蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 胞對順鉑預(yù)處理的非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株 的 殺傷效應(yīng) 1 前 言 淋巴瘤（ 源于淋巴結(jié)和淋巴組織，其發(fā)生大多與免疫應(yīng)答過程中淋巴細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生的某種免疫細(xì)胞惡變有關(guān)，是免疫系統(tǒng)的惡性腫瘤。按組織病理學(xué)改變，淋巴瘤可分為霍奇金淋巴瘤（ 非霍奇金淋巴瘤 (大類。淋巴瘤是最早發(fā)現(xiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一 。 1832年 告了一種淋巴結(jié)腫大合并脾大的疾病， 33年后 （ 名此種疾病。 1898年發(fā)現(xiàn) 胞，明確了霍奇金淋巴瘤（ 病理組織學(xué)特點(diǎn)?，F(xiàn)在將此種疾病稱之為非霍奇金淋巴瘤 (在西方國家，淋巴瘤發(fā)病率占整個(gè)癌性腫瘤的第8位，在我國 占惡性腫瘤的第 9位 （ 男性 ） 和第 11位 （ 女性 ） 。淋巴瘤的發(fā)病率占惡性腫瘤發(fā)病率的 近二十年來 發(fā)病率每年以 比率上升。每年我國新發(fā)病例為 2萬左右。非霍奇金淋巴瘤 （ 有逐年增多的趨勢，日益危害著人類的健康。如何治療和提高治療效果成為臨床醫(yī)務(wù)工作者的研究關(guān)鍵。 1955年以來，美國和國際腫瘤的研究中心 在研究動 物體內(nèi)的腫瘤基因遺傳機(jī)制時(shí) ，先后發(fā)現(xiàn)近萬種化合物有抗腫瘤作用。這些化合物 多數(shù)在體內(nèi)不具有活性，但鉑化合物約 18%在體內(nèi)具有活性 。 1969年，美國 B. V. 表了 順鉑）具有廣泛的抗 腫瘤的作用，能抑制和完全治愈一系列動物體內(nèi)誘發(fā)的腫瘤，并應(yīng)用于臨床，使順鉑的研究工作深入發(fā)展?，F(xiàn)今，順鉑（ 治療非霍奇金淋巴瘤（ 二線 化療藥，但 多數(shù)情況下 需很高劑量，順鉑的藥理作用才能發(fā)揮，治療過程中會出現(xiàn)許多 毒副反應(yīng) ，例如 腎毒性、耳毒性、神經(jīng)毒性、骨髓抑制、過敏反應(yīng) 、 惡心、嘔吐、食欲減退 等 1 近年來，由于綜合治療的合理應(yīng)用，相當(dāng)部分的非霍奇金淋巴瘤可以治愈或緩解，但患者 經(jīng)長期化療，全身情況較差，并易 出現(xiàn)干細(xì)胞、外周血管受損 等 。研究者發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性。 1982年， 3報(bào)道 外周血單個(gè)核細(xì)胞（ 加入 重組人白介素 體外培養(yǎng) 4誘導(dǎo)出一種非特異性的殺傷細(xì)胞，稱為淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（ 以殺傷多種對 細(xì)胞毒性 T 淋 巴細(xì)胞 （ 自然殺傷細(xì)胞 (不敏感的腫瘤細(xì)胞。 1984年 研究組首次應(yīng)用 同治療 25例腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、肺癌、結(jié)腸癌等腫瘤患者。其中 1例黑色素瘤完全消退， 11例腫瘤縮小超過 50%。胞殺傷力不夠強(qiáng)，并且 擴(kuò)增能力有限，需要在輸注細(xì)胞的同時(shí)大劑量應(yīng)用 治療過程中可出現(xiàn)毒副反應(yīng)，最常見和最嚴(yán)重的毒副作用是出現(xiàn)毛細(xì)血蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 胞對順鉑預(yù)處理的非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株 的 殺傷效應(yīng) 2 管滲漏綜合征（ 主要表現(xiàn)為全身性水腫和多器官功能失調(diào)， 可引起胸腹腔積液、肺間質(zhì)水腫和充血性心力衰竭，但是對 胞的深入研究為隨后的工作打下了良好的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ) 5 1986年 究組 報(bào)道了腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（ 一般來說， 胞中 大多數(shù)細(xì)胞 表達(dá) 不同腫瘤來源的 胞中， 細(xì)胞與 細(xì)胞 比例有差異，大部分 以 細(xì)胞為主。