密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 水稻第 6 染色體短臂硅含量 分解 和色素原基因 C 的精細(xì)定位 on rm on rm I 摘 要 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，具有高含量的硅是它的一個(gè)重要特征。水稻各部分色澤由 統(tǒng)控制，其中色素原 基因 C 是產(chǎn)生色素的基礎(chǔ)基因。 前期研究利用珍汕 97B/密陽 46 重組自交系群體，在第 6 染色體短臂檢測到控制水稻硅含量研究利用在目的區(qū)間 合、背景純合的一個(gè) 株，即剩余雜合體，這種材料相當(dāng)于近等基因系材料配對雜交產(chǎn)生的 交得到由 221 個(gè)株系組成的 體，定位水稻硅含量 時(shí) 針對 水稻第 6 染色體短臂色素原基因 C 的可能位置，從該 體中 篩選到在 C 基因 周圍區(qū)間 呈不同基因型組合的 7 個(gè)剩余雜合體（ 收獲種子建立 群體，進(jìn)行 C 基因的精細(xì)定位。 主要結(jié)果 如下： 2005 年夏在浙江省富陽基地種植 221 個(gè) 系，分株系測定 體莖稈和劍葉的硅含量。應(yīng)用覆蓋目標(biāo)區(qū)間 15 個(gè) 記組成的遺傳圖譜，檢測到 3 個(gè)控制莖稈硅含量 2 個(gè)控制劍葉硅含量 3 個(gè)控制莖稈硅含量的 別位于 間，最高 分別為 別為 3.0 18.9 59.8 性效應(yīng)分別為 顯性效應(yīng)分別為 顯性度分別為 獻(xiàn)率分別為 2 個(gè)控制劍葉硅含量的 別位于 間，最高 別為 3.0 59.3 性效應(yīng)分別為 顯性效應(yīng)分別為 顯性度分別為 獻(xiàn)率分別為 2006 年春在海南省陵水基地種植 7 套 生的 體，通過對各個(gè)群體顏色表現(xiàn)和原因型的比較，將 C 基因定位于微衛(wèi)星標(biāo)記 間。在該基礎(chǔ)上， 應(yīng)用兩個(gè)分離群體共 1279 個(gè)樣本，經(jīng)標(biāo)記檢測和連鎖分析，進(jìn)一步將 C 基因定位于 遺傳距離分別為 0.7 0.4 后，應(yīng)用區(qū)間內(nèi)的另外 6 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記和 1 個(gè)源于 C 基因 候選基因 標(biāo)記 ，檢測 在 因 間內(nèi)發(fā)生了重組的 22 個(gè)個(gè)體， 將 C 基因定位于一個(gè)大小為 59.3 蓋 C 基因候選基因 位的區(qū)間中。 關(guān)鍵詞： 水稻；剩余雜合體（ 硅含量 C 基因；候選基因 is of in of is a is by in (is a In a a on of by In 3 21 is in on of in of to in on of 3 of 2:3 as A 5 by 21 F2 21 F3 u 005. in TS in LS in TS in OD 5.5 OD .0 18.9 cM 9.8 cM of in LS in OD OD .0 cM 9.3 cM of C 2 HL 006. By of of SR By a 279 .7 cM .4 cM in SR to a in .); C 文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 增片段長 度多態(tài)性 切擴(kuò)增序列多態(tài)性 合區(qū)間作圖法 倍雙倍體 達(dá)序列標(biāo)簽 n 葉硅含量 間作圖法 子標(biāo)記輔助選擇 等基因系 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 量性狀座位 機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 制性片段長度多態(tài)性 余雜合體 組自交系 列特性擴(kuò)增區(qū)域 核苷酸多態(tài)性 單序列長度多態(tài)性 單序列重復(fù) n 稈硅含量 錄 摘 要 . I . 文縮略表 . 一章 文獻(xiàn)綜述 . 1 用的 子標(biāo)記 . 1 記 . 2 記 . 3 記 . 3 記 . 3 記 . 4 記 . 4 位的群體 . 4 2群體和 . 5 組自交系群體 . 5 倍單倍體群體 . 5 等基因系群體 . 5 余雜合體群體 . 6 析方法 . 6 標(biāo)記的定位方法 . 6 間作圖法 . 7 合區(qū)間作圖法 . 7 合線性模型方法 . 7 稻 研究進(jìn)展 . 7 初級定位 . 8 精細(xì)定位 . 8 稻 圖位克隆和分子標(biāo)記輔助選擇 . 9 稻硅的研究 . 9 稻對硅的吸收 . 10 在水稻體內(nèi)的分布 . 10 對水稻的作用 . 