密級(jí) ： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文 源于多毛番茄控制果實(shí)顏色等性狀的 位及相關(guān)基因的研究 on of on of I 摘 要 番茄的果實(shí)顏色是重要的品質(zhì)指標(biāo)之一。果實(shí)顏色越深，番茄紅素含量越高，品質(zhì)越 好。最近研究還表明番茄紅素具有降低人類(lèi)患某些惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的保健功能。因此，通過(guò)遺傳改良，增加果實(shí)番茄紅素的含量是番茄品質(zhì)育種的重要目標(biāo)。圍繞這一目標(biāo)，國(guó)內(nèi)外研究者從生理生化代謝、基因表達(dá)調(diào)控等方面進(jìn)行了廣泛、深入的研究。同時(shí)，在野生資源的挖掘利用方面也做了大量的工作。對(duì)番茄紅素代謝過(guò)程中的一些重要酶的基因已經(jīng)進(jìn)行了遺傳定位和分離、克隆。例如，研究表明 牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸 合成酶（ 番茄紅素合成過(guò)程中的限速酶之一，編碼該酶的基因被初步定位在番茄第 4染色體的末端。從普通番茄和野生番茄中鑒定出了 108 個(gè) 與果實(shí)顏色有關(guān)的 建立了相應(yīng)的漸滲系或近等基因系。其中， 生多毛番茄 (一個(gè)漸滲系，含有來(lái)自 4 染色體末端 1 段長(zhǎng) 50染色體片段。研究表明該染色體片段含有增強(qiáng)果實(shí)顏色的基因，但是該外源染色體依然較長(zhǎng)，有一些不良性狀的連鎖累贅。另外，該區(qū)段的分子標(biāo)記數(shù)量不夠飽和。 本研究擬在前人研究的基礎(chǔ)上，為 4 染色體上的外源片段建立更飽和的分子標(biāo)記圖譜，對(duì)該片段上調(diào)控果實(shí)顏色等性狀的基因（ 行定位，對(duì) 因進(jìn)行精細(xì)定位，并分 析該基因與果實(shí)顏色之間的關(guān)系。目的是為利用分子標(biāo)記輔助選擇獲得外源染色體片段更短、不良連鎖累贅效應(yīng)更小的高番茄紅素優(yōu)異種質(zhì)材料，為豐富人們對(duì)番茄紅素合成途徑調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步了解提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： 1 利用 標(biāo)記，構(gòu)建了番茄第 4 染色體末端長(zhǎng) 50色體片段精密分子遺傳圖譜，該圖譜由 33 個(gè)標(biāo)記構(gòu)成。 兩個(gè)標(biāo)記之間的平均距離為 中 17 個(gè)標(biāo)記，包括 3 個(gè) 記、 2 個(gè) 記、 1 個(gè) 記、 1 個(gè) 2個(gè) 1個(gè) 個(gè) 本研究新發(fā)展的標(biāo)記。 2. 利用 記 記 別 對(duì) 及 共 2000 個(gè) 株進(jìn)行篩選，得到含目的染色體片段的重組單株 31 個(gè)。對(duì) 31 個(gè)重組單株進(jìn)行遺傳分析表明這些材料含有的外源基因片段在不同程度上都比 ，處于 標(biāo)記 素含量高，可以應(yīng)用到育種中。 3. 利用單標(biāo)記分析法對(duì) 的果實(shí)顏 色等性狀進(jìn)行 位，在標(biāo)記 間，檢測(cè)到一個(gè)控制番茄紅素含量的 將其命名為 標(biāo)記 測(cè)到 12 個(gè)控制果實(shí)顏色系數(shù) L（亮度）、 A（紅色度）、 B（黃色度）、 度）、 調(diào)）、 A/B、（ A/B） 2等的 中 5 個(gè)控制外部果實(shí)顏色系數(shù)的 分別是 、 A/B） 2， 7 個(gè)控制勻漿果實(shí)顏色系數(shù)的 分別是 、 A/B） 2、 此外，還檢測(cè)到兩個(gè)控制果實(shí)平均重的 一個(gè)控制可溶性固形物含量的 兩個(gè)控制果形指數(shù)的 茄紅素含量 與基因 步推測(cè)作為類(lèi)胡蘿卜素上游的 . 