經(jīng) 來自 胞比較，其特點(diǎn)是：（ 1）增殖50療過程中可 減 少效應(yīng)細(xì)胞和 且對 療無效的晚期腫瘤仍有一定的治療效果；（ 2）主要由 胞誘導(dǎo)而來， 動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) 傷腫瘤 具有特異性；（ 3）宿主的抑制狀態(tài)有利于 殺傷作用，治療時(shí)加用環(huán)磷酰胺可明顯提高療效，可能與免疫抑制藥能消除抑制性細(xì)胞或因子，增強(qiáng)過繼免疫治療作用有關(guān)，可減少 低毒副反應(yīng)；（ 4）可從手術(shù)切下腫瘤組織、腫瘤引流淋巴液 、癌性胸腹水中獲得淋巴細(xì)胞，經(jīng)加 生長、擴(kuò)增能力強(qiáng)于 胞。但是細(xì)胞獲取的問題限制了 臨床應(yīng)用。 1989年，一個(gè) 研究小組發(fā)現(xiàn) 并在體外實(shí)驗(yàn)中顯示出較 胞更高的殺傷力 8。 在此基礎(chǔ)上， 1991年，一類由多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞 （ 由斯坦福大學(xué)的 首先報(bào)道 9，是以 周血單個(gè)核細(xì)胞（ 得到的一種具有強(qiáng)大抗腫瘤活性的細(xì)胞群。與 胞相比較，其達(dá)到近似療效所需細(xì)胞數(shù)減少 110， 使用無需聯(lián)合 胞因可大量 地增殖、細(xì)胞毒活性強(qiáng)、 可殺傷自體和異體多種腫瘤細(xì)胞、骨髓純化能力強(qiáng)、回輸體內(nèi)后可繼續(xù)分裂增生且無需外源細(xì)胞因子維持作用、 副作用少 等優(yōu)點(diǎn)， 顯示了很好的發(fā)展前景，至此開啟了免疫治療的新時(shí)代。 胞 又被稱為 胞樣 T 淋巴細(xì)胞， 多數(shù)細(xì)胞帶有 T 細(xì)胞標(biāo)志，部分帶有 胞標(biāo)志 。其 于 胞同源， 前體細(xì)胞主要存在于外周血淋巴細(xì)胞中，均來自于大顆粒淋巴細(xì)胞。其特點(diǎn)為 ： 1、 胞增殖速度快，抗腫瘤活性細(xì)胞可大量增殖，且細(xì)胞活性也大大增強(qiáng)； 2、 胞具有識別腫瘤的機(jī)制，對正常的細(xì)胞無毒性作用； 3、 殺瘤譜廣， 可用于白血病、淋巴瘤、肺癌、胃癌、腸癌等多種腫瘤的治療，對多重耐藥腫瘤細(xì)胞同樣敏感 ； 4、 是典型的個(gè)性化生物治療模式。將這類細(xì)胞回輸后，還能使機(jī)體免疫能力提高，產(chǎn)生特異的抗病毒作用，從而對腫瘤治療施以雙重的作用 ； 5、 由于 胞是活化的自體細(xì)胞，用起來非常安全。 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 胞對順鉑預(yù)處理的非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株 的 殺傷效應(yīng) 3 要效應(yīng)細(xì)胞為 7,9。 胞在正常人外周血中極其罕見，僅占 1在體外經(jīng)多因子誘導(dǎo)培養(yǎng)，可迅速增多達(dá) 1000倍以上。實(shí)驗(yàn)證明，擴(kuò)增出的 胞 多數(shù) 來源于 T 細(xì)胞。研究 發(fā)現(xiàn) ，在 的 T 細(xì)胞中，除 細(xì)胞外，其余 3種 T 細(xì)胞亞群 ( 、 均可通過誘導(dǎo)獲得 后兩者在正常人外周血中含量極低。因此間接提示 胞主要來自外周血中 細(xì)胞。此外，因 細(xì)胞 表型轉(zhuǎn)化能力 高， 也是 胞的一個(gè)重要來源 10 胞分泌 源性的 增 胞 13。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 胞毒活性方面的影響沒有區(qū)別，應(yīng)用 胞兼具 胞及 T 淋巴細(xì)胞特性，既有 胞的非 制性，又有 T 淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的殺傷活性。對于多種腫瘤細(xì)胞 14新鮮腫瘤組織均表現(xiàn)出強(qiáng)大的殺傷活性。 胞對正常骨髓細(xì)胞毒性小，可以保存 75%以上的 落，對正常髓系克隆生成幾乎沒有影響，輕度抑制紅 系 生成 ， 對正常骨髓抑制可能與 胞產(chǎn)生 巴細(xì)胞毒素等有關(guān)。 