密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 五指山豬近交系矮小性分子遺傳基礎(chǔ)研究 of he of 要 五指山豬（ 我國著名珍稀豬種，是原產(chǎn)于海南島中南部山區(qū)的一個(gè)瀕臨滅絕的地方豬種，成年體重僅 30為正常豬種體重的 15而且具有抗逆性強(qiáng)、性成熟早、肉質(zhì)好、遺傳穩(wěn)定等特性，經(jīng)近 20 年來的異地保種、實(shí)驗(yàn)化近交繁育，目前已培育成近交系群體并已獲得 體（近交系 數(shù)高達(dá) 由于其在解剖學(xué)、生理學(xué)特性、營養(yǎng)代謝等方面與人類極為相似，已在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，已成為研究人類疾病理想的動(dòng)物模型，并列為我國異種器官移植、組織工程和“國家實(shí)驗(yàn)用小型豬種質(zhì)資源保存和開發(fā)中心”首選種豬。 本研究以 純種近交 16 代 實(shí)驗(yàn)材料，對其內(nèi)分泌生長軸相關(guān)基因進(jìn)行了一系列分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究，旨在探討 交系矮小的分子機(jī)理，并為其成為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型提供科學(xué)的理論依據(jù)。 1） 采用 法檢測了三月齡的大白豬和 交系的血清 量，比較發(fā)現(xiàn) ：交系血清 度略低于大白豬，但二者之間差異不顯著（ P而 交系血清 度顯著低于大白豬（ 2. H DS H 16 of H by H T at 6, al G A at 5, ln in be of 3. 917bp HR DS HR 38 of DS by HR HR of DS in 65 N3 HRs 4. A in DS s t of DS 30 5. s GH HR IV s GH 0 of As a of no s 6. s GH s 000. to in as in 度（ ng/ 而 交系血清 度明顯低于大白豬，達(dá)到顯著水平（ 豬 度（ ng/ 本實(shí)驗(yàn)測定的血清 量比姚惠娟和鮑世民的研究結(jié)果要低（姚惠娟等， 2002；鮑世民等， 2002），這可能是由于 沖式釋放的原因所造成。 由腦垂體前葉分泌的單鏈多肽，它直接作用于全身的組織細(xì)胞，可增加細(xì)胞的體積和數(shù)量，并與其他垂體激素協(xié)作以保證個(gè)體正常的生長。 平生理性平衡主要保證個(gè)體正常生長發(fā)育，如果平病理性失衡，可導(dǎo)致巨人癥或侏儒癥等臨床癥狀。 的作用是通過 要由肝細(xì)胞合 成和分泌，對機(jī)體生長發(fā)育起著重要調(diào)節(jié)作用（ 1998; 1999） 。 進(jìn)體脂的合成、乳腺和卵巢的發(fā)育；以及促進(jìn)某些性腺分泌性激素。 般的，生長速度快的豬高于生長速度慢的豬（ et 1995）。 品種內(nèi)公母之間差異不顯著（ P而 交系血清 度明顯低于大白豬，達(dá)到顯著水平（ P其中 交系母豬血清 平顯著低于大白豬母豬（ P 盡管 交系 號(hào)位置發(fā)生氨基酸替換，纈氨酸替換丙氨酸（ A V）， 22 號(hào)位置 交系發(fā)生氨基酸替換，谷氨酰胺替換精氨酸（ R Q）。但這兩處氨基酸替換均位于信號(hào)肽編碼區(qū)，對 成熟肽沒有影響； 能會(huì)影響到 比對大白豬的 因編碼區(qū)推導(dǎo)蛋白氨基酸序列與 交系 外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域均存在兩處氨基酸替換，其中 165 號(hào)位置的氨基酸替換位于 守結(jié)構(gòu)域中，推測該氨基酸替換可能對 結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要的影響。其結(jié)構(gòu)與功能性變化類似侏儒人和侏儒鼠。 交系 因編碼區(qū) 393編碼區(qū)僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)同義突變，未引起所編碼氨基酸的變化。 構(gòu)建了 交系 因原核表達(dá)載體，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)， 交系 到正確表達(dá)，在目的分子量處出現(xiàn)特異性條帶，經(jīng)軟件掃描，其含量約占菌液總蛋白的20； 交系 因并沒有發(fā)現(xiàn)特異性條帶，推測可能是由于大腸桿菌的密碼子偏愛造成了該基因在原核生物中表達(dá)困難。 