對(duì) 6203的兩個(gè)材料的 處堿基存在差異，通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物 12 個(gè)近等基因系進(jìn)行遺傳鑒定， 結(jié)果將 因定位在 有的染色體片段內(nèi)，在標(biāo)記 間。利用 31 個(gè)重組單株對(duì) 因特異標(biāo)記進(jìn)一步驗(yàn)證，將此基因定位在標(biāo)記 59 和 間。通過(guò)相關(guān)性分析表明該標(biāo)記與番茄紅素及果實(shí)顏色系數(shù)之間存在極顯著或顯著的關(guān)聯(lián)， 進(jìn)一步從分子水平證明因內(nèi)堿基的差異有可能是導(dǎo)致兩個(gè)材料果實(shí)顏色之間存在 差異的原因。 進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)得到的 擬南芥中的 類(lèi)關(guān)系最近，表明該酶可能存在于質(zhì)體中為質(zhì)體中葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素以及貝殼杉烯和赤霉素等提供前體物質(zhì) 記的原理和多引物 術(shù)，建立了一種共顯性標(biāo)記技術(shù) 記對(duì) 12 份番茄近等基因 系進(jìn)行遺傳鑒定和 1000個(gè) 速、簡(jiǎn)便、成本低的特點(diǎn)，可用于番茄和其它作物的分子育種。同時(shí)在鑒定雜交 種子的純度，以及農(nóng)作物新品種審定、保護(hù)品種的知識(shí)產(chǎn)權(quán)等方面也提供了方法和技術(shù)借鑒。 速、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)果實(shí)顏色和番茄紅素的方法，本研究采用 果皮、果膠、胎座以及勻漿的果實(shí)顏色進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)對(duì)番茄紅素含量與果實(shí)顏色系數(shù) L、 A、 B、 A/B、（ A/B） 2等的相關(guān)分析結(jié)果表明，番茄紅素含量與囊果皮、果膠、勻漿的果實(shí)顏色系數(shù) 明果實(shí)內(nèi)的番茄紅素含量主要與番茄果實(shí)的果肉和果膠有關(guān)。同時(shí)建立了果實(shí)顏色系數(shù)與 番茄紅素的回歸方程，結(jié)果表明 、 Y（ A/B） 2三個(gè)果實(shí)顏色系數(shù)的回歸方程對(duì)番茄紅素含量的預(yù)測(cè)值與實(shí)際測(cè)定值之間的符和程度較高。說(shuō)明可以用色差儀對(duì)番茄紅素含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，該方法簡(jiǎn)單方便、省時(shí)省力，避免了 方法測(cè)定中存在周期長(zhǎng)，價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，由于該儀器體積小，攜帶方便，為育種家在田間品種選育上提供了新方法。 關(guān)鍵詞 ：番茄，果實(shí)顏色，番茄紅素， is of on of of to a in A to Up to 108 is a in 6203 a 50cM of . As as in is on we to in of 1)of ) a be as 1. of 3 is on 17 1 1 1 in 2. A 000 F2 6203 6203 0974 1546 6203 in 1 a 0cM by 0974 a be 3. 0974 12 by by 、 A/B） 2 、 、 A/B）2、 0974by TL by 0974 in it is be to of . 6203 by by by by 0974 on of 1 23/a of in to in of 5. We to 000 F2 is by It is AS in 6. In to a we by a UE of is A/B, A/B） 2 of to of of be to of on of in a in It a V 目 錄 第一章 引 言 . 