蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 皮膚創(chuàng)傷再生和瘢痕愈合中 A 和 前 言 皮膚損傷的再生修復(fù)與瘢痕演變是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，近年來(lái)由于細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)在再生修復(fù) 方面機(jī)制的認(rèn)識(shí)有了很大的進(jìn)展。皮膚再生修復(fù) 共同完成。填充于膠原間的蛋白聚糖調(diào)控膠原等 細(xì)胞的功能，在皮膚創(chuàng)傷再生修復(fù)及瘢痕愈合中發(fā)揮著重要作用，盡管科研工作者們?cè)噲D闡明確切機(jī)制，但其中具體機(jī)理目前還不完全清楚。 人體皮膚（ 表皮和真皮所構(gòu)成，真皮（ 于表皮下方，由致密結(jié)締組織構(gòu)成，對(duì)表皮起連接、支持、營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)等作用，并參與創(chuàng)傷愈合。真皮分乳頭層（ 網(wǎng)織層（ 層，二者之間無(wú)明顯界限，厚度約為 1頭層纖維致密，細(xì)胞數(shù)目多，富含大量的毛細(xì)血管和感覺(jué)神經(jīng)末梢，且與表皮緊密連接。網(wǎng)織層是構(gòu)成真皮的主體部分，因富含成纖維細(xì)胞、膠原纖維以及細(xì)胞外基質(zhì)等，構(gòu)成框架結(jié)構(gòu)，故保持了皮膚的彈性與韌性，此外，還有血管、神經(jīng)、淋巴管以及毛囊、皮脂腺等結(jié)構(gòu) 1。 皮膚損傷深度 （ 組織層次 ） 的不同， 可 再生與瘢痕愈合 。皮膚附 屬器存在是再生 （ 完全愈合 ） 的前提 。 當(dāng)皮膚 淺層（真皮乳頭層） 損傷后， 因真皮網(wǎng)狀層存在毛囊 傷后由 這些附屬器細(xì)胞及其內(nèi)的干細(xì)胞、傷口 鄰近 的 正常 皮膚 基底細(xì)胞 和真皮層纖維細(xì)胞 增殖來(lái)實(shí)現(xiàn)再生 2。但損傷網(wǎng)狀層后會(huì)導(dǎo)致成纖維細(xì)胞（ 活化、增殖、合成膠原以及分化異常，最終形成瘢痕增生 。 多項(xiàng)研究觀察表明， 真皮組織缺損的 深 度和瘢痕增生程度 成正比 ，真皮組織回植于組織缺損 傷口 可減輕瘢痕的增生 3。將真皮組織切取后，完整覆蓋于瘢痕疙瘩與慢性潰瘍 傷口 ，能促進(jìn)表皮生長(zhǎng) ，皮 膚彈性的增加，并且抑制了移植皮膚收縮及瘢痕的增生 4， 體外構(gòu)建組織工程皮膚形成 和 自體皮內(nèi)植入復(fù)合異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì) 可 提高傷口愈合 5 蛋白聚糖（ 一類重要而獨(dú)特的蛋白糖復(fù)合物，研究始于 19世紀(jì)末， 20世紀(jì) 50年代才逐漸認(rèn)識(shí)到 帶負(fù)電荷的糖胺聚糖鏈通過(guò)共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)連接而成。 存在于細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒之中。按其結(jié)構(gòu)和特性分為 6種：腱糖蛋白 （ 、透明質(zhì)酸蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 皮膚創(chuàng)傷再生和瘢痕愈合中 A 和 （ 、硫酸 角質(zhì)素 （ 、核心蛋白聚糖 （ 、硫酸乙酰肝素 （ 、多功能蛋白聚糖 （ 。鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)組織中呈較高水平表達(dá) 8， 而且 ，乳頭層 與角質(zhì)形成細(xì)胞結(jié)合；隨著真皮再生的完成， 志等 9研究表明，在培養(yǎng)基中補(bǔ)充 少 示 用。但目前該方面的研究報(bào)道較少。 