大量體外實(shí)驗(yàn)證實(shí) 胞比 胞具備更強(qiáng)大的殺瘤活性， 并且不 依賴 究表明在體外 ， 等數(shù)量的 胞與 胞相比，殺傷腫瘤細(xì)胞能力相近。 但 胞在培養(yǎng) 增殖數(shù)量多， 應(yīng)細(xì)胞增長快 ，換算成總殺瘤單位（ 算， 胞的總殺傷單位為 胞的 73倍甚至更高。腫瘤克隆抑制實(shí)驗(yàn)顯示， 胞的瘤細(xì)胞抑制 數(shù)為 個(gè) 。體內(nèi) 實(shí)驗(yàn)中， 重癥聯(lián)合免疫缺陷鼠 /人淋巴瘤模型研究表明， 胞在清除腫瘤病灶、抑制轉(zhuǎn)移、 延長生存方面明顯優(yōu)于胞。 9用阿霉素和長春新堿誘導(dǎo)出多重耐藥細(xì)胞系 ， 研究發(fā)現(xiàn)，胞對于多重耐藥腫瘤亦敏 感， 殺傷效應(yīng)無顯著差異。 繼外科手術(shù)、放射療法和化學(xué)藥物療法之后 ， 免疫療法確立為 腫瘤的 第四種療法。細(xì) 胞過繼性免疫治療 (過給患者提供現(xiàn)成的免疫力達(dá)到殺傷和抑制癌細(xì)胞、清除手術(shù)、化療、放療后的微小殘留病灶， 提高患者的生存質(zhì)量。 近 年來， 量應(yīng)用于臨床。17應(yīng)用自體 3例肝癌患者，其免疫功能、生活質(zhì)量均提高 。 18發(fā)現(xiàn) 85名接受過微創(chuàng)治療的肝癌患者輸注 提高患者免疫力，減少復(fù)發(fā)。 19用 50例肝癌患者進(jìn)行治療后，發(fā)現(xiàn) 8%，說明這一治療方案可延長患者術(shù)后生存時(shí)間。 20將 記的 細(xì)胞型淋巴瘤的臨床前研究，觀察到較強(qiáng)的蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 胞對順鉑預(yù)處理的非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株 的 殺傷效應(yīng) 4 抗腫瘤毒性。 是否有辦法增強(qiáng) 化 療與免疫治療在抗腫瘤過程中，是否可以相輔相成 呢？ 21將 時(shí)指出 22在采用 僅生存率要高于單純化療組，毒副作用也要小于化療組 。袁香慶等 23用 0例轉(zhuǎn)移性腎癌，療效優(yōu)于單純化療或 本玲等 24采用示患者免疫功能狀態(tài)較治療前明顯改善。另有 562殺傷及其逆轉(zhuǎn) 甘露聚糖肽增強(qiáng) 研究發(fā)現(xiàn)化療藥物具有免疫調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)腫瘤宿主的免疫內(nèi)環(huán)境，調(diào)變腫瘤細(xì)胞的免疫原性，重建機(jī)體免疫格局，增強(qiáng)后續(xù)聯(lián)合的免疫治療的療效 25 在免疫治療前給予的化療方案被稱為預(yù)處理化療 (預(yù)處理化療的目的不是以細(xì)胞毒作用直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而是利用其免疫調(diào)節(jié)特性清除腫瘤宿主的免疫抑制性因素。 多項(xiàng)動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)，預(yù)處理化療與 細(xì)胞免疫 的 聯(lián)合可產(chǎn)生強(qiáng)大的抗腫瘤作用 27 本文研究目的主要是通過細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法研究 非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞 株 經(jīng)順鉑預(yù)處理后，是否可以增強(qiáng) 其殺傷作用 ，為臨床應(yīng)用化療聯(lián)合 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 胞對順鉑預(yù)處理的非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株 的 殺傷效應(yīng) 5 材料和方法 料與試劑 料 自 齊魯制藥（海南）有限公司（批號 重組人白介素 山東泉港藥業(yè)有限公司（批號 201207003） 干擾素（ 上海凱茂生物有限公司（批號 20121110） 抗 克隆抗體 司（批號 34554) 號 1255942） 碘化丙啶（ 碧云天生 物技術(shù)研究所（編號 司（批號 