密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 白酶聯(lián)免疫分析技術(shù)研究 t t I 摘 要 轉(zhuǎn)基因作物由于具有抗蟲害、抗除草劑等優(yōu)良品質(zhì)，目前在一些國家已大規(guī)模商品化生產(chǎn)。隨著人們對轉(zhuǎn)基因食品安全性認(rèn)識的不斷深入，各國在積極發(fā)展轉(zhuǎn)基因技術(shù)的同時(shí)，加強(qiáng)了對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)控和管理。中國和世界一些國家采用了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度，因此研發(fā)轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測技術(shù)具有重大實(shí)際意義。 本研究以轉(zhuǎn)抗蟲基因產(chǎn)品中的表達(dá)產(chǎn)物 蟲晶體蛋白作為研究對象，利用免疫分析技術(shù)，建立了定 量檢測 列蛋白的直接競爭 測技術(shù)，并研制其產(chǎn)品，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的快速、大批量檢測和基因標(biāo)識制度提供了技術(shù)支撐。 本研究 利用 白作為 免疫 原免疫小鼠制備了多克隆 抗血清，并通過 飽和硫酸銨鹽沉淀法 進(jìn)行 純化 ，其 效價(jià)分別為 52000 和 50000(間接非競爭 法 ), 與不同 白交叉反應(yīng)率均小于 親和常數(shù)（ K）均大于 109， 符合 建立 析技術(shù)的質(zhì)量要求 。 采用改良的過碘酸納簡易法 對 白 進(jìn)行 辣根過氧化物酶（ 記 ，經(jīng)紫外分光 光度法 鑒定， 結(jié)果表明： 兩種抗原（ 標(biāo)記率分別為 分子比分別為 在進(jìn)一步進(jìn)行包被條件、抗體（抗血清）和酶標(biāo)抗原工作濃度優(yōu)化的基礎(chǔ)上，建立了 白的直接競爭 測技術(shù)，并進(jìn)一步研制了直接競爭 劑盒，結(jié)果如下： （ 1） 白直接競爭 測技術(shù)及產(chǎn)品：測定 范圍為 50ng/600ng/靈敏度 為 50ng/加回收率在 間，平均回收率為 與間 接 法測得的結(jié)果無顯著差異；試劑盒的板內(nèi)變異系數(shù)在 間，平均變異系數(shù)為 ， 板間變異系數(shù)在 間，平均變異系數(shù)為 ； 試劑盒在 4 下可保存 6 個(gè)月以上。 （ 2） 白直接競爭 測技術(shù)及產(chǎn)品：測定 范圍為 40ng/750ng/敏度 為 40ng/加回收率在 間，平均回收率為 與間接 檢測結(jié)果也無顯著差異；試劑盒的板內(nèi)變異系數(shù)在 間，平均 變異系數(shù)為 ， 板間變異系數(shù)在 間，平均變異系數(shù)為 ； 試劑盒在 4 下可保存 6 個(gè)月以上。 關(guān)鍵詞： 白，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，直接競爭法， 劑盒 in in in of of in to of So it is to a of of is to a a t in a of Ab 2000 0000 of by t to Bt RP by of of of a as (1) a 0ng/ml 0ng/of . V. of (2) 0ng/ml 0ng/of . V. is Bt 錄 摘 要 . I . 錄 . I 第一章 緒論 . .t 植物的發(fā)展現(xiàn)狀 . 1 t 蛋白免疫分析研究現(xiàn)狀 . 2 測法 . 2 同凝集反應(yīng) . 3 疫試紙條法 . 3 疫印跡分析法 . 4 t 蛋白檢測覺技術(shù)發(fā)展趨勢 . 4 疫 術(shù)（ . 4 子印跡技術(shù) . 5 動注射免疫分析（ . 5 疫傳感器 . 5 白質(zhì)芯片技術(shù) . 6 研究的立 題依據(jù)及意義 . 6 第二章 白多克隆抗體制備 . 7 料與方法 . 7 料 . 7 物免疫和抗血清制備 . 9 血清的采集和保存 . 10 血清質(zhì)量評價(jià) . 10 血清的純化 . 12 果與分析 . 12 t 蛋白濃度測定 . 12 血清效價(jià)測定 . 13 和力測定 . 13 異性測定 . 14 論 . 15 第三章 白 直接競爭 劑盒的研制 . 16 料與方法 . 18 料 . 18 直接競爭 法的研究 . 20 白 直接競爭 劑盒的研制 . 22 劑盒測樣過程 . 23 劑盒性質(zhì)測定 . 23 劑盒使用的注意事項(xiàng) . 24 果與分析 . 24 標(biāo)板的處理 . 24 原的酶標(biāo)記 . 25 被 抗體、酶標(biāo)抗原工作濃度的篩選 . 25 劑盒特性測定 . 26 論 . 