主要分布于真皮乳頭 層 的 分靠近基底膜血管和皮膚附件，表達(dá)呈線形，在真皮中分布極微 。 而 兩側(cè)環(huán)繞基底膜；棘細(xì)胞層的最上部有中等濃度的 透明質(zhì)酸 ，可能與刺激 透明質(zhì)酸 釋放的物質(zhì)位于基底層附近有關(guān) ， 且更有利于皮膚再生。 蛋白激酶 C（ , 由多種具有不同生物學(xué)特性的同工酶組成 的絲氨酸 /蘇氨酸激酶家族成員 10,11，分子量為 77據(jù) 將其分為 3類 12： 1）經(jīng)典型 ，由 、 1、2、 四種亞型組成。 2） 新型 ，包括 、 、 和 五種亞型。 3）非典型 ，包括 和 三種亞型。大量研究表明， 不同的組織表達(dá)和 特定的細(xì)胞內(nèi)定位 13， 對(duì)激活信號(hào)的敏感性和特異性 以及 生物學(xué) 作用并不完全相同 14,15。 實(shí)驗(yàn)表明，將 制 殖 16；腎上腺素與 受體結(jié)合后 激活 制 17，但具體激活了何種亞型還有待進(jìn)一步研究。 導(dǎo)致 18。張選奮等 19發(fā)現(xiàn)，在兔耳、人體皮膚肉芽組織、周邊組織及瘢痕組織內(nèi) 明在 傷口 愈合和瘢痕增生過(guò)程中有活化 20,21。 然而 ， 分布 以及 再生 和 瘢痕修復(fù)過(guò)程中的表達(dá) 變化 未見(jiàn) 研究 報(bào)道 。 近年來(lái)， 學(xué) 者們制作了 多種 動(dòng)物皮膚創(chuàng)傷再生 或 瘢痕愈合的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。 皮膚創(chuàng)傷 模型分為切開(kāi)和 切除 模型兩種，用于研究愈合過(guò)程和瘢痕演變 2,22。有關(guān)皮膚創(chuàng)傷 再生 修復(fù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ王r見(jiàn)報(bào)道 ， 關(guān)于皮膚創(chuàng)傷再生 國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道 。 本實(shí)驗(yàn)擬建立兔耳腹側(cè)皮膚再生與瘢痕愈合的一體化模型。應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)和核酸分子原位雜交技術(shù)檢測(cè) 傷口 再生與瘢痕愈合過(guò)程中 、 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 皮膚創(chuàng)傷再生和瘢痕愈合中 A 和 變化及表達(dá)差異。 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 皮膚創(chuàng)傷再生和瘢痕愈合中 A 和 材料與方法 1 材料 物 本實(shí)驗(yàn)所用新西蘭大耳白兔 18 只 （ 蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供 ，普通動(dòng)物，合格證號(hào)：）， 雌雄不限，體重 只單籠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后進(jìn)行試驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程獲得蘭州大學(xué)動(dòng)物倫理 委員會(huì)批準(zhǔn) ， 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均受到人文關(guān)懷 。 料 脫載玻片 南通天盛實(shí)驗(yàn)器材有限公司 2. 2存管 美國(guó) 液器頭 美國(guó) 要試劑 1. 鼠抗兔 克隆抗體 國(guó) 2. 鼠抗兔 克隆抗體 國(guó) 3. 小鼠 劑盒 武漢博士德生物工程有限公司 4. 位雜交檢測(cè)試劑 武漢博士德生物工程有限公司 5. 位雜交檢測(cè)試劑盒 漢博士德生物工程有限公司 6. 色試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司 7. 