密級(jí) : 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 擬南芥 入 突變體 的 蛋白質(zhì)譜分析 h. D. i 摘 要 轉(zhuǎn)基因植物中非預(yù)期效應(yīng)的產(chǎn)生有著復(fù)雜 的 遺傳和環(huán)境因素，現(xiàn)有的檢測(cè)方法主要依靠對(duì) 已知的營(yíng)養(yǎng)因子、抗?fàn)I養(yǎng)因子和毒素等成分進(jìn)行廣泛的化學(xué)分析， 但這些方法還存在著嚴(yán)重的不足，特別是在 可能出現(xiàn)未知的毒素或抗?fàn)I養(yǎng)因子，以及缺少有效的檢測(cè)方法的情況下，這種方法具有很多局限性。 為了研究非預(yù)期效應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)理和 增加檢測(cè)出非預(yù)期效應(yīng)的可能性，需要采用各種不同的 、 更加有效的 策略 。為此，本文以蛋白質(zhì)組學(xué)方法來(lái)研究 擬南芥 入突變體中蛋白 質(zhì)表達(dá)譜的變化，為蛋白質(zhì)組學(xué)方法在非預(yù)期效應(yīng)研究中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ) 。 以模式植物擬南芥為材料，對(duì)采用 入方法獲得的擬南芥突變體進(jìn)行 增出 側(cè)翼序列 并測(cè)序 ，經(jīng)過(guò)與擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確定 插入位點(diǎn)。 選擇 入位點(diǎn)分別位于基因間、內(nèi)含子區(qū)、外顯子區(qū)、基因上游和基因下游 5 種不同 入位點(diǎn)類(lèi)型的 12 個(gè) 擬南芥突變體，在開(kāi)花結(jié)束、衰老之前提取全蛋白進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。 對(duì)擬南芥突變體的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析基于雙向電泳，為獲得其蛋白質(zhì)組表達(dá)譜的全貌 ，采用了 17cm 制干膠條進(jìn)行第一向等電聚焦，隨后進(jìn)行 考馬斯亮蘭 色的雙向電泳凝膠可以穩(wěn)定地檢測(cè)到 400蛋白質(zhì)點(diǎn)。 在雙向電泳專(zhuān)業(yè)分析軟件 輔助下，對(duì)擬南芥突變體的蛋白質(zhì)組表達(dá)譜進(jìn)行分析。分析結(jié)果顯示，在擬南芥?zhèn)€體的蛋白質(zhì)表達(dá)譜之間存在著較大的個(gè)體差異，說(shuō)明在確定轉(zhuǎn)基因植物自然變異的基線(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)方面還需要做很 多 工作，這是進(jìn)行各種分析的基礎(chǔ)。在 12 個(gè)突變體中，共有 102 個(gè)表達(dá)量發(fā)生顯著變化的蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)胰蛋白酶 膠內(nèi)酶解后進(jìn)行 析，其中， 59 個(gè)點(diǎn)表達(dá)量上調(diào)， 43 個(gè)點(diǎn)表達(dá)量下調(diào)。共有 66 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到了鑒定，它們分別屬于 初級(jí)代謝， 能量傳遞， 細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂， 轉(zhuǎn)錄調(diào)控，蛋白質(zhì)合成與降解， 貯藏蛋白， 結(jié)構(gòu)蛋白， 信號(hào)傳遞， 植物防御， 次生代謝， 功能未確定， 說(shuō)明外源基因的插入和表達(dá)對(duì)植物的生命活動(dòng)有著廣泛的影響。 但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新蛋白，未發(fā)現(xiàn)植物生理、生化和代謝過(guò)程中發(fā)揮重要功能的蛋白質(zhì)或致 敏和毒素蛋白質(zhì)。 部分蛋白質(zhì)點(diǎn)在擬南芥突變體中以較高的頻率出現(xiàn)，如 1 號(hào)蛋白質(zhì)點(diǎn)，在分屬 5 種 種突變體中出現(xiàn)，可能預(yù)示著轉(zhuǎn)基因植物中某種共有的變化機(jī)制及其在非預(yù)期效應(yīng)檢測(cè)中作為標(biāo)志性分子的可能性。 