28 響 測方法的因素 . 28 作要點(diǎn) . 29 原的酶標(biāo)記 . 30 體最佳工作濃度的確定 . 31 劑盒的使用及存在問題 . 31 第四章 白 直接競爭 劑盒的研制 . 32 料與方法 . 32 料 . 32 b 蛋白直接競爭 劑盒內(nèi)容及制備 . 33 劑盒測樣過程 . 34 劑盒性質(zhì)測定 . 34 果與分析 . 35 原的酶標(biāo)記 . 35 被 抗體、酶標(biāo)抗原工作濃度的篩選 . 35 劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度 . 36 劑盒準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn) . 36 劑盒精密度實(shí)驗(yàn) . 37 劑盒精有效期測定 . 38 論 . 38 第五章 主要結(jié)論 . 39 參考文獻(xiàn) . 40 致 謝 . 45 作者簡歷 . 46 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 t 作物的發(fā)展現(xiàn)狀 自 1981年克隆出第 1個(gè) 1代轉(zhuǎn) 987年誕生的，比利時(shí) 1987）等、美國 1987）等和 1985）等分別將 3端缺失的 b)、 a)、 c)基因轉(zhuǎn)入煙草，得到了轉(zhuǎn)基因植株，美國 1987）用 3端缺失的 b)基因?qū)朕眩@些轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性都較弱，難以檢測出 占可溶性蛋白的 1990年 修飾和改造，獲得 此，人們在 達(dá)載體的構(gòu)建、植物組織轉(zhuǎn)化、抗蟲植物的培育等方面進(jìn)行了大量的研究。迄今，國內(nèi)外已有許多實(shí)驗(yàn)室和科研單位用不同的 要是 得了 50多種不同的抗蟲轉(zhuǎn)基因作物，有的已進(jìn)人大田試驗(yàn)和商品化生產(chǎn)階段。從 1995年起， 花和馬鈴薯已商品化，到 1997年，全世界已發(fā)放 1個(gè)，棉花和馬鈴薯品種各 5個(gè)，主要種植于 8個(gè)國家和地區(qū)，轉(zhuǎn)基因抗蟲作物商品化速度很快，至今已在美國、阿根廷、加拿大、中國、巴西、南非、墨西哥、澳大利亞等 20多個(gè)國家開始大面積種植。到 2005年為止全球轉(zhuǎn) 8（ 1620萬公頃），獲得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益，估計(jì)到 2006年全球轉(zhuǎn)基因作物種子的銷售額將達(dá) 55億美元以上。 中國從 1991年開始，在國家 “863”高技術(shù)計(jì)劃的資助下也進(jìn)行了相應(yīng)的研究，首先將 3端缺失的 花、煙草、甘藍(lán)、 等獲得抗蟲轉(zhuǎn)基因植株，隨后也開展了造和全臺成，并將其導(dǎo)人煙草、甘藍(lán)、棉花等 25種以上作物。 1996年，郭三堆等將人工合成的調(diào)控序列和 c)基因成功導(dǎo)人中棉 棉 3號及晉棉 7號等我國主要棉花栽培品種，使我國成為世界上繼美國之后獨(dú)立開發(fā)成功轉(zhuǎn)基因抗蟲棉并獲得知識產(chǎn)權(quán)的第二個(gè)國家。并將 成雙價(jià)抗蟲棉，已育成 6個(gè)品種，數(shù)十個(gè)優(yōu)良品系，1997年獲準(zhǔn)商品化生產(chǎn)，到 2005全國種植面積達(dá) 330萬公頃，經(jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)效益顯著。另外，我國的轉(zhuǎn)基因抗 蟲玉米、水稻、煙草、馬鈴薯等農(nóng)作物都有望在近期實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。 近年來，轉(zhuǎn)基因作物的商品化是否會導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境問題已經(jīng)引起廣泛的爭議。爭論涉及的主要問題是轉(zhuǎn)基因作物的廣泛種植與傳播是否會加速雜草及抗藥性害蟲的進(jìn)化。許多資料表明，經(jīng)遺傳改良作物的商品化會導(dǎo)致編碼有益性狀的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到這些作物的野生種和近緣種中。（ 1997）認(rèn)為 蛋白活性的散失將可能成為作物最嚴(yán)重的生態(tài)危機(jī)。由于 基因作物正逐步進(jìn)入大批量商業(yè)應(yīng)用，一些潛在的可能生態(tài)危機(jī)將有一個(gè)緩慢的釋放過程，因而難以評價(jià)。至少，從目前已得到 商品化的轉(zhuǎn) 物來看，還沒有關(guān)于 物對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生危險(xiǎn)性的報(bào)道。 