天津市光復(fù)化工科技公司 8. 檸檬酸 ( 天津市濱?；瘜W(xué)試劑有限公司 9. 武漢博士德生物工程有限公司 10. 過(guò)氧化氫 (3%) 天津市光復(fù)化工科技公司 11. 原位雜交用 武漢博士德生物工程有限公司 12. 戊巴比妥鈉 國(guó)，國(guó)內(nèi)分裝 13. 武漢博士德生物工程有限公司 14. 硫化鈉 (25%) 天津化學(xué)試劑公司 15. 胰蛋白酶 (3%) 武漢博士德生物工程有限公司 16. 一抗稀釋液 武漢博士德生物工程有限公司 17. ) 國(guó)，國(guó)內(nèi)分裝 試劑為 分析純。 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 皮膚創(chuàng)傷再生和瘢痕愈合中 A 和 驗(yàn)儀器 國(guó)） 康， 湖北亞光， 海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠， 海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠 海梅香儀器廠） 500國(guó)） 600L，日本） 特， 像分析軟件 (國(guó)） 計(jì)分析軟件（ 國(guó)） 石蠟切片機(jī) 組織攤烤片機(jī) 石蠟包埋機(jī) 核酸分子原位雜交儀 光學(xué)顯微鏡 微量振蕩器 耳再生 新西蘭大白兔 18 只，雌雄不限，體重 單 只分籠觀察飼養(yǎng) 1W（ 圖1使用 5%硫化鈉膏進(jìn)行兔耳腹側(cè)脫毛，飼養(yǎng) 3 天后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 。 模型是 借鑒 使用激光、機(jī)械磨削皮膚后損傷至真皮乳頭層的傷口可以再生而缺損深度 到達(dá)蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 皮膚創(chuàng)傷再生和瘢痕愈合中 A 和 網(wǎng)織層甚至更深的組織時(shí)瘢痕修復(fù)的原理 制作。 兔耳緣靜脈注射 3%戊巴比妥鈉注射液（ 1ml/醉，將兔耳腹側(cè)組織充分展平，放置于自制的固定臺(tái)（體積為 .0 將 自制的 取皮 刀片固定 妥當(dāng)，放置于耳尖處，刀刃面與兔耳皮膚呈約 25夾角，力量均勻向兔耳根部切割傷口，切割過(guò)程中，仔細(xì)觀察 傷口 深度，切取深度到達(dá)耳軟骨表面， 在 兔耳腹側(cè)切割出面積 約 為10 0淺 到 深 的 切口 。 分別于每只 制作 兩個(gè) 傷口 ， 間距約 計(jì)72 個(gè) 。 每次均 為同一方向切割兔耳組織 （由耳尖至耳根均為由淺至深）。 在傷后 0h、 3d、 6d、 9d、 12d、 27d，任意切取 3 只兔耳部 傷口 （切取面積為超出 傷口 邊緣 2全層皮膚組織），共 12 例標(biāo)本，固定于多聚甲醛溶液中，分別行 色、免疫組織化學(xué)染色以及核酸分子原位雜交檢測(cè)。 圖 1 兔耳皮膚再生 of of in 劑配置 8g 用 30g 1000州大學(xué)碩士學(xué)位論文 皮膚創(chuàng)傷再生和瘢痕愈合中 A 和 0.4 g 3. 1% 1.0 d 1000.0 . 1 . 4% % 滴定 500.0 度 60 5. 1% % 500 500 . 10 g 檸檬酸鈉 44.1 g 1% . 20 檬酸鈉 % . 50 檬酸鈉 % 州大學(xué)碩士學(xué)位論文 皮膚創(chuàng)傷再生和瘢痕愈合中 A 和 9. 20%甘油 甘油 0. 3%檸檬酸 6 1. 蛋白酶 胰蛋白酶 實(shí)驗(yàn) 步驟 理 切片 1） 脫水透明 ： 將標(biāo)本取 出后用水 沖洗 、沿由淺至深方向從正中切開(kāi)， 切 開(kāi)面 朝下方放入組織包埋盒內(nèi)，蓋好蓋片，標(biāo)記后放入全自動(dòng) 乙醇脫水 機(jī)內(nèi)進(jìn)行組織脫水， 此過(guò)程 具體 步驟 為 ： 80%、 90%、 95%、 100%各種濃度乙醇 盒內(nèi) 2 小時(shí)。 