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是轉(zhuǎn)基因植物中非預(yù)期效應(yīng)的很有前景的一種研究方法，但在技術(shù)平臺(tái)的優(yōu)化、 保證 特異性、靈敏度和 其結(jié)果 有效性 方面還需要進(jìn)一步加強(qiáng)研究 。此外，蛋白質(zhì)組學(xué)方法的成功應(yīng)用需要建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，其中應(yīng)包含對(duì)應(yīng)于 轉(zhuǎn)基因植物 不同開(kāi)發(fā)階段和環(huán)境條件下的 自然 變異信息 。 關(guān)鍵詞 ：轉(zhuǎn)基因，擬南芥 ， 生物 安全 ， 非預(yù)期效應(yīng) ， 蛋白質(zhì)組學(xué) of of 003 7700000 no to of of is of or as a of of on of s). of in of as a of is of of be by an of of an of of of in in no of to in as a of of M NA we of to of be of In to to of in by a of to A 2 in in of a of a in 3 of of 70 of of in We a pH in an of to in to on a 2002of 7.2 of in of to of Its On of (i) in in (in in A 02 by 66 by to no of or o.1 of be as At of is of is of of to M to be on in in 錄 摘 要 . i . 一章 引 言 . 1 1 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展及生物安全 . 1 2 轉(zhuǎn)基因植物 可能產(chǎn)生 的非預(yù)期效應(yīng) . 3 3 植物蛋白質(zhì)學(xué)研究進(jìn)展及其在生物安全研究中的應(yīng)用 . 9 4 本研究的立題依據(jù)和研究意義 . 15 第二章 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化 . 16 1 材料與方法 . 16 生型擬南芥的種植 . 16 化載體 . 17 器浸蘸法轉(zhuǎn)化 . 17 南芥 基因組 提取 ( ) . 18 南芥突變株的 定 . 18 2 結(jié)果 . 19 南芥突變體基因組 提 取 . 19 南芥突變體的 定結(jié)果 . 19 第三章 入位點(diǎn)側(cè)翼序列的測(cè)定 . 20 1 材料與方法 . 20 劑和儀器 . 20 南芥突變株的 . 20 條帶的擴(kuò)增及回收 . 22 入位點(diǎn)的確定 . 23 2 結(jié)果 . 23 南芥突變體 定結(jié)果 . 23 試驗(yàn)中選擇的突變體的 翼序列測(cè)定結(jié)果 . 23 試驗(yàn)選擇的突變體的 入位點(diǎn) . 26 第四章 擬南芥突變體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析 . 27 1 材料與方法 . 27 料 . 27 育植株 . 27 織蛋白的提取 . 27 白含量測(cè)定 . 28 電聚焦電泳 . 28 條的平衡 . 28 . 28 膠掃描和圖像分析 . 29 內(nèi)蛋白質(zhì)酶解 . 29 S . 29 白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 . 29 2 結(jié)果 . 30 白質(zhì)含量測(cè)定 . 30 南芥蛋白質(zhì)雙向電泳 . 30 v 南芥突變體蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的軟件分析 . 31 南芥突變體差異表達(dá)蛋白質(zhì) 定 . 32 南芥突變體蛋白質(zhì)組雙向電泳及差異蛋白鑒定結(jié)果 . 34 3 討論 . 48 法對(duì)擬南芥蛋白質(zhì)組的分離 . 48 S 鑒定蛋白質(zhì) . 48 達(dá)差異蛋白質(zhì)的區(qū)分標(biāo)準(zhǔn) . 48 鑒定的蛋白質(zhì)的功能分類(lèi) . 49 些蛋白質(zhì) 出現(xiàn)在多個(gè)插入位點(diǎn)類(lèi)的突變體中 . 49 白質(zhì)組學(xué)研究可為非預(yù)期效應(yīng)研究提供有益線(xiàn)索 . 50 白質(zhì)組學(xué)在轉(zhuǎn)基因植物非預(yù)期效應(yīng)研究中的應(yīng)用需要標(biāo)準(zhǔn)化 . 50 第五章 結(jié)論 . 51 參考文獻(xiàn) . 52 致 謝 . 