1 1 番茄果實(shí)類(lèi)胡蘿卜素合成途徑及基因工程研究 . 2 胡蘿卜素合成途徑 . 2 基因研究 . 5 2 番茄第 4 染色體上果實(shí)顏色等 研究概況 . 6 3 番茄果實(shí)顏色評(píng)價(jià)方法研究概況 . 8 于番茄果實(shí)顏色的幾種評(píng)價(jià)方法 . 8 于色差儀測(cè)定方法及測(cè)定參數(shù)的分析 . 9 于幾種評(píng)價(jià)方法的相關(guān)性 . 9 4 基因精細(xì)定位 . 10 于作圖群體 . 10 于分子標(biāo)記 . 11 位方法 . 12 5 本研究的目的和意義 . 13 第二章 番茄第 4 染色體末端分子遺傳圖譜的構(gòu)建 . 14 第一節(jié) 利用胚培養(yǎng)對(duì) 2 個(gè)番茄 雜交組合加代 . 14 1 材料與方法 . 14 料 . 14 法 . 14 2 結(jié)果與分析 . 14 同成熟度的胚對(duì)培養(yǎng)結(jié)果的影響 . 14 3 討論 . 16 佳的胚培養(yǎng)時(shí)期 . 16 響胚培養(yǎng)成活率的其它因素 . 16 第二節(jié) 分子標(biāo)記的篩選 . 17 1 材料與方法 . 17 料 . 17 驗(yàn)方法 . 17 2 結(jié)果與分析 . 23 的染色體片段的 記的篩選及其對(duì)近等基因系的遺傳鑒定 . 23 標(biāo)記轉(zhuǎn)化為 析結(jié)果 . 24 記分析結(jié)果 . 26 析結(jié)果 . 27 3 討論 . 31 第三節(jié) 特異 記的獲得 . 34 1 材料與方法 . 34 料 . 34 法 . 34 2 結(jié)果與分析 . 35 的片段的回收測(cè)序 . 35 序結(jié)果及引物設(shè)計(jì) . 36 異 記的轉(zhuǎn)化 . 36 3 討論 . 38 第四節(jié) 第 4 染色體末端分子遺傳圖譜的構(gòu)建 . 39 1 材料與方法 . 39 料 . 39 驗(yàn)方法 . 39 2 結(jié)果與分析 . 41 組體的篩選 . 41 用 標(biāo)記對(duì)重組體的遺傳鑒定結(jié)果 . 42 鎖圖譜的構(gòu)建 . 45 3 討論 . 46 第三章 番茄第 4 染色體果實(shí)顏色等性狀的 . 50 第一節(jié) 番茄 果實(shí)顏色評(píng)價(jià)方法的研究 . 50 1 材料與方法 . 50 料 . 50 驗(yàn)方法 . 50 2 結(jié)果與分析 . 52 實(shí)顏色相關(guān)系數(shù)測(cè)定 . 52 茄紅素含量測(cè)定 . 53 茄紅素含量與果實(shí)顏色系數(shù) . 54 歸預(yù)測(cè)研究 . 55 3 討論 . 57 、 A、 B 等果實(shí)評(píng)價(jià)系數(shù) . 57 茄紅素含量與果實(shí)顏色評(píng)價(jià)系數(shù)的相關(guān)性 . 58 歸預(yù)測(cè) . 58 第二節(jié) 番茄第 4 染色體上影響果實(shí)性狀的基因研究 . 61 1 材料與方法 . 61 料 . 61 實(shí)顏色評(píng)價(jià)、果實(shí)平均重 、果形指數(shù)、可溶性固形物的測(cè)定 . 61 傳參數(shù)計(jì)算 . 61 析 . 61 2 結(jié)果與分析 . 62 茄紅素、果實(shí)平均重、果形指數(shù)、可溶性固形物的田間表現(xiàn) . 62 實(shí)顏色等性狀的定位 . 63 3 討論 . 66 第四章 番茄類(lèi)胡蘿卜素合成途徑中 因的 定位和功能研究 . 69 1 材料與方法 . 69 料 . 69 驗(yàn)方法 . 70 2 結(jié)果與分析 . 71 并引物設(shè)計(jì) . 71 并引物 擴(kuò)增和測(cè)序 . 72 因的初步定位 . 75 因的進(jìn)一步定位及功能研究 . 76 3 討論 . 77 第五章 術(shù)的建立 . 79 1 材料與方法 . 79 料 . 79 提取 . 79 術(shù)的建立 . 79 用 術(shù)對(duì)標(biāo)記 行轉(zhuǎn)化 . 80 2 結(jié)果與分析 . 81