2） 浸蠟、包埋 ：將脫水后的組織放置于已加熱至 56的 石蠟 液中，分三次（第 1 次 30 2 次 90 3 次 90浸 蠟 ，取代組織中含有的透明劑。浸蠟后的組織 放于組織包埋盒中矢狀面朝下，移至石蠟組織包埋機(jī)出蠟口下方，用眼科鑷加以固定，注入液態(tài)石蠟，組織完全被石蠟浸沒(méi)后，將包埋盒移至冷臺(tái)， 石蠟 迅速 凝固，組織即被包在其中， 形成 蠟塊。 3） 切片和貼片 ：在每張載玻片上標(biāo)記 （ 3d、 6d、 9d、 12d、 27d） ，每組切 11張蠟片（ 1張 普通載玻片撈取 ，免疫組化 和 原位雜交 各 5張用為 防脫載玻片撈取 ）。 將蠟塊放入盛有水的容器中，置于冰柜中冷凍， 15塊組織 均從 傷口 淺層至深層的方向 固定于切片機(jī)持蠟器上，刀片安裝于刀臺(tái)后固定穩(wěn)妥，調(diào)整切片厚度為 調(diào)整 恒溫水箱溫度至 40，修整蠟塊距組織邊緣約 從皮面下刀 開(kāi)始切片，用鑷子將切好的蠟帶輕輕移至水面上充分展平，載玻片中段部撈起蠟片，傾斜移去余水，置于 60恒溫箱內(nèi)，普通片烤片 1小時(shí)，防脫片烤片 2小時(shí)，以脫去熔化 的 組織間隙的石蠟。 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 皮膚創(chuàng)傷再生和瘢痕愈合中 A 和 E 染色 （ ） 切片 置于 二甲苯 I 中脫蠟 10甲苯 號(hào) 5水酒精內(nèi)洗 12次 ， 95%酒精 190%酒精 1度 85%酒精 1來(lái)水再洗 2在蘇木精素染色 5次置于自來(lái)水中清洗 11%鹽酸酒精分化 20s，自來(lái)水洗 1水（ 1%）中進(jìn)行返藍(lán)作業(yè) 30s，其次置于自來(lái)水中洗滌 1紅染色 20s，自來(lái)水洗 30 秒之后， 85%乙醇中進(jìn)行脫水 20 秒， 90%酒精 30 秒鐘，依次為： 95%號(hào)酒精 195%號(hào)酒精 1水酒精號(hào) 2水乙醇號(hào) 2甲苯號(hào)浸 2二甲苯 號(hào)浸 2二甲苯 號(hào) 2性樹(shù)膠 封片 。 n C 與 色 （ ） 首先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，按照抗體說(shuō)明書推薦最佳稀釋濃度值，將 一抗原液按照 1:100、 1:300、 1:500 三種比例稀釋， 抗原液按照 1:300、 1:800、 1:2000三種比例稀釋，并同時(shí)使用三種抗體濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)， 依照最后顯色結(jié)果確定最佳反應(yīng)濃度 ： 為 1:500， 1:800。 1. 切片 常規(guī) 脫蠟 至 水：二甲苯 號(hào) 10甲苯 號(hào)內(nèi) 5水 乙醇號(hào) 5水酒精 號(hào) 5水酒精 號(hào)中 595%酒精 585%酒精 5餾水 10 洗 5 次。 2. 30% +蒸餾水 10 份混合，室溫 10活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水洗 33 次。 3. 熱 抗原修復(fù)： 將切片放入盛有 檬酸鹽緩沖液的高壓鍋內(nèi)（ 右） ， 電磁爐加熱至沸騰后計(jì)時(shí) 3電，冷卻后取出，用 沖液（ 滌 5 次。 4. 加 5%閉液，室溫 20甩去多余液體，不洗 。 5. 別在切片上滴加三種濃度的一抗稀釋液， 4過(guò)夜，次日取出后放于 37恒溫箱復(fù)溫 20 23 次。 6. 加 濃度為 物素化兔抗山羊 37 20 23 次 。 7. 加 劑， 37 20 54 次 . 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 皮膚創(chuàng)傷再生和瘢痕愈合中 A 和 8. 色使用 色試劑盒（ 取 1餾水，在試管中加入 A、 B、 C 試劑各 1 滴，充分混勻后加至切片上，室溫下顯色，鏡 下嚴(yán)格控制顯色劑反應(yīng)時(shí)間， 8 分鐘后自來(lái)水終止顯色，蒸餾水洗 22 次。 9. 蘇木素液復(fù)染，脫水、透明并封片，顯微鏡下觀察。 