另外， 物食品安全性也是值得探討的問題。盡管對 物的普遍認(rèn)識是僅對二化螟等鱗翅目昆蟲具有轉(zhuǎn)一性的毒殺作用，人和動物中因無特異性 蛋白結(jié)合位點(diǎn)，因而對人和動物而言安全有保障，這點(diǎn)已積累了大批的資料。但其中不容爭議的事實(shí)是 白會在一些作物的食用部分表達(dá)，如水稻和玉米的籽粒，因此人們的擔(dān)心憂慮并不是多余的。盡管 蛋白無中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 任何毒性，但至少也為發(fā)現(xiàn)對人和動物有何營養(yǎng)價(jià)值的報(bào)道，長期食用這些 “無效 ”的物質(zhì)或在體內(nèi)長期積累是否會引起 負(fù)效應(yīng)是人們關(guān)心的焦點(diǎn)。有關(guān) 物的生態(tài)效應(yīng)，現(xiàn)已成為研究的熱點(diǎn)。為安全起見， 許多國家要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)行標(biāo)簽制度，因此對產(chǎn)品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測、確定是否含有、含量多少以及什么種類的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品是擺在各國政府面前一項(xiàng)亟待解決的主要任務(wù)。 t 蛋白免疫分析研究現(xiàn)狀 白是轉(zhuǎn)基因作物中的抗蟲基因的表達(dá)產(chǎn)物。目前檢測 白的方法主要是免疫法（ 疫印跡，試紙條等），免疫測定法基于抗原 定時(shí)間短，操作程序標(biāo)準(zhǔn)，檢測極限低，可對大量樣品進(jìn)行測定。同時(shí)它對儀器設(shè)備要求相對低， 測定結(jié)果可以長期保存，并且可以對轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。 測法 酶聯(lián)免疫吸附方法（ 目前應(yīng)用的最廣泛的免疫檢測方法，其基本原理是基于抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體可以保留其免疫學(xué)活性，抗原或抗體的酶結(jié)合物既保持其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，把受檢標(biāo)本（抗體或抗原）和酶標(biāo)記抗體或抗原按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，用洗滌的方法士形成的抗 原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，這樣結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中的受檢物質(zhì)的量就會成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量就與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，于是就可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定量或定性分析。由于酶的催化效率很高，可極大地放大反應(yīng)結(jié)果，從而可以使測定達(dá)到很高的靈敏度。 法首先需要制備純度較高的抗原和特異性高的抗體。 白多從蘇云金桿菌中提取晶體蛋白，并加以純化，王保民（ 1998）等報(bào)道純化的毒蛋白是 130多肽鏈，而陳松（ 1999）等報(bào)道 130多肽鏈為前 毒素蛋白，在此基礎(chǔ)上加入胰蛋白酶，就得到 67多肽組成的毒蛋白。利用 體蛋白注射兔或白鼠，制備多克隆抗體或單克隆抗體。王保民（ 2000）等制備了蛋白 得到 4 個(gè)單克隆株系 成功地建立了雙抗夾心 測了中棉所 30、 期葉片中毒蛋白的含量，分別為 g（ g（ 1996）等、 1998）等及國內(nèi)的陳松（ 1999）等報(bào)道應(yīng)用多克隆抗體成 功地檢測了轉(zhuǎn) 因棉在棉株生長的各個(gè)時(shí)期的表達(dá)量。在抗體的標(biāo)記上，王保民（ 1998）等用的是生物素標(biāo)記 ， 陳松（ 1999）等用辣根過氧化物酶標(biāo)記 。 沈法富（ 1999）等建立了 法檢測 蛋白，能通過顏色的深淺來進(jìn)行抗性等級的評價(jià)，且檢測 光明（ 2003）等建立的檢測玉米 白的間接 量檢測方法，對 白質(zhì)的質(zhì)量濃度最低可檢值為 嚴(yán)吉明（ 2003）建立的間接 8ng/松 等建立的夾心 胞晶體蛋白提純品的最低檢測值為 20ng/后的進(jìn)一步研究將對 胞晶體蛋白提純品的最低檢測值提升為1，線性范圍 115,板內(nèi)誤差 ，即可判定 劑盒已失效， 37 下的 24h 相當(dāng)于常溫下的 45d。 