11 稻硅的遺傳學(xué)研究 . 12 稻中 C 基因的研究進(jìn)展 . 13 研究論文內(nèi)容的提出 . 13 第二章 水稻硅含量 定位 . 15 料和方法 . 15 子標(biāo)記分析 . 16 提取 . 16 V 記檢測 . 16 含量測定 . 18 據(jù)處理 . 19 果與分析 . 20 型變異 . 20 析 . 21 論 . 23 第三章 水稻色素原基因 C 的精細(xì)定位 . 25 料與方法 . 25 稻材料和田間實(shí)驗(yàn) . 25 子標(biāo)記檢測 . 26 據(jù)處理 . 27 果與分析 . 27 基因的初步定位 . 27 基因的精細(xì)定位 . 28 論 . 30 第四章 全文結(jié)論與展望 . 32 論 . 32 稻硅含量 定位 . 32 稻色素原基因 C 的精細(xì)定位 . 32 望 . 32 參考文獻(xiàn) . 33 致謝 . 43 作者簡歷 . 44 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 水稻（ .）是世界上最重要的糧食作物之一，全世界約有一半的人以大米為主食。此外，禾本科植物基因組的共線性特征和水稻具有較小的基因組（約 389使得水稻成為單子葉植物基因組的模式植物，并于 2005 年發(fā)布了全基因組精細(xì)圖譜（ 2005）。 生物性狀一般可分為質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀。質(zhì)量性狀一般受單基因控制，表現(xiàn)為非連續(xù)性變異，在分離群體中可明確分組；數(shù)量性狀受多基因控制，單個(gè)基因效應(yīng)較小， 易受環(huán)境的影響，在分離世代中表現(xiàn)為連續(xù)變異，不能明確分組。植物許多重要的經(jīng)濟(jì)性狀或農(nóng)藝性狀，如產(chǎn)量、品質(zhì)、病蟲害抗性及抗逆性等，都屬于數(shù)量性狀（ ， 1960），改良這些數(shù)量性狀是作物育種的重要目標(biāo)。因此，研究數(shù)量性狀的遺傳規(guī)律具有重要的意義。 傳統(tǒng)的數(shù)量遺傳學(xué)采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法把控制某一個(gè)性狀的多個(gè)基因作為一個(gè)整體研究，這種方法難以有效地研究控制性狀表達(dá)的基因的數(shù)目、基因在染色體上的位置，基因的效應(yīng)和作用方式。解決這一問題的突破口在于能否將影響數(shù)量性狀的多個(gè)基因剖分開來，將其定位在染色體上， 并最終確定與之有關(guān)的 列。近幾十年來，隨著 子標(biāo)記技術(shù)高速發(fā)展，并構(gòu)建了水稻等重要的飽和分子標(biāo)記圖譜，可以將復(fù)雜的數(shù)量性狀剖分為由若干離散的孟德爾因子所決定的組分，并進(jìn)而確定其在染色體上的位置及其與其它基因的關(guān)系（徐云碧， 1990， 1993）。 用的 子標(biāo)記 遺傳標(biāo)記（ 指染色體、染色體某一節(jié)段或者某個(gè)基因座在家系中的任何一種遺傳特性。它具有兩個(gè)特征，即可遺傳性和可識別性。迄今遺傳標(biāo)記主要包括形態(tài)標(biāo)記（ 細(xì)胞 學(xué)標(biāo)記（ 生化標(biāo)記（ 分子標(biāo)記（ 其中前三種遺傳標(biāo)記都是以基因表達(dá)的結(jié)果（表現(xiàn)型）為基礎(chǔ)的，是對基因的間接反映，而 子標(biāo)記則是 平遺傳變異的直接反映。 形態(tài)標(biāo)記是植物的外部形態(tài)特征，如：矮稈、紫鞘、卷葉等。形態(tài)標(biāo)記具有簡單直觀、經(jīng)濟(jì)方便等優(yōu)點(diǎn)。但形態(tài)標(biāo)記的數(shù)量在多數(shù)植物中是有限的，多態(tài)性比較差，表型易受環(huán)境影響，還有一些標(biāo)記與不良性狀的基因連鎖。因此，形態(tài)標(biāo)記在作物遺傳育種中的作用是有限 的。 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記是植物細(xì)胞染色體的變異，包括染色體核型（染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)、隨體有無、著絲粒位置等）和帶型（ C 帶、 N 帶、 G 帶等）的變化。細(xì)胞學(xué)標(biāo)記需要較多的人力和花費(fèi)較長的時(shí)間，難度很大，因此，到目前為止，真正應(yīng)用于作物遺傳育種研究中的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記還很少。 生化標(biāo)記主要包括同工酶標(biāo)記和等位酶標(biāo)記。