1酸分子原位雜交 在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前， 實(shí)驗(yàn) 所有試劑 及 器械均 用 理， 并且將手術(shù)器械用 120 、 30壓處理， 實(shí)驗(yàn)過(guò)程 依照無(wú)菌原則操作 ，以防實(shí)驗(yàn)中 1. 切片脫蠟 至 水 ： 二甲苯 10甲苯 5水 乙醇 5水酒精 5水酒精 595%酒精 585%酒精 5餾水 10 洗 5 次。 2. 3%別加至每張切片上，充分浸沒(méi)組織，放置于室內(nèi) 10消除 內(nèi)源性酶， 然后放置于 蒸餾水 中 洗 5 分鐘 3 次。 3. 暴露 信使核糖核酸的核酸 片段： 將濃度為 3%檸檬酸新鮮稀釋 好的 胃蛋白酶 液 （ 3%檸檬酸 1濃縮型胃蛋白酶 液 2 滴） 加于 切片上 ，放置于溫箱內(nèi)調(diào)溫至 37 消化 20 分鐘 ，用 洗 53 次 ，置于 蒸餾水 洗缸洗 5 4. 后固定： 胃蛋白酶消化后用 理過(guò)的 1% 溫 下固定 10分鐘 ， 置于 蒸餾水 洗缸內(nèi)洗 53 次。 5. 預(yù)雜交： 將為 20%的 甘 油 20入干雜交盒底部，以 保持 雜交過(guò)程中切片的 濕度， 避免造成干片，在 每張切片 上滴入原位雜交 預(yù)雜交液 20l， 置于恒溫箱 內(nèi)設(shè)置溫度在 38 后，進(jìn)行預(yù)雜交 2 小時(shí) ， 取出后 吸 去切片上的 余液。 6. 雜交： 將 雜交液 約 20l 分別滴加在每個(gè) 切片 內(nèi)（以雜交液完全浸沒(méi)組織為標(biāo)準(zhǔn)），并將 原位雜交專用蓋玻片 保護(hù)膜揭去后 蓋在切片上， 中性樹(shù)脂膠封住蓋玻片四周，放置于核酸分子原位雜交儀內(nèi)設(shè)定溫度為 37 ， 雜交過(guò)夜。 7. 雜交后洗滌： 用 眼科尖鑷子輕輕 揭 除封片膠及 蓋玻片， 37 的 252 次， 37 含 152 次， 37 含 洗 15 次。 8. 滴加封閉液 ： 37 20去 玻片上 多余液體，不洗。 9. 滴加生物素化鼠抗地高辛 ： 37 60位雜交用 5 次 ，蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 皮膚創(chuàng)傷再生和瘢痕愈合中 A 和 期間保持切片濕度，防止干片 。 10. 滴加 ： 37 20 5 次。 11. 滴加生物素化過(guò)氧化物酶 ： 37 20 ，用 5 次。 12. 色：將 配置好的 色劑 滴于組織上， 顯微鏡 下嚴(yán)格控制顯色時(shí)間， 10 自來(lái)水終止顯色，蒸餾水中 52 次 。 13. 復(fù)染： 切片放置于 蘇木素 溶液內(nèi) 染色 2充分水洗。 14. 分化 液內(nèi)浸泡 20s，水洗 2 次 ，返蘭 液 10洗 1 次 。 15. 酒精梯度脫水，二甲苯透明， 風(fēng)機(jī)吹干 ，中性樹(shù)膠封片。 16. 雜交時(shí)加入 作為空白對(duì)照 組 。 結(jié)果判讀：由病理實(shí)驗(yàn)室兩名醫(yī)師對(duì) 、 疫組化切片以及 1 位雜交 片 鏡下 進(jìn)行 結(jié)果判斷 。 、 性表達(dá)于真皮乳頭層的成纖維細(xì)胞，切片陽(yáng)性染色細(xì)胞呈棕黃色 ； 1要在表皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞胞漿、毛囊、皮脂腺中陽(yáng)性表達(dá) ，呈棕黃色。 3 半定量圖像分析 將 、 及 1 淺、深層 傷口 內(nèi) 的 表達(dá) 像分析軟件 進(jìn)行分析 ，顯微鏡 下 400 倍 觀察 ， 將 傷口 從淺側(cè)到深側(cè)分為 10 段 ，每段 傷口 面積為 1.0 取 切片 每段 組織 內(nèi) 100 個(gè)視野進(jìn)行分析， 并 進(jìn)行系統(tǒng)光密度校正， 0 為 白， 255 為 黑，數(shù)值 愈大表達(dá)水平 愈 高。 距離淺側(cè)邊 3傷口 自定義為 淺層傷口， 而 距離淺側(cè)邊 8傷口 自定義為 深層傷口 。 