細胞 分泌情況 三免 2 周后免疫小鼠脾淋巴細胞用牛分枝桿菌 激，收集上清，根據(jù)試劑盒制作標準曲線（圖 1并檢測各組誘生的 水平，結果如表 1圖 1 圖 1鼠 標準曲線 1of pg/ 1000 500 250 125 0 00 . 511 . 522 . 53一免兩周 二免兩周 三免兩周 E 6p C A H M D N A 3 . 1 ( + )P B 第二章 牛結核病單價及二價融合 苗的初步研究 33 表 1疫鼠脾淋巴細胞經 激后 誘生情況 (Xpg/1 in PD Xpg/圖 1 激后小鼠脾淋巴細胞分泌 的量 1he of by PD a： b: c: d: e: f: g: h: )組 i: a： b: c: d: e: f: g: h: ) i: 分析結果表明，經 生后各 苗免疫組小鼠脾淋巴細胞分泌的 的量均 極顯著 高于兩對照組（ p ,下同。 In p 圖 2疫小鼠血清抗 2he of in 組為 組， 組分別為 )組和 組別 一免疫一周 一免疫兩周 二免疫一周 二免疫兩周 A 別 三免疫一周 三免疫兩周 三免疫三周 A B C D E F G 00 . 20 . 40 . 60 . 811 21 . 41 . 61 . 81 2 3 4 5 6 7 ( 第三章 牛結核病融合及多價組合 苗的研究 54 ) 表 2免疫小鼠血清抗 白抗體的 測結果（ ）（ X he of PD in X 圖 2疫小鼠血清抗 體動態(tài)變化圖 of PD in 別 一免疫一周 一免疫兩周 二免疫一周 二免疫兩周 A 別 三免疫一周 三免疫兩周 三免疫三周 A 0 . 10 . 20 . 30 . 40 . 50 . 60 . 70 . 80 . 911 2 3 4 5 6 7 ( 第三章 牛結核病融合及多價組合 苗的研究 55 圖 2鼠 血清 抗 白 態(tài)變化趨勢圖 2he of in 2鼠 血清 抗 態(tài)變化趨勢圖 2he of PD in 組免疫后，以 白為包被抗原進行檢測時的小鼠血清抗體水平均高于以牛分枝桿菌 一免三周開始各疫苗組即與兩對照組表現(xiàn)出極顯著差異 (p 免疫小鼠血清 類檢測結果顯示各疫苗組 有所波動，但一直大于 兩對照組 比值始終保持在 右，表明各組 苗主要誘導小鼠產生 0123451 2 3 4 5 6 7 ( 511 . 522 . 533 . 51 2 3 4 5 6 7 ( 第三章 牛結核病融合及多價組合 苗的研究 56 00 . 511 . 522 . 5一免兩周 二免兩周 鼠脾淋巴細胞增殖水平的測 定 分別于一免兩周，二免兩周和三免兩周后處死小鼠，無菌分離脾細胞，制備脾細胞懸液，調整細胞濃度為 1107/入 96 孔細胞培養(yǎng)板中，以 白和牛分枝桿菌 為刺激物，檢測其增殖活性，結果見表 2圖 2 表 2白刺激后免疫鼠脾淋巴細胞增殖情況 (XI in X圖 2白刺激后小鼠脾臟淋巴細胞增殖情況（ X in X 表 2分枝桿菌 激后免疫鼠脾淋巴細胞增殖情況 (XI in X組別 一免疫兩周 二免疫兩周 三免疫兩周 A . 41a 別 一免疫兩周 二免疫兩周 三免疫兩周 A 國農業(yè)科學院博士學位論文 第三章 牛結核病融合及多價組合 苗的研究 57 y = O D 450pg/分枝桿菌 激后小鼠脾臟淋巴細胞增殖情況（ X 2he in X 經 白刺激后，各疫苗組的 始終高于兩對照組，一免后各疫苗組的 差異不明顯（ p 二免和三免后 C、 D 組 明顯高于其他各組（ p 除 A 組 與 疫組（ E 組）相似外，其余 苗免疫組的 。 