但目前可使用的生化標(biāo)記數(shù)量還相當(dāng)有限，且有些酶的染色方法和電泳分離技術(shù)有一定難度，因此其實(shí)際應(yīng)用受到一定限制。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 2 分子標(biāo)記亦指 子標(biāo)記，是以生物大分子的多態(tài)性為基礎(chǔ)的一種遺傳標(biāo)記。 分子標(biāo)記與形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記、生化 標(biāo)記相比較，有以下幾方面的優(yōu)點(diǎn)：在植物體的多個(gè)組織及生育階段均可檢測到，不受時(shí)空限制；數(shù)量多，遍及整個(gè)基因組；有許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性，能夠鑒別基因型純合與否，提供完整的基因型。 分子標(biāo)記大多以電泳譜帶的形式表現(xiàn)， 根據(jù) 致可以將分子標(biāo)記分為三類： 第一類是以分子雜交為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記（ 簡稱 原位雜交（ ；第二類是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ 簡稱 核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 稱 簡單序列重復(fù)標(biāo)記（ 稱 簡單序列長度多態(tài)性（ 稱 擴(kuò) 展片段長度多態(tài)性標(biāo)記（ 稱 序標(biāo)位（ 稱 序列特征化擴(kuò)增區(qū)域（ 簡稱 ；第三類是一些新型的分子標(biāo)記，如：單核苷酸多態(tài)性（ 簡稱 表達(dá)序列標(biāo)簽（ 稱 。 下面將介紹其中常用的 記 最早發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于圖譜構(gòu)建和基因定位的 第一張植物 ， 1986）報(bào)道后兩年，美國康乃爾大學(xué)以 ， 1988）。 1994年，同一研究組又發(fā)表了應(yīng)用新群體構(gòu)建的第二張水稻分子圖譜（ ， 1994）。在這張圖譜中，已在第一張圖譜中定位的探針的線性排列得到證實(shí)。新圖譜共含 722個(gè)標(biāo)記，其中 620個(gè)為 一年，日本的水稻基因組計(jì)劃（ 發(fā)表了他們構(gòu)建的分子圖譜（ ， 1994），含 1383個(gè)標(biāo)記，其中 1148個(gè)為 圖譜至 1998年標(biāo)記數(shù)已達(dá) 2275個(gè)（ ， 1998），新增加的標(biāo)記仍主要為 2000年進(jìn)一步飽和，其中涵蓋了 3267個(gè) ），為水稻基因組測序計(jì)劃和基因定位研究提供了極大便利。 入、缺失、重排等所造成的限制性片段數(shù)目和長度的差異。通過凝膠電泳技術(shù)，將其按大小分離開來，然后經(jīng) 放射自顯影，探測到與探針雜交的特定的 不同個(gè)體間在與該探針同源的 會(huì)表現(xiàn)出限制性片段長度的多態(tài)性，這個(gè)探針 就是一個(gè)分子標(biāo)記（鄭康樂， 1991）。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 3 復(fù)性和共顯性，同時(shí)又為不同研究結(jié)果的比較提供了基礎(chǔ)，使得這種標(biāo)記成為植物基因定位研究中最主要的分子標(biāo)記；但由于 時(shí)、費(fèi)力，且需要放射性同位素，所以逐漸地被其它更安全、更易檢測的分子標(biāo)記所代替。 記 記 由 于 1990 年創(chuàng)立，是第一種廣泛應(yīng)用于生物遺傳變異檢測和基因定位的 記。 其 基本原理 是 用一個(gè) （ 有時(shí)用兩個(gè) ） 隨機(jī)引物 （ 一般 8 10 個(gè)堿基 ） 非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增 段，然后用凝 膠電泳分開擴(kuò)增片段。 該類標(biāo)記的 特點(diǎn)包括： （ 1） 不需 針，設(shè)計(jì)引物也不需要知道序列信息； （ 2） 技術(shù)簡單， 析不涉及 交、放射自顯影或其它技術(shù)； （ 3） 不象 析， 析只需少量 品； （ 4） 記一般是顯性遺傳（極少數(shù)是共顯性遺傳的），這樣對擴(kuò)增產(chǎn)物就可記為 “ 有 /無 ” ，但這也意味著不能鑒別雜合子和純合子； （ 5） 析中存在的最大問題是 檢測結(jié)果不夠穩(wěn)定，缺乏可靠的重演性（ 1995）。 記 記通常是由 記轉(zhuǎn)化而來的。