63中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引 言 1 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展及生物安全 近三十年來(lái)，生物技術(shù)的發(fā)展在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域取得了重大的成果， 并逐漸發(fā)展成為強(qiáng)大的現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)， 給人類(lèi)社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展帶來(lái)了深遠(yuǎn)的影響。生物技術(shù)的應(yīng)用可以減少生產(chǎn)成本，提高作物產(chǎn)量，降低病蟲(chóng)害 防治 的農(nóng)藥使用量，減少對(duì)環(huán)境的破壞，開(kāi)發(fā)更富營(yíng)養(yǎng)、更安全的新食品，是滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的人口對(duì)更高品質(zhì)的食品需求的重要方法之一。 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前至少已在 100多 種植物中成功獲得了轉(zhuǎn)基因植物，包括水稻、玉米、 馬鈴薯等糧食作物，棉花、大豆、油菜、亞麻、向日葵等經(jīng)濟(jì)作物，以及番茄、黃瓜、薺菜、甘藍(lán)、花椰菜、胡蘿卜、茄子、生菜、芹菜、苜蓿、白三葉草、蘋(píng)果、核桃、李、木瓜、甜瓜、草莓、矮牽牛、菊花、香石竹和楊樹(shù)等；所涉及到的性狀從最初的抗蟲(chóng)、抗病毒、抗細(xì)菌、抗真菌、抗除草劑、抗旱、抗鹽漬等，到現(xiàn)在的品質(zhì)改良、生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控和提高產(chǎn)量等。 迄今為止，世界各國(guó)已試種的轉(zhuǎn)基因植物超過(guò) 4500種，已批準(zhǔn)商業(yè)化種植 的 近 90種。 自 1996年轉(zhuǎn)基因植物開(kāi)始商品化以來(lái)， 經(jīng)過(guò) 7年的持續(xù)增長(zhǎng)， 2003年全球轉(zhuǎn)基因植物的種植面積已達(dá) 6770萬(wàn) 公頃 (2003)，全球市場(chǎng)價(jià)值 45 6年來(lái)，全世界共有 幾 億人在食用轉(zhuǎn)基因食品，美國(guó)市場(chǎng)上已有近 4000種食品來(lái)自基因工程生物。經(jīng)過(guò) 5年嚴(yán)格的論證，對(duì)轉(zhuǎn)基因植物持相對(duì)保守態(tài)度的英國(guó)最早將于 2005年春季開(kāi)始商品化種植轉(zhuǎn)基因玉米 (2003)。 但另一方面， 隨著基因工程 產(chǎn)品 日漸商品化 ， 有關(guān)重組 術(shù)潛在危險(xiǎn)性的爭(zhēng)論發(fā)自歐盟繼而波及全世界。生物安全是指現(xiàn)代生物技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用可能產(chǎn)生的負(fù)面影響， 及 所采取的有效預(yù)防和控制措施，目的是保護(hù)生物多樣性、生態(tài)環(huán)境和 人體健康。 其研究的主要內(nèi)容包括轉(zhuǎn)基因生物的環(huán)境安全和食品安全。 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品可能對(duì)人體健康產(chǎn)生的潛在影響主要有以下 幾 個(gè)方面 ， 外源基因是否會(huì)通過(guò)異源重組進(jìn)入人的遺傳體系中 。目前 普遍 認(rèn)為這種可能 只 是在理論上具有極小的概率 (2004; 2004)。 由 于重組和水平基因轉(zhuǎn)移 產(chǎn)生具有“超級(jí)抗性”的病原微生物會(huì)危害人類(lèi)健康。 這 種 情況 在使用抗生素標(biāo)記基因時(shí)有很小的可能 性 (2004)， 但 隨著標(biāo) 記刪除技術(shù)及更安全的標(biāo)記基因的使用，這 個(gè)問(wèn)題可以被徹底解決 (2004; 2004; 2004)。 轉(zhuǎn)基因食品是否具有毒性 、 能否引起人體的過(guò)敏 反應(yīng) 、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值是否與傳統(tǒng)對(duì)應(yīng)食品有差異 及轉(zhuǎn)基因食品中出現(xiàn)非預(yù)期效應(yīng)的可能性 (2003)。關(guān)于毒性問(wèn)題只有一些相關(guān)的動(dòng)物試驗(yàn)報(bào)道，尚無(wú)關(guān)于人體的研究報(bào)告 (2004)。