1161726） 胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司（批號 121122） 淋巴細(xì)胞分離液 司（批號 器 流式細(xì)胞儀 美國 品 養(yǎng)箱 超凈工作臺 司 倒置顯微鏡及照相系統(tǒng) 恒溫恒濕箱 熱恒濕振蕩水槽 速離心機(jī)為 溫冰箱 顯振蕩器為 料培養(yǎng)瓶 司 75料培養(yǎng)瓶 司 自動臺式滅菌器 山東新華醫(yī)療器械有限公司 電子天平 司 微量加樣器 上海求精生物試劑有限公司 96 孔培養(yǎng)板 司 流式上樣管 美國 司 血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 德國拜爾公司 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 胞對順鉑預(yù)處理的非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株 的 殺傷效應(yīng) 6 濾器、微孔濾膜， 110心管， 10521度吸管，尖吸管，存管、 。 液配制 磷酸鹽緩沖液（ 電 子天平稱取磷酸二氫鉀 酸二氫鈉 化鈉 8g，氯化鉀 將稱好的各種鹽類放入燒杯中，加去離子水 800拌溶解，玻璃棒引流至容量瓶中，用 紙條測 ，加濃鹽酸調(diào)制 容到 1L； 組裝滅菌的不銹鋼過濾器，將配制好的溶液過濾，分裝于 4 個(gè) 250水瓶中，高溫高壓滅菌后 4保存。 胎牛血清： 放入 56水浴鍋中，加熱 30活血清中的補(bǔ)體等成分，室溫冷卻后分裝至小玻璃瓶中， 存。 雙抗溶液： 青霉 素和鏈霉素在無菌操作臺內(nèi)以無菌生理鹽水溶解 ， 青霉素 80 萬 U/瓶，用注射器加 4餾水。鏈霉素 100 萬 U/瓶，用注射器加 5餾水，每 0 萬單位。分別取 4霉素及鏈霉素配成混合液，將 8合液稀釋 10倍，用時(shí)向培養(yǎng)液中加入 1%的雙抗。 養(yǎng)液： 取 100水瓶，加入 10牛血清、青鏈霉素各 100u/成 10%的完全培養(yǎng)基， 4冷藏備用。 法 察指標(biāo) （ 1）細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：在倒置顯微鏡下觀察各細(xì)胞的生長情況、數(shù)量及形態(tài) ； （ 2）流式細(xì)胞儀檢測： 不同培養(yǎng)時(shí)間 胞 疫表達(dá)及表型變化 ； （ 3） I 雙標(biāo)法測不同濃度、不同時(shí)間預(yù)處理后，效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞殺傷活性。 驗(yàn)細(xì)胞 人類 胞株 巴瘤細(xì)胞株 ） 、 彌漫大 均購自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院白血病研究室。實(shí)驗(yàn)細(xì)蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 胞對順鉑預(yù)處理的非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株 的 殺傷效應(yīng) 7 胞株于含 10胎牛血清的 養(yǎng)液中，在 37、 5%和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 3 天傳代一次，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 胞體外培養(yǎng) （ 1）在短中管中加入適量淋巴細(xì)胞分離液，抽取健康人外周血 50 素抗凝處理，與等量 養(yǎng)液充分混勻。用滴管緩慢加入于分層液面上，水平離心 200020 分鐘。用毛細(xì)管吸取單個(gè)核細(xì)胞，置于另一干凈短中管中。加入 5 倍以上體積的 養(yǎng)液， 150010 分鐘， 滌 2 次。棄上清液，加入含 10%胎牛血清的 養(yǎng)液，重懸細(xì)胞。把細(xì)胞濃度調(diào)整為 1106/行后續(xù)培養(yǎng)，第一日加入 干擾素（ 1000 u/于 37 ，5%和濕度條件下培養(yǎng) 24 小時(shí)，然后分別加入重組人白介素 00 u/組人白介素 500 u/ 克隆抗體 50 ng/37、 5% 和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。