其基本原理是根據(jù) 記片段從凝膠上回收并進(jìn)行克隆和測序的堿基序列設(shè)計(jì)一對特異性引物（ 18基左右），也可只對該 記片段的末端進(jìn)行測序，根據(jù)其末端序列，在原來 用的 10 個(gè)堿基引物上增加相鄰的 14 個(gè)左右堿基，成為與原 段末端互補(bǔ)的特異引物。以此特異引物對基因組 進(jìn)行 可擴(kuò)增出與克隆片段同樣大小的特異帶。 記一般表現(xiàn)為擴(kuò)增片段的有無，為一種顯性標(biāo)記；但有時(shí)也表現(xiàn)為長度的多態(tài)性，為共顯性標(biāo)記。若檢測 的差異表現(xiàn)為 擴(kuò)增片段的有無，可直接在 應(yīng)管中加入溴化乙錠，通過在紫外燈下觀察有無熒光來判斷擴(kuò)增片段的有無，從而檢測 的差異，這樣可省去電泳的步驟，使檢測變得方便、快捷、可靠，可以快速檢測大量個(gè)體。與 記相比， 記由于所用引物較長及引物序列與模板全互補(bǔ)，因此，可在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果穩(wěn)定性好、可重復(fù)性強(qiáng)。 記 995年報(bào)道。 法 是選用一種多切點(diǎn)限制性內(nèi)切酶和一種寡切點(diǎn)限制性酶，同時(shí)酶解基因組 鏈酶切片段的粘性末端接上人工接頭，作為 而檢測其多態(tài)性。 1）由于 目很多，所以從理論上該技術(shù)所產(chǎn)生的標(biāo)記數(shù)目是無限多的；（ 2）典型的 次反應(yīng)產(chǎn)物的譜帶在 50以一次分析可以同時(shí)檢測到多個(gè)座位，且多態(tài)性極高； （ 3）測效率高；（ 4）分辯率高，結(jié)果可靠；（ 5） 因標(biāo)記的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 4 獲得程序復(fù)雜 ，成本較高；（ 6） 一般實(shí)驗(yàn)室開展此 項(xiàng)技術(shù)尚存在一定困難。 記 一類由 1于同一座位上串聯(lián)重復(fù)子拷貝數(shù)不同，構(gòu)成了不同的等位基因。利用重復(fù)子兩側(cè)單拷貝序列設(shè)計(jì) 為簡單序列長度多態(tài)性，擴(kuò)增后可得到豐富的等位基因多態(tài)性（ ， 1993； ， 1997）。 有穩(wěn)定、簡便、多態(tài)性豐富、 果分析容易等優(yōu)點(diǎn)，因此成為遺傳學(xué)研究的重要標(biāo)記。近年來， 2001年還只有500個(gè)標(biāo)記（ ， 2001）， 2002年增加到了 2740個(gè)（ 2002），在水稻完成測序后，對全基因組序列的分析發(fā)現(xiàn)，在水稻全基因組中潛在可利用的 8， 000余個(gè)（ 2005）。 記 標(biāo)記 是特異引物 際上是一些特異引物 一種延伸。其基本原理是當(dāng) 種補(bǔ)救的辦法就是用限制性內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，然后通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳將酶解產(chǎn)物分開。 需 復(fù)性高、操作簡便、成本低等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛的應(yīng)用。 位的群體 構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖，必須要有一個(gè)分離群體。分離群體和與之對應(yīng)的連鎖圖是進(jìn)行 要條件。根據(jù)分離群體在 其分為初級群體和次級群體（吳為人 等 ， 2000）。根據(jù)初級群體的特征，又可分為暫時(shí)性群體和永久性群體。 初級群體是指由兩個(gè)遺傳差異很大的原始親本相互雜交而建立的分離群體，其特點(diǎn)是全基因組均發(fā)生分離，這類群體主要包括 組自交系（ 體、加倍單倍體（ 體； 次級群體是指在初級群體的基礎(chǔ)上，通過近等基因系或?qū)胂祷蛉旧w片段代換系（相互或與原始親本）雜交而建立 的分離群體。其特點(diǎn)是僅在親本間有差異的染色體區(qū)段發(fā)生分離，從而有效地減少遺傳變異的干擾 。用來發(fā)展次級群體的穩(wěn)定的親本材料，稱為次級群體系，主要包括近等基因系（ 體、滲入系（ 體、染色體替換系（ 體等。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 5 2群體和 過雜交產(chǎn)生 后經(jīng)過自交獲得的群體。具有構(gòu)建快，且能提供最為豐富的遺傳信 息。