轉(zhuǎn)基因食品引起人體過(guò)敏性反應(yīng)的發(fā)生概率相對(duì)可能高一些， 在 大豆中表達(dá)巴西堅(jiān)果 ( 2S 白蛋白 (et 1996)和美國(guó) 米 事件 (2000)均與過(guò)敏原有關(guān)， 但 在造成明顯的危害之前即被終止。目前 過(guò)敏源檢測(cè)和安全管理更加完 善 和嚴(yán)格，如僅就技術(shù)上講是安全的 (2002; 2001; 2002)。 化學(xué)分析和動(dòng)物試驗(yàn)證明在營(yíng)養(yǎng)成分上，轉(zhuǎn)基因植物與常規(guī)品種沒(méi)有差異（ 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 2 2002; 2001）。 對(duì)于非預(yù)期效應(yīng)則爭(zhēng)論較大，且在研究手段上有一定的難 度 。 轉(zhuǎn)基因 技術(shù) 的商品化 目前主要 是 在 轉(zhuǎn)基因植 物上 ，主要問(wèn)題有： 出現(xiàn)具有多種抗性基因的超級(jí)雜草，這類(lèi)問(wèn)題發(fā)生的可能性相對(duì)大一些，并已經(jīng)有了一些相關(guān)報(bào)道 (2003; 1999)。 出現(xiàn)具有高度抗藥性的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng) ，這 是一個(gè)關(guān)系到經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和公眾健康的 重 大問(wèn)題，關(guān)于此類(lèi)問(wèn)題的報(bào)道具有一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)， 例如，試驗(yàn)室研究表明， 棉鈴蟲(chóng) 對(duì) 生 抗性的時(shí)間是 12 代 （ 2004） ，但田間尚未產(chǎn)生明顯的抗性。 而且 需要說(shuō)明的是：具有 抗性的害蟲(chóng)出現(xiàn)不僅僅是由于抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因作物的種植，農(nóng)藥的使用也同樣會(huì)使害蟲(chóng)的抗藥性增強(qiáng)。 病毒重組或異源包裝會(huì)產(chǎn)生新的農(nóng)作物病原物。此類(lèi)現(xiàn)象在自然界可以發(fā)生，在實(shí)驗(yàn)室中也曾獲得驗(yàn)證，但在田間試驗(yàn)中尚無(wú)報(bào)道。 有些風(fēng)險(xiǎn)如異源包裝很容易通過(guò)改進(jìn)轉(zhuǎn)化策略而消除，但有些問(wèn)題還需要 進(jìn)行深入研究和長(zhǎng)期跟蹤調(diào)查 (2002; 2000)。 基因漂流導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因向非轉(zhuǎn)基因植物和野生親緣種中擴(kuò)散。 在栽培作物和其野生近緣種具有 共同分布的區(qū)域，轉(zhuǎn)基因逃逸到野生種群的可能性 較 大 （ 2003; 2004; 2003） ， 轉(zhuǎn)基因在自然界的命運(yùn)取決于轉(zhuǎn)基因作物與近緣種間雜交后代的適合度， 且 適合度可能有一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程 （ 2002; 2002）。 對(duì)于轉(zhuǎn)基因在環(huán)境中保留和不斷擴(kuò)散將會(huì)導(dǎo)致怎樣的生態(tài)后果，目前所掌握的資料和知識(shí)均非常有限。 由 于花粉漂移造成的轉(zhuǎn)基因擴(kuò)散，受到 作物種類(lèi)、 釋放面積和環(huán)境條件的影響 （ 2002; 2004） ，在進(jìn)行距離 隔離時(shí)應(yīng)加以考慮。目前，不斷有新的生物技術(shù)手段被采用來(lái)降低或杜絕花粉漂移造成的轉(zhuǎn)基因擴(kuò)散(2002; 2001; 2003)。 水平基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因向植物病原微生物擴(kuò)散。這種現(xiàn)象只在 帶有與 植物 基因同源序列的 土壤微生物 中 發(fā)現(xiàn) 且其頻率極低 (2001; 2002; 2003)。 轉(zhuǎn)基因 植 物的 大面積釋放 也 有可能 會(huì)對(duì) 生物多樣性 產(chǎn)生不利影響 ： 轉(zhuǎn)基 因植物具有野生植物沒(méi)有的各種抗性， 可能 會(huì)迅速成為新的優(yōu)勢(shì)種群，從而影響生態(tài)平衡。 