以后每 3 天半量更換新鮮培養(yǎng)液，并補(bǔ)加重組人白介素 00 u/胞密度調(diào)整至 1106/養(yǎng)期間用流式細(xì)胞儀監(jiān)測細(xì)胞免疫表型變化。 （ 2）動態(tài)觀察 胞擴(kuò)增，換液時(shí)取少量細(xì)胞懸液使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并制作增殖曲線。 用酒精擦拭血細(xì)胞計(jì)數(shù)板及蓋片，并將蓋片蓋在計(jì) 數(shù)板上； 吸出少量細(xì)胞懸液，滴在蓋片上下邊緣，使懸液充滿蓋片； 靜置 3 分鐘，使懸液擴(kuò)散均勻； 顯微鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞計(jì)左不計(jì)右，計(jì)上不計(jì)下。按下式計(jì)算：細(xì)胞數(shù) /毫升 =4 個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù) /4 104稀釋倍數(shù) （ 3） 胞免疫表型監(jiān)測 收集 胞，用 滌 1 次，將細(xì)胞移入 U 型 96 孔板中，每孔細(xì)胞不少于 5105 個(gè)，加入熒光抗體 20l 輕輕混勻， 4避光孵育 30滌 2 次，每孔加入 100l 1%多聚甲醛固定，上流式機(jī)檢測。檢測 單抗包括： 種 處理濃度對 傷效果影響 預(yù)實(shí)驗(yàn)表明， 胞 株 的 100g/ 胞 株 的 145g/取靶細(xì)胞生長 70%左右融合時(shí)做為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。分別向胞 株 、 胞 株 中加入濃度為 0ng/25 ng/50 ng/5 ng/ 別接種于 96 孔板中，放入 37 、 5%和濕度條件下培養(yǎng) 18 小時(shí)，取出靶細(xì)胞，加入離 心管中離心，結(jié)束后 洗滌 2 次，并記錄靶細(xì)胞數(shù)目。預(yù)溫 ，然后加入細(xì)胞團(tuán)中。 濃度控制為蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 胞對順鉑預(yù)處理的非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株 的 殺傷效應(yīng) 8 ，吹打懸浮細(xì)胞并調(diào)整濃度。在 37溫度下放置 5 分鐘，加入含 10%胎牛血清 養(yǎng)液，然后離心。離心后細(xì)胞加入含 10%胎牛血清養(yǎng)液 10放置 30 分鐘。 洗滌 2 次，細(xì)胞濃度調(diào)整為 5 105/胞， 胞與淋巴瘤細(xì)胞 株 的效靶比為 20:1，在 37、 5% 和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 小時(shí)。 200 目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞 ，上機(jī)檢測前加入 濃度為 。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 4 次。 種 處理時(shí)間對 傷效果影響 分別向 胞 株 、 胞 株 中加入濃度為 25ng/ 接種于 96 孔板中，在 37、 5% 和濕度培養(yǎng)箱中再分別培養(yǎng) 18 小時(shí)、24 小時(shí)、 36 小時(shí)。在 18 小時(shí)、 24 小時(shí)、 36 小時(shí)時(shí)，取出靶細(xì)胞。加入離心管中離心，結(jié)束后 洗滌 2 次，并記錄靶細(xì)胞數(shù)目。預(yù)溫 ，然后加入細(xì)胞團(tuán)中。 濃度控制為 ，吹打懸浮細(xì)胞并調(diào)整濃 度。在 37溫度下放置 5 分鐘，加入含 10%胎牛血清 養(yǎng)液，然后離心。離心后細(xì)胞加入含 10%胎牛血清 養(yǎng)液 10放置 30 分鐘。 次，細(xì)胞濃度調(diào)整為 5105/胞， 胞與淋巴瘤細(xì)胞 株 的效靶比為 20:1，在 37 、 5% 和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 小時(shí)。 200 目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞，上機(jī)檢測前加入 濃度為 。實(shí)驗(yàn)重 4 次。 