傷口收縮因深淺而不同，因此， 4傷口為過(guò)渡傷口。 4 統(tǒng)計(jì)學(xué) 分析 將 件 分析所得 出 的數(shù)據(jù)用均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差（ x s ）表示 ，并 采用 件包統(tǒng)計(jì)處理，方差齊性時(shí) ， 多組間均數(shù)比較采用方差分析（兩兩比較時(shí)使用最小顯著差異法） ，方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn) 法， P差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 皮膚創(chuàng)傷再生和瘢痕愈合中 A 和 結(jié) 果 1 一般狀況 所有 動(dòng)物 均 單只 分 籠飼養(yǎng) ， 進(jìn)食 活動(dòng) 均 良好， 實(shí)驗(yàn)中 動(dòng)物 無(wú)意外死亡 。 2 兔耳 傷口 愈合過(guò)程形態(tài)學(xué) 傷后 0h，傷口邊緣整齊 ， 可清晰看到 傷口 由淺至深的層次 。 傷后 3d， 可見(jiàn) 傷口 組織收縮、 血痂 形成，傷口周邊輕度 紅腫。 傷后 6d， 淺層 傷口 痂皮 與 創(chuàng)緣 皮膚剝離 ，揭開(kāi)痂皮， 可見(jiàn)新鮮肉芽組織 生長(zhǎng)，表面濕潤(rùn) ；深層血痂連續(xù)，與組織貼附 較 緊密，高 出皮 面。 傷后 9d，淺層 創(chuàng)緣皮膚向中央緊縮并已 愈合；深層 傷口 血痂 亦 完 整 脫落，大部分傷口已上皮化 。 傷后 12d，已 無(wú)法 辨 清 淺層 傷口 與正常皮膚的界限 ； 而 深層 傷口 則呈現(xiàn)出圓形、 凸起于皮面的 瘢痕 ，粉 紅 色，表面光滑 ， 質(zhì)地 較 韌。 傷后 27d， 淺層 無(wú)法辨 認(rèn) ； 深層傷口 為圓形 瘢痕 ， 凸起 于 皮面 ，色 澤與 周圍正常皮膚 較接近 ， 質(zhì)韌 （照片 1） 。 淺層 傷口 再生 修復(fù) ，無(wú)法辨別與周圍皮膚的差異；深層 傷口 瘢痕愈合。 0h 3d 6d 9d 12d 27d 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 皮膚創(chuàng)傷再生和瘢痕愈合中 A 和 照片 1 兔耳皮膚 傷口 愈合過(guò)程形態(tài)學(xué)。 淺層 傷口 最終呈現(xiàn)再生；深層 傷口 瘢痕愈合。 創(chuàng)傷后 9d， 淺層 傷口 已愈合 ； 深層 傷口 部分未上皮化 ， 多數(shù)已形成 新鮮的瘢痕組織 。傷后 27d，淺層 傷口 無(wú)法辨認(rèn)；深層傷口 形成增生性 瘢痕 。 of in d 27d d of a t 7d 3 傷后兔耳 傷口 愈合過(guò)程組織學(xué) （照片 2） 傷后 0h， 傷口 深度從 表皮 缺如 逐漸延及 真皮淺層 、皮下組織，直到 耳軟骨表面。淺層 傷口 及其周邊組織無(wú)明顯出 血 ， 深層 傷口 可見(jiàn) 大量紅細(xì)胞。 傷后 3d，淺層 傷口 結(jié)痂，棘層 增生、變 厚， 并可見(jiàn) 增生的 及 少量膠原纖維 ， 傷口 及 周邊組織水腫， 無(wú) 明顯炎 性 細(xì)胞浸潤(rùn) ； 深層 傷口 深達(dá)軟骨表面 ， 傷口 周邊 組織 輕度 水腫， 泛 增生 ，可見(jiàn)少量 出血，伴炎癥細(xì)胞 的 浸潤(rùn)。 傷后 6d， 淺層 傷口 表皮 基本恢復(fù) 完整， 但 比 周圍正常組織厚 ， 生；深層 傷口 棘細(xì)胞 明顯 增厚， 纖維 細(xì)胞明顯 增生， 創(chuàng)周 輕度水腫 且有 少量纖維素性滲出 和 紅細(xì)胞 分布 。 傷后 9d，淺層 傷口 表皮連續(xù) ，厚度也 接近 于 周圍正常組織厚度；深層 傷口棘層明顯增 厚 ，創(chuàng) 緣周圍 組織仍輕度水腫， 纖維細(xì)胞明顯增生。 傷后 12d，深層 傷口 纖維細(xì)胞 大量 增生，纖維成分增 多 ， 傷口 由致密纖維組織 所 填充，膠原纖維增加明顯，散在 少量 紅細(xì)胞。 