不 少作物已被人類(lèi)馴化到 沒(méi)有 人類(lèi)的耕作就生存不了的程度， 個(gè)別性狀的遺傳改良并不會(huì)增加其侵襲性 等 (2001)。 但 由于轉(zhuǎn)基因作物的大面積釋放時(shí)間尚短，對(duì)它的長(zhǎng)期效應(yīng)還需要進(jìn)行系統(tǒng)的研究（ 2004）。 對(duì)非目標(biāo)生物的危害將不利于生物多樣性。 但 到目前為止， 在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)觀(guān)察到的對(duì)非目標(biāo)生物的影響在田間極少發(fā)生（ 2002）。 不同基因?qū)Σ煌锏挠绊懯遣?同的， 對(duì)該問(wèn)題更長(zhǎng)期和更具體地進(jìn)行研究將是十分必要的 （ 2002; 2001; 2003; 2002; 2003） 。 隨著越來(lái)越多的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)入市場(chǎng)，轉(zhuǎn)基因植物中可能出現(xiàn)的非預(yù)期效應(yīng)也逐漸引起人們的關(guān)注。在相關(guān)文獻(xiàn)中， 雖然 非預(yù)期效應(yīng)較多的與轉(zhuǎn)基因食品安全性聯(lián)系在一起，但它的研究意義不僅僅在于此，外源基因的插入會(huì)對(duì)植物的生命活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生深刻的影響，各種效應(yīng)的產(chǎn)生是基因之間相互作用、代謝網(wǎng)絡(luò)綜合調(diào)控的結(jié)果，因此，非預(yù)期效應(yīng)產(chǎn)生機(jī)制的揭 示會(huì)對(duì)基因功能、基因間相互作用、網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等諸方面提供參考，對(duì)轉(zhuǎn)基因植物安全性評(píng)價(jià)具有重要的理論和實(shí)踐意義。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 3 2 轉(zhuǎn)基因植物 可能產(chǎn)生的 非預(yù)期效應(yīng) 目前， 在實(shí)驗(yàn)室條件下可以非常精確地對(duì) 施剪接，但現(xiàn) 有 的技術(shù)仍然無(wú)法 精確 控制和預(yù)測(cè)遺傳信息插入植物基因組的位置和拷貝數(shù)，況且植物體是一個(gè)復(fù)雜的生物系統(tǒng)，無(wú)數(shù)的細(xì)胞、代謝途徑和生物分子都是相互影響、相互作用的，當(dāng)一個(gè) 子導(dǎo)入植物體后，它對(duì)整個(gè)植物的影響是無(wú)法完全預(yù)測(cè)和控制的，除了產(chǎn)生預(yù)期的結(jié)果外，還可能產(chǎn)生其他 非 預(yù) 期 的變化，甚至是有害的結(jié)果，這就是非預(yù)期效應(yīng) 。如引發(fā)基因突變或改變代謝途徑，致使其最終產(chǎn)物可能含有新的成分或改變現(xiàn)有成分的含量等，也有可能以不可預(yù)測(cè)的方式改變受體植物的細(xì)胞代謝，從而使食品中產(chǎn)生新的毒素或過(guò)敏源，這些改變也可能抑制植物體內(nèi)一些重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生，使食品中缺乏這些重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物的非預(yù)期效應(yīng)進(jìn)行安全評(píng)價(jià)，主要基于以下幾個(gè)方面的理由： 轉(zhuǎn)基因植物中的的外源基因來(lái)源不同于常規(guī)育種。常規(guī)育種由于受有性親和性的限制，其基因均來(lái)自于同一物種內(nèi)；而建立在重組 術(shù)基礎(chǔ)上的植物基因工程技術(shù)，可以克服常規(guī)育種技術(shù)的不足，打破物種間 的天然屏障，實(shí)現(xiàn)基因在動(dòng)物、植物、微生物之間的轉(zhuǎn)移，甚至可以將人工合成的基因?qū)肷矬w內(nèi)。因此，轉(zhuǎn)基因植物的基因既可來(lái)于種內(nèi)，更多的來(lái)自于不同的物種間。由于遺傳背景不同，目前還不可能完全精確地預(yù)測(cè)一個(gè)外源基因在新的遺傳背景中會(huì)產(chǎn)生什么樣的相互作用，且轉(zhuǎn)基因植物中基因的表達(dá)受環(huán)境等多種因素影響 (1999)，在轉(zhuǎn)基因植物中有可能出現(xiàn)一些在常規(guī)育種中不曾遇到的新組合、新性狀，它們是否會(huì)影響生態(tài)環(huán)境和人類(lèi)健康，目前還缺乏知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)。 