計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù) 數(shù)據(jù)處理應(yīng)用 計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)均以 s 表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)， P 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 胞對順鉑預(yù)處理的非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株 的 殺傷效應(yīng) 9 結(jié)果 胞的培養(yǎng) 及表型 細(xì)胞換液時(shí)進(jìn)行無菌檢測（細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等），光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并取少量 光放置 25分鐘后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示 1天左右時(shí)， 細(xì)胞比例 為 細(xì)胞比例為 細(xì)胞比例為 細(xì)胞活性可保持 95%以上，可持續(xù)至 25天左右，但 21天后，以上效應(yīng)細(xì)胞比例未見明顯升高，所以本實(shí)驗(yàn)選擇培養(yǎng) 21天時(shí)的 圖1。 圖 1 態(tài)學(xué)觀察 天時(shí)，體積未見明顯變化，數(shù)量稍減少。第 7天時(shí)，細(xì)胞快速增值，團(tuán)落增多，可見分裂相。細(xì)胞呈蝌蚪樣不規(guī)則形。頭端胞核豐富，胞質(zhì)量少。第 16天時(shí)增殖，擴(kuò)增成巨大 的增生集落，達(dá)到高峰，并持續(xù)在較高狀態(tài)下。第 16胞數(shù)目可擴(kuò)增至分離時(shí)的 120見圖 2） 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 胞對順鉑預(yù)處理的非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株 的 殺傷效應(yīng) 10 圖 2 誘導(dǎo)第 21天時(shí) 光鏡下 400） 種 處理 濃度 對 傷效果影響 細(xì)胞生長達(dá) 70%融合時(shí)，分別向 、 中加入濃度為 0ng/25ng/50ng/75ng/8小時(shí)， 死亡率為 （ %、（ %、（ %、（ %。 ， 死亡率為 （ %、 （ %、（ %、（ %。加入 淋巴瘤細(xì)胞 株 的效靶比為 20:1）， 的殺傷率為 (、 (、（ %、（ %，殺傷 的殺傷率為 (、 (、（ %、（ %。結(jié) 果顯示，隨 入 間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P 表 1、 2）。 此外，5ng/種淋巴瘤細(xì)胞 株 死亡率均低于 5%，未見明顯殺傷效果，所以選擇此濃度進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。 表 1 不同濃度 處理后 胞株的殺傷活性 n=4， P 處理濃度（ ng/ 對照組 (%) （ %） 0 5 0 5 州大學(xué)碩士學(xué)位論文 胞對順鉑預(yù)處理的非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株 的 殺傷效應(yīng) 11 表 2 不同濃度 處理后 胞株的殺傷活性 n=4， P 處理濃度（ ng/ 對照組 (%) （ %） 0 5 0 5 種 處理 時(shí)間 對 傷效果影響 在兩種淋巴瘤細(xì)胞 株 中分別加入 25 ng/續(xù)培養(yǎng) 18小時(shí)、 24小時(shí)、36小時(shí)， 殺傷率分別為 (、 (、( ， 胞 株 的殺傷率分別為 ( 、(、 (。加入 淋巴瘤細(xì)胞 株 的效靶比為 20:1），在不同時(shí)間點(diǎn)， 的殺傷效應(yīng)為 (、(、 (，對 的殺傷效應(yīng)為 (、(、 (。結(jié)果顯示，隨 細(xì)胞死亡率增加。 后，再聯(lián)合 著時(shí)間的延長，靶細(xì)胞的死亡率亦增加。