傷后 27d，淺層 傷口 在 鏡下 與正常組織無(wú)法區(qū)分 ；深層 傷口 纖維細(xì)胞 、 膠原明顯增 多 。 0h 3d 6d 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 皮膚創(chuàng)傷再生和瘢痕愈合中 A 和 9d 12d 27d 照片 2 兔耳皮膚 傷口 （ 色 ， 40） 。 創(chuàng)傷后 9d，淺層 傷口 表皮連續(xù)，厚度接近周圍正常組織；深層 傷口 棘層明顯增厚，創(chuàng)緣周圍組織仍輕度水腫。傷后 27d，淺層 傷口 在鏡下與正常組織無(wú)法區(qū)分；深層 傷口 纖維細(xì)胞明顯增多。 of 40). d to of in in 7d be in 4 、 1 表達(dá) 層 傷口 的表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均高 于 淺層 傷口 陽(yáng)性表達(dá)于成纖維細(xì)胞， 呈棕黃色 。 在傷后 3d 的 淺層 和深層 傷口內(nèi)即有表達(dá)，傷后 9d 時(shí)達(dá)到高峰， 12d 后逐漸下降， 但 深層傷口 傷后 27d（瘢痕改建期）再次升高（ p。隨 傷口 加深， 傷口 的表達(dá)均增加 ： 傷后 127d 深層傷口 的 表達(dá) 明顯 高 于 淺層 傷口 （ p片 3，表 1） 。 層 傷口 表達(dá) 在各時(shí)間點(diǎn) 均較 淺層 傷口 低 達(dá)于真皮層，呈棕黃色 。 淺層 傷口 于傷后 3d 即有表達(dá) ，此后表達(dá)水平持續(xù)上升，于傷后 27d 時(shí)最高。深層 傷口 表達(dá)量傷后 持續(xù)上升 ， 第 9后逐漸下降。 傷后 12d 和 27d 淺層傷口 的 達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)均較深層傷口高（ p片 4，表 2） 。 層 傷口 表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)高 于淺層 傷口 要在表皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞胞漿、毛囊、皮脂腺表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色 。 淺層 傷口 于傷后 3d 即有表達(dá)，傷后 9d 時(shí)達(dá)到高峰， 12d 后逐漸下降。 深層 傷口 表達(dá)水平 在各時(shí)間點(diǎn) 較淺層 傷口 高 （ p照片 5，表 3） 。 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 皮膚創(chuàng)傷再生和瘢痕愈合中 A 和 層 傷口 表達(dá) 均 高于淺層 傷口 要在表皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞胞漿、毛囊、皮脂腺中陽(yáng)性表達(dá) ， 陽(yáng)性細(xì)胞染色呈棕黃色， 淺層 傷口 于 傷后 3d 即有表達(dá) ， 傷后 9d 時(shí)達(dá)到高峰， 12d 后逐漸下降 。 深層傷口 表達(dá)量逐漸增加， 9d 時(shí)達(dá)到 高峰。 深層 傷口 各時(shí)間點(diǎn) 均 高于淺層 傷口 （ p照片 6，表 4） 。 層 傷口 再生愈合而深層 傷口 瘢痕愈合 淺層 傷口 于傷后 9d 再生 修復(fù) ，肉眼無(wú)法辨別與周圍皮膚的差異 ；深層 傷口于 傷后 27d 呈 現(xiàn) 瘢痕愈合。 3d 6d 9d 12d 27d 照片 3 兔耳皮膚創(chuàng)傷后 表達(dá)（免疫組化 ， 40）。 真皮成纖維細(xì)胞 陽(yáng)性表達(dá)。 in 40). n C in 3d 6d 9d 12d 27d 照片 4 兔耳皮膚創(chuàng)傷后 達(dá)（免疫組化 ， 40）。 陽(yáng)性表達(dá)位于真皮乳頭層 。 A in 40) A in 3d 6d 9d 12d 27d 照片 5 兔耳皮膚創(chuàng)傷后 達(dá)（原位雜交） 。