基因多效性 (一個(gè)基因可能 具有多種不同的性質(zhì)和功能從而對(duì)植物發(fā)育的多個(gè)方面產(chǎn)生影響，在試圖改良一個(gè)性狀時(shí)，由于外源基因的插人而對(duì)宿主體內(nèi)某些基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致其他性狀也隨之發(fā)生了變化 (1998)?；虻亩嘈杂械目深A(yù)測(cè)，有的不可預(yù)測(cè)，其效應(yīng)可有利或不利。 轉(zhuǎn)基因作物中外源轉(zhuǎn)基因的插入位點(diǎn)和插入的拷貝數(shù)存在很大的差異。一般情況下，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 (株中，外源轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)多為 1 個(gè)，但有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)多個(gè)，在一些雙子葉植物中 拷貝數(shù) 平均為 3 個(gè)，偶爾高達(dá) 20 50 個(gè)。 位點(diǎn)效應(yīng) ( 染色體上的插入位點(diǎn)是隨機(jī)的，它可以插入到任何一條染色體。由于基因插入的位置不同，因周?chē)虻挠绊懀?可能 使外源轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)化植株中的表型和遺傳學(xué)特性有所不同。根據(jù)現(xiàn)有的知識(shí)，基因的插入的位置確實(shí)會(huì)影響基因表達(dá)的強(qiáng)度和穩(wěn)定性 (2001)。 插入突變 (由于基因整合的隨機(jī)性，外源基因可以插入宿主基因組的非編碼區(qū)、結(jié)構(gòu)基因區(qū)或 調(diào)控區(qū)，引起插入突變。最常見(jiàn)的 情況有 2 種，一是由于外源基因的插入引起宿主體內(nèi)某一基因的失活。一般來(lái)說(shuō)，這種情況比較常見(jiàn)，因?yàn)橥ǔ；蛟谵D(zhuǎn)錄活躍區(qū)的整合機(jī)率大于靜止區(qū)。如果插入發(fā)生在植物基因組中一個(gè)或多個(gè)重要酶基因之中，這些基因可能不再表達(dá)重要的蛋白酶，這些酶所催化的代謝就會(huì)被阻斷，從而使植物體內(nèi)可能聚合某些毒性復(fù)合物或者不能產(chǎn)生重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；如果插入發(fā)生在某個(gè)重要基因附近，可能會(huì)改變這個(gè)重中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 4 要基因的表達(dá)，而這種表達(dá)水平的改變可能會(huì)使這個(gè)基因產(chǎn)物成為毒素或過(guò)敏源，也可能使細(xì)胞代謝發(fā)生改變，導(dǎo)致毒素或過(guò)敏源的產(chǎn) 生或重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏；如果插入發(fā)生在功能未知的列之中，由于這段 序列功能還不清楚，它的突變帶來(lái)的危害也無(wú)法預(yù)料，但不能完全否定這種危害的存在。 另一種情況是由于外源基因的插入使阻抑基因失活，則可以使原來(lái)沉默的基因激活。雖然目前的科技水平還難以預(yù)測(cè)一個(gè)外源基因在新的遺傳背景下會(huì)發(fā)生什么樣的相互作用，但目前尚無(wú)隨機(jī)插入激活毒性代謝途徑的報(bào)道。 轉(zhuǎn)入植物中的許多轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)物是高水平表達(dá)的酶，來(lái)催化各種生物化學(xué)反應(yīng)，這可能會(huì)導(dǎo)致一系列的次級(jí)效應(yīng) (1999)。通過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因來(lái)提高酶的生物合成，會(huì)發(fā)生耗盡酶底物和酶反應(yīng)產(chǎn)物積累的情況。而在代謝途徑中改變代謝物流動(dòng)導(dǎo)致非預(yù)期的增加或降低其他物質(zhì)含量的情況也有相關(guān)報(bào)道。在植物細(xì)胞中表達(dá)的新酶活性也可以導(dǎo)致某種代謝物從一個(gè)次生代謝途徑轉(zhuǎn)換到另一個(gè)途徑。 目前，對(duì)這些情況還所知甚少，估計(jì)在不同作物之間，同一種作物的不同品種、品系都會(huì)存在差異。這種轉(zhuǎn)基因表達(dá)所帶來(lái)的次