聯(lián)合 間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P （ 表 3、 4） 表 3 不同 處理 時(shí)間 胞株的殺傷活性 n=4， P 處理時(shí)間（ h） 對照組 (%) （ %） 18 4 6 4 不同 處理 時(shí)間 胞株的殺傷活性 n=4， P 處理時(shí)間（ h） 對照組 (%) （ %） 18 4 6 州大學(xué)碩士學(xué)位論文 胞對順鉑預(yù)處理的非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株 的 殺傷效應(yīng) 12 討論 淋巴瘤 現(xiàn)今成為增長速度 最快的惡性腫瘤，有關(guān)其病因、發(fā)病機(jī)制、免疫學(xué)研究、分類研究等有了很大的進(jìn)展。 由于綜合治療手段的不斷完善 和新藥的增多 ，臨床上獲得緩解的 但 仍有相當(dāng)部分的 治療后反復(fù)復(fù)發(fā)、惡化，長期生存不理想。 甚至 有的患者因?yàn)榇髣┝康姆呕煂?dǎo)致免疫衰竭。 癌癥的免疫療法是建立在分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上。 后輸注至腫瘤患者體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用 33。 研究表明 細(xì)胞及 有可大量增殖、對多種腫瘤細(xì)胞殺傷活性強(qiáng)大、非 自身組織無細(xì)胞毒作用等優(yōu)點(diǎn)，并可促進(jìn)患者重建免疫系統(tǒng)、清除微小殘留病變及凈化骨髓 34。 其 為多種細(xì)胞混合體，經(jīng)多因子體外誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，主要效應(yīng)細(xì)胞迅速增多，具有更強(qiáng)細(xì)胞毒活性。其殺傷機(jī)制為， 釋放以 陽性細(xì)胞 為最大顆粒釋放量的具有細(xì)胞毒性的胞質(zhì)顆粒物，作為外源性局部定向的細(xì)胞溶解毒素，通過細(xì)胞膜滲透，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。 既可直接抑制腫瘤細(xì)胞 , 又可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)反應(yīng)，間接殺傷腫瘤細(xì)胞。許多腫瘤細(xì)胞表達(dá) 導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞凋亡，使免疫治療成功性減低。體外培養(yǎng)過程中， 以通過對 期慢性殺傷腫瘤細(xì)胞，也對 致的凋亡有對抗作用 35。 悶、惡心少見，發(fā)熱大多可自行緩解。大多研究者認(rèn)為發(fā)熱是機(jī)體免疫功能正常反應(yīng)的結(jié)果，對治療有益，其他嚴(yán)重副反應(yīng)尚未出現(xiàn)。 些細(xì)胞因子對腫瘤細(xì)胞有直 接抑制作用，還可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)間接殺傷腫瘤細(xì)胞。將其應(yīng)用于 延長生存期，改善預(yù)后。與手術(shù)、放療、化療相比，生物治療副作用小。 6等研究顯示，定程度上，可克服靶向生物治療中存在的遞呈及定向等難題。 生物治療對自 身造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和器官無明顯毒副作用。但化療藥物存在細(xì)胞毒性，對機(jī)體傷害很大，殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對自身造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和器官影響很大?；熀蜕镏委熉?lián)合往往可以起到相加或協(xié)同治療的作用，提高緩解率， 減輕毒副反應(yīng)。 根據(jù)腫瘤的病理類型、臨床分期、發(fā)生部位和發(fā)展趨勢，結(jié)合患者的全身情況和分子生物學(xué)行為，有計(jì)劃地聯(lián)合應(yīng)用化療藥物和生蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 胞對順鉑預(yù)處理的非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株 的 殺傷效應(yīng) 13 物制劑進(jìn)行治療， 可 最大限度改善患者生存質(zhì)量。 機(jī)體的免疫抑制性因素可以分為系統(tǒng)性抑制因素和腫瘤性抑制因素兩類 37。