經牛分枝桿菌 激后，各疫苗組的 也始終高于對照組。一免后各疫苗組差異不明顯（ p 二免和三免后 E 組 高于其他各組，而 C、 D 組的 也高于 A、 B 組（ p 疫小鼠脾淋巴細胞 分泌情況 每次免疫兩周后小鼠脾淋巴細胞用 白和牛分枝桿菌 激，收集上清，根據(jù)試劑盒制作標準曲線（圖 2并檢測各組誘生的 水平，結果如表 2圖 2 圖 2鼠 標準曲線 2of of pg/ 1000 500 250 125 0 00 . 511 . 522 . 5一免兩周 二免兩周 三免兩周 第三章 牛結核病融合及多價組合 苗的研究 58 020040060080010001200一免兩周 二免兩周 三免兩周pg/疫鼠脾淋巴細胞經 白刺激后 誘生情況 (Xpg/ in Xpg/圖 2白刺激后小鼠脾淋巴細胞分泌 的量 he of by 2疫鼠脾淋巴細胞經 牛分枝桿菌 激后 誘生情況 (Xpg/ in Xpg/組別 一免疫兩周 二免疫兩周 三免疫兩周 A 1092 1084 別 一免疫兩周 二免疫兩周 三免疫兩周 A 31 21 130 1107 18 國農業(yè)科學院博士學位論文 第三章 牛結核病融合及多價組合 苗的研究 59 y = 4 5 0pg/分枝桿菌 激后小鼠脾淋巴細胞分泌 的量 2he of by 白誘生后，各 苗和 疫組小鼠脾淋巴細胞分泌的 水平均呈上升趨勢，顯著高于兩對照組，且 C 組始終高于其他各組。一免后各組差異不很明顯（ p 二免后 C、 D 組 水平極顯著高于其他組（ p 三免后除 A 組稍低于 疫組（ ，其余 苗組均高 于 疫組， C 和 D 組分泌的 水平相當，且明顯高于A、 B 和 E 組（ p 經牛分枝桿菌 生后，各疫苗組 水平也均呈上升趨勢，顯著高于兩對照組。一免后 E 組分泌的 的量即已明顯高于其他各組，而各 苗組則無明顯差異。二免和三免后 C、 D 組的 水平顯著上升，明顯高于 A、 B 組，但仍低于 疫組，且 C、 A 組小鼠脾細胞分泌的 的量略低于 B 組。 疫小鼠脾淋巴細胞 泌情況 每次免疫兩周后小鼠脾淋巴細胞用 白和 牛分枝桿菌 激，收集上清，根據(jù)試劑盒制作標準曲線（圖 2并檢測各組誘生的 平，結果如表 2圖 2 圖 2鼠 準曲線 of of pg/ 1000 500 250 125 0 0200400600800100012001400一免兩周 二免兩周 三免兩周pg/ 第三章 牛結核病融合及多價組合 苗的研究 60 表 2疫鼠脾淋巴細胞經 白刺激后 生情況 (Xpg/in Xpg/圖 2白刺激后小鼠脾淋巴細胞分泌 量 he of by 2疫鼠脾淋巴細胞經 牛分枝桿菌 激后 生情況 (Xpg/in Xpg/組別 一免疫兩周 二免疫兩周 三免疫兩周 A 125 別 一免疫兩周 二免疫兩周 三免疫兩周 A 16 100200300400500600一免兩周 二免兩周 三免兩周pg/ 第三章 牛結核病融合及多價組合 苗的研究 61 050100150200250300一免兩周 二免兩周 三免兩周pg/分枝桿菌 激后小鼠脾淋巴細胞分泌 量 2he of by 析結果表明，各疫苗組小鼠脾細胞在經 白誘生后產生的 平均呈現(xiàn)遞增趨勢，且顯著高于兩對照組。