應(yīng)用 以直接將加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)分開（ ， 1987），但由于 交后代發(fā)生分離，是一種暫時(shí)性群體，難于進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。表型鑒定也是以單株為基礎(chǔ)，對于遺傳力低的農(nóng)藝性狀， 此，應(yīng)用有效應(yīng)較大和表達(dá)較穩(wěn)定的 1988）。雖然可以應(yīng)用 由于降低了顯性效應(yīng)，將導(dǎo)致遺傳效應(yīng)估算值偏低（莊杰云等， 2001）。 過雜交產(chǎn)生 后和親本雜交獲得的群體 。它也是一種暫時(shí)性群體，由于缺少一種親本型，難于直接分解加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)，應(yīng)用局限性較大，現(xiàn)已較少用于 （ 1996）提出了用高代回交群體進(jìn)行 （ 該法可將 而得到較廣泛的應(yīng)用（ ， 1998； ， 2000）。 組自交系 群體 重組自交系群體是通過雜交產(chǎn)生 后經(jīng)過單粒傳、連續(xù)多 代自交而產(chǎn)生的。該群體的每個(gè)株系的遺傳組成比較穩(wěn)定，屬于永久性群體。它可通過設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)測量數(shù)量性狀，減少實(shí)驗(yàn)誤差；還可以多代保存，種植于不同環(huán)境、不同年份，研究基因型與環(huán)境的互作效應(yīng)。由于多代自交，使染色體間的重組機(jī)會(huì)大大增加， 此，應(yīng)用 1996）。 且易產(chǎn)生嚴(yán)重的偏分離。 日本水稻基因組計(jì)劃將秈梗交 行水稻的 ， 2001）。 倍單倍體 群體 加倍單倍體群體是單倍體經(jīng)過染色體加倍形成的，一般通過花藥培養(yǎng)，即取 導(dǎo)產(chǎn)生單倍體植株，然后對染色體進(jìn)行加倍產(chǎn)生 優(yōu)點(diǎn)是建立 以反復(fù)使用，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。但是植物的花培能力跟基因型關(guān)系密切，因而花培過程會(huì)對不同基因型的花粉產(chǎn)生選擇效應(yīng)，從而破壞 成較嚴(yán)重的偏分離現(xiàn)象，從而影響遺傳作圖的準(zhǔn)確性，因此，如果是以構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖為主要 目的， 等基因系群體 近等基因系群體是指通過反復(fù)回交獲得的帶有供體目標(biāo)導(dǎo)入染色體片段而其它基因組成與輪回親本一致的株系。應(yīng)用近等基因系構(gòu)建的群體可以在相同的遺傳背景下，將多個(gè) 數(shù)量性狀化為質(zhì)量性狀，從而進(jìn)行精細(xì)的基因定位和圖位克?。?中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 6 1997）。 次分子標(biāo)記篩選。 余雜合體 群體 剩余雜合體（ 體是 通過雜交產(chǎn)生 后經(jīng)過單粒傳、連續(xù)多代自交而產(chǎn)生的。 是近年 來提出的一種新型的精細(xì)定位群體。與 遺傳背景中存在兩種雙親基因型，而不是僅含輪回親本的一種基因型，并且只要利用一次分子標(biāo)記選擇。目前， ， 1997， 1998）、擬南芥（ ， 2005）、大豆 （ ，2005）和水稻（ ， 2006）等植物 析方法 作物中大多數(shù)重要的農(nóng)藝性狀和經(jīng)濟(jì)性狀，如產(chǎn)量、品質(zhì)、生育期、抗逆性等都是數(shù)量性狀。這類性狀由多基因控制，其遺傳基礎(chǔ)比較復(fù)雜，對大多數(shù)的研究不能采用與質(zhì)量性狀相同的方法進(jìn)行 （ 1941）。傳統(tǒng)的遺傳學(xué)是利用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)來對導(dǎo)致數(shù)量性狀變異的所有基因的總和效應(yīng)進(jìn)行分析，不能用孟德爾的方法來研究單個(gè)基因的作用。分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，為深入研究數(shù)量性狀的遺傳基礎(chǔ)提供了可能?？刂菩誀畹幕蛟诨蚪M中的位置稱為數(shù)量性狀基因座（ 利用分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳連鎖分析，可以檢測出 位。 利用 記進(jìn)行 位的遺傳學(xué)原理是：當(dāng)分子標(biāo)記與某一個(gè)性狀的 鎖時(shí)，不同標(biāo)記基因型的個(gè)體的表型值將存在顯