在系統(tǒng)性抑制中，調(diào)節(jié)性 髓系來源抑制細(xì)胞(揮主要作用 38它們可以阻礙效應(yīng)細(xì)胞的靶灶浸潤，抑制 效應(yīng) 細(xì)胞的體 內(nèi)殺傷，這兩個(gè)作用均是通過構(gòu)建機(jī)體免疫抑制性內(nèi)環(huán)境實(shí)現(xiàn)的 40。腫瘤本身也可抑制免疫應(yīng)答的發(fā)生，通過降低免疫原性逃避殺傷。化療 能在 而言之為“增敏作用”，從而 改善腫瘤患者的預(yù)后 。 早在 1969年，順鉑就被發(fā)現(xiàn)具有治療腫瘤的作用，后來經(jīng)過長期調(diào)查實(shí)驗(yàn)、臨床研究，順鉑被廣泛應(yīng)用于臨床 41但大多高劑量，順鉑的藥理作用才能發(fā)揮，治療過程中會出現(xiàn)許多不良反應(yīng)，隨著順鉑的大量、長期使用，化療耐藥性成為治療腫瘤失敗最難攻克的問題及最常見的原因之一，困擾臨床 醫(yī)生及國內(nèi)外研究者 。 近年來，免疫治療 聯(lián)合化療治療 肺癌、乳腺癌、胃癌、惡性黑色素瘤等的治療效果顯著， 本實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)順鉑預(yù)處理后對 驗(yàn)選取 人類 （ 、 ） ，經(jīng)不同 現(xiàn) 間延長均增強(qiáng)。 25 ng/8小時(shí)，靶細(xì)胞死亡率低，對靶細(xì)胞的殺傷效果欠佳，但聯(lián)合 增效作用可能依賴于機(jī)體 文獻(xiàn)報(bào)道，內(nèi)源性 腫瘤抑制性及促進(jìn)性亞群。腫瘤抑制性 促進(jìn)發(fā)生免疫調(diào)節(jié)性腫瘤抑制作用，并可增強(qiáng) 淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞， 瘤微環(huán)境中的比例下降，促進(jìn)免疫應(yīng)答發(fā)生，抑制腫瘤生長 43。 本實(shí)驗(yàn)采用與 放實(shí)驗(yàn)相關(guān)性好的 I 雙標(biāo)法進(jìn)行檢測，一種可對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑， 入細(xì)胞后可以不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞 蛋白質(zhì)上。在細(xì)胞分裂增殖過程中， 記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中 ,因此其熒光強(qiáng)度是親代細(xì)胞的一半，用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡在 490 發(fā)光處可對其進(jìn)行分析。熒光探針 胞質(zhì)和細(xì)胞核，在細(xì)胞核的熒光染色最強(qiáng)，并證實(shí) 光染料 一種很有價(jià)值的細(xì)胞標(biāo)記示蹤劑，不僅用于細(xì)胞增殖的體外實(shí)驗(yàn) ,也可用于追蹤細(xì)胞在體內(nèi)的分裂增殖過程。細(xì)胞核熒光染料 稱 一種常用的細(xì)胞核熒光染色劑。它不能透過完整的細(xì)胞膜，但 中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞的膜蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 胞對順鉑預(yù)處理的非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株 的 殺傷效應(yīng) 14 而將細(xì)胞核染紅。 51細(xì)胞的自發(fā)死亡與特異性殺傷會造成很強(qiáng)的背景信號，對評價(jià)低水平反應(yīng)有影響。 1法可用于較低反應(yīng)水平的分析，準(zhǔn)確、易操作、重復(fù)性好。 綜上所述，與單用 順鉑或 更具殺傷作用，可大幅提高腫瘤細(xì)胞的殺傷率。本實(shí)驗(yàn)可進(jìn)行進(jìn)一步研究，更好地為化療聯(lián)合免疫治療的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 胞對順鉑預(yù)處理的非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株 的 殺傷效應(yīng) 15 結(jié)論 細(xì)胞死亡率增加，隨