構(gòu)建了 交系 因、大白豬和 交系 因真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞 行表達(dá)，采用相對定量 法檢測 因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 轉(zhuǎn)染大白豬 因的細(xì)胞 因表達(dá)水平顯著高于轉(zhuǎn)染其它三種質(zhì)粒的細(xì)胞（ P轉(zhuǎn)染交系 因的細(xì)胞 因的表達(dá)水平最低，推測 交系 因所發(fā)現(xiàn)的氨基酸替換可能會(huì)影響其下游 因的表達(dá)，從而會(huì)影響 促生長作用。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士 學(xué)位論文 第六章 結(jié)論 54 研究存在的不足 由于個(gè)人能力的有限，試驗(yàn)條件的限制等方面的因素影響，試驗(yàn)結(jié)果中還有不夠完善之處： 1）沒能通過原核表達(dá)獲得 交系 因的表達(dá)產(chǎn)物，因此不能作進(jìn)一步的分析； 2）由于經(jīng)驗(yàn)不足，導(dǎo)致在構(gòu)建 因真核表達(dá)載體以及真核表達(dá)時(shí)占用了大量時(shí)間。 一步工作的設(shè)想 1) 對于 交系 因的原核表達(dá)產(chǎn)物，還需作進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究， 如通過 對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化并制備抗體，然后進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定、蛋白質(zhì)印跡分析和免疫組織化學(xué)方法的檢測。 2) 進(jìn)行 選濃度的優(yōu)化篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 交系 因的真核表達(dá)細(xì)胞，并對細(xì)胞水平的 蛋白質(zhì)合成、脂生成和 磷酸化進(jìn)行檢測，進(jìn)一步證實(shí)該基因的作用。 3）運(yùn)用定點(diǎn)突變的方法獲得一系列 交系 突變體基因，并構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染細(xì)胞并獲得表達(dá)后，研究 其突變體的生物活性。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 附圖 55 附 圖 附圖 1： 交系 因的 列和推測的蛋白質(zhì)序列 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 附圖 56 附圖 2： 交系 因的 列和推測的蛋白質(zhì)序列 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 附圖 57 附圖 3： 交系 因的 列和推測的蛋白質(zhì)序列 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 參考文獻(xiàn) 58 參考文獻(xiàn) 1. 白俊杰，馬進(jìn)，簡清，等魚生長激素基因在大腸桿菌中表達(dá)水平的研究 J中國水產(chǎn)科學(xué)，2000， 7（ 1）： 3134 2. 白俊杰，葉星，李新輝，等豬生長激素 隆及在大腸桿菌中的表達(dá) J華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2001， 20（ 2）： 99 102 3. 鮑世民 ，馬勝成，張德福豬生長激素測定 J上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)， 2002，（ 3）： 81 4. 陳清軒，曹頡，宋德秀，等豬生長激素基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究 J生物化學(xué)雜志， 1997， 13（ 5）： 540 545 5. 鄧?yán)?張為民 ， 林浩然 生長激素受體的研究進(jìn)展 J 動(dòng)物學(xué)研究， 2001， 22（ 3）： 226230 6. 方美英，劉紅林，姜志華，等 6 個(gè)豬種胰島素樣生長因子 因座位遺傳多態(tài)性檢測 J 畜牧與獸醫(yī)， 1999， 31（ 1）： 12 13 7. 馮書堂，褚武軍，王雅春，等中國五指山豬 北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社， 1999， 30 50 8. 姜志華， 豬生長激素基因第二外顯子區(qū)域遺傳變異的序列基礎(chǔ) J南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1997， 20（ 2）： 67 71 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