一免后各組分泌的 平稍有差異，但不明顯，二免后 C 組的 平顯著高于其他各組（ p 三免后則極顯著高于其他組（ p 而 D 組也高于多價 苗免疫組（ A、 B 組）和 疫組（ E 組），且除 A 組外，其他 苗組均高于 疫組。 經 牛分枝桿菌 生后，一免兩周時除 極顯著高于其他各組外 （ p ，其他組無顯著差別，二免和三免后， C、 D 組的 平顯著高于 A、 B 組 （ p ，但它們均極顯著低于 疫組 （ p 。 毒小鼠肺組織荷菌數(shù) 攻毒三周后，無菌采取小鼠肺臟 ， 研磨后倍比稀釋，接種于含改良羅氏培養(yǎng)基的試管斜面上，37 保濕培養(yǎng) 3 周 后 進行菌落計數(shù)，結果如表 2 表 2鼠肺組織荷菌數(shù)（ X 2X 由表 2以看出， 以 1106 擊三周 后， （ E 組）和各 苗組小鼠肺臟荷菌數(shù)明顯低于兩對照組，融合基因 苗組（ C、 D 組）荷菌數(shù)雖稍高 于 ，但三者無明顯差別，且明顯低于兩多價 苗組（ A、 B 組）， B 組荷菌數(shù)比 A 組稍高，但兩組別 荷菌量 A (a104 B (a104 C (b104 D (b104 E (b104 F (104 G (104 中國農業(yè)科學院博士學位論文 第三章 牛結核病融合及多價組合 苗的研究 62 者差異不顯著。 鼠肺臟間接免疫熒光試驗 攻毒后免疫小鼠肺組織內的 現(xiàn)為藍綠色熒光斑點，結果如圖 2 圖 2A, B, C, D, E, F, G 組和正常小鼠對照組 (H 組 )肺組織免疫熒光結果 （ 200） A a B a C a D a E a F a G a H a 中國農業(yè)科學院博士學位論文 第三章 牛結核病融合及多價組合 苗的研究 63 of (200) H) A 組為 價疫苗組 A: of 組為 價疫苗組 B: of 組為 基因融合組 C: of 組為 基因融合組 D: of 組為 疫組 E: CG 組為 )空載體組 F: of ) 組為 疫組 G: BS 組為攻毒小鼠肺臟 H： 毒三周后小鼠肺組織經間接免疫熒光檢測，結果表明兩對照組（ F、 G 組）熒光斑點明顯多于其他各組。 C、 D 組（融合基因 苗組）和 E 組（ ）僅可見少量熒光， A、 價 苗組）熒光斑點數(shù)量較 C、 D 組多。 鼠肺臟組織學病變 （ 色 ） 擊三周后對免疫小鼠肺組織進行 色以觀察病變程度，結果如圖 2示。 中國農業(yè)科學院博士學位論文 第三章 牛結核病融合及多價組合 苗的研究 64 圖 2A, B, C, D, E, F, G 組和正常小鼠對照組 (H 組 )肺組織 色結果 （ 200） 200） A 組為 價疫苗組 A: of 組為 價疫苗組 B: of 組為 基因融合組 C: of a B a C a D a H E a G F 中國農業(yè)科學院博士學位論文 第三章 牛結核病融合及多價組合 苗的研究 65 D 組為 基因融合組 D: of 組為 疫組 E: CG 組為 )空載體組 F: of ) 組為 疫組 G: BS 組為小鼠正常肺臟組織 H： 毒小鼠肺組織 色結果表明兩對照組（ F 和 G 組）小鼠攻毒后肺臟病變嚴重，分別表現(xiàn)為血管炎，肺泡腔大量纖維素滲出和纖維素性肺炎，融合基因 苗組（