劑盒使用的注意事項(xiàng) （ 1）試劑盒儲存于 28 ，不要冷凍，使用前將所有試劑回升至室溫，使用后立即將所有試劑放回 28 。 （ 2）在 中再現(xiàn)性，很大程度取決于洗板的一致性，仔細(xì)按照推薦的洗板順序操作是 （ 3）在所有恒溫育過程中用蓋子蓋住微孔板，避免光線照射。 （ 4）反應(yīng)終止液為 2硫酸，避免接觸人體。 （ 5）用酶標(biāo)儀測讀數(shù)時(shí)，孔內(nèi)必須無氣泡，以免影響讀數(shù)的準(zhǔn)確。 （ 6）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)光劑避免直接暴露在光線下。 （ 7） 加入終止液后 30 果與分析 標(biāo)板的處理 分別采用紫外線（ 30w 紫外燈，距酶標(biāo)板 75射 2h）和預(yù)處理液（ 500水乙醇加入到 50080g/L 的 溶液中，混合攪拌過夜，次日再加入 600蒸水混勻即為預(yù)處理 表 3 不同處理的測定結(jié)果 by 理 酶標(biāo)抗原稀釋度 1:50 1:100 1:200 1:300 1:400 1:500 紫外線 處理液 照 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第三章 接競爭 劑盒的研制 25 液，浸泡 24h）處理酶標(biāo)板，以未經(jīng)過處理的酶標(biāo)板為對照，按照直接 序進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表 3。從表 3 可以看出，用紫外線照射過的酶標(biāo)板測定的 要明顯高于預(yù)處理液浸泡過的及未經(jīng)處理的酶標(biāo)板的 ，說明用紫外線照射過的酶標(biāo)板，其對抗體的吸附力高于預(yù)處理液浸泡及未處理的酶標(biāo)板。因此以后的測 定均采用用紫外線處理過的酶標(biāo)板（ 30w 紫外燈，距酶標(biāo)板 75射 2h）。 原的酶標(biāo)記 用辣根過氧化物酶（ 為標(biāo)記酶，采用改良的過碘酸納簡易法，制備酶標(biāo) 標(biāo)抗原分別稀釋 10 倍后，測得：酶標(biāo) 原的 根據(jù)公式計(jì)算： 酶標(biāo)記抗原中 釋倍數(shù) 標(biāo)記抗原中抗原量（ 釋倍數(shù) 標(biāo)記率 分子比（ 度抗原濃度）（抗原分子量 子量） = 包被抗體、酶標(biāo)抗原工作濃度的篩選 白抗體和酶標(biāo) 原分別系列稀釋后，做方陣滴定試驗(yàn)。選擇 接近 時(shí) 白抗體和酶標(biāo) 原的濃度作為工作濃度，結(jié)果如表 4。 表 4 抗體和酶標(biāo)抗原最佳濃度選擇 he of 標(biāo)抗原稀釋度 抗體稀 釋度 1:10000 1:20000 1:25000 1:30000 1:35000 1:40000 1:45000 1:25 :50 :100 :200 :300 :400 表 4 可以看出， 白抗體稀釋倍數(shù)為 30000，酶標(biāo) 原的稀釋倍數(shù)為200 時(shí)測得的 最接近 此選擇 白抗體稀釋倍數(shù)為 30000 與酶標(biāo) 00 時(shí)的溶液濃度作為包被抗體和酶標(biāo)抗原的最佳工作濃度 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第三章 接競爭 劑盒的研制 26 劑盒特性測定 劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度 靈敏度系指應(yīng)用該法能檢出待測樣品的最低量，即最小檢出量。最小檢出量越小，靈敏度越高。將 白標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成系列濃度，用直接競爭 法分析得到以下曲線（圖8）。 01020304050607080901000 1 2 3 4B t C r c 蛋白濃度對數(shù) ( L g C )抑制率%圖 8 白直接競爭 線 by 曲線轉(zhuǎn)換后可以看出（圖 9）：在 50ng/600ng/圍內(nèi)，抑制率與 白濃度的對數(shù)值成良好的線 性關(guān)系，直線回歸方程為 y x) 歸系數(shù) 敏度為 50ng/ 01020304050607080901000 1 2 3 4 c 蛋白濃度對數(shù) (L g C)抑制率%圖 9 白直接競爭 準(zhǔn)曲線 by 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第三章 接競爭 劑盒的研制 27 加回收率試驗(yàn) 用兩種方法分析測定樣品（玉米）中的添加回收率，結(jié)果見表 5。由表 5 可以看出， 劑盒的添加回收率在 間， 表 5 劑盒樣品的添加回收率試驗(yàn) 5 of it 添加水 平 ng/復(fù) N 試劑盒