密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 兩個(gè)受水稻白葉枯病菌調(diào)控的水稻基因( 鑒定和 功能 初探 of of I 摘 要 闡明水稻 白葉枯病菌 (簡稱 和 性 互作中水稻重要基因的功能 ， 對(duì)于深入了解水稻抗 /感病機(jī)制 ， 探索更為科學(xué)有效的防治方法具有重要的意義。在前期工作中 ， 本實(shí)驗(yàn)室 用 析 了 水稻 品種日本晴 懸浮細(xì)胞與 互作時(shí) 的基因表達(dá)譜，篩選到了一批在互作中差異表達(dá)的基因 ； 其中 用 實(shí)時(shí)定量 分析 水稻 的 感病 互作 ， 驗(yàn)證了這兩個(gè)基因表達(dá) 同樣 顯著地受 本研究 對(duì) 并為 進(jìn)一步分析 它們的 功能奠定基礎(chǔ) 。 根據(jù) 列， 設(shè)計(jì) 和 合成了特異性引物，通過 目的片段克隆到 進(jìn)行 序 列 測(cè)定 。通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)克隆的 目的基因 序列 與 物信息學(xué)分析表明， 號(hào)染色體上，具有 5個(gè)外顯子和 4個(gè)內(nèi)含子， 成熟 28核苷酸 ；可編碼具有 175個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，具有 ；推測(cè) 它 可能與淋巴細(xì)胞中 與了新生多肽的折疊 。號(hào)染色體上，具有 6個(gè)外顯子和 5個(gè)內(nèi)含子，成熟 140核苷酸 ；可編碼具有 424個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，具有 2守結(jié)構(gòu)域，推測(cè)該蛋白可能為 C結(jié)合蛋白 A。 將 到 其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株 E3)入 驗(yàn)獲得了一條與預(yù) 測(cè)分子量大小相當(dāng)?shù)拿黠@條帶。 用 行 了 究 。 將 5建了含有 5基因槍轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮 細(xì)胞，用激光共聚焦顯微鏡觀察融合基因的瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn) 要在 細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。 分 別 用 含 因 過 量 表 達(dá) 載 體 擾 載 體稻品種日本 晴 愈傷組織 ， 經(jīng)潮 霉 素 抗性 篩選、分化等過程 ， 分別 獲 得 了 將 隆 到 構(gòu)建了用于 用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化水稻品種日本晴愈傷組織，得到了抗潮霉素抗性轉(zhuǎn)化苗。 檢測(cè) 表明 ， 試驗(yàn)獲 得了 關(guān)鍵詞 ： 水稻 ； 白葉枯病菌 ； 功能 分析 of of in is of to of In to of 1 to or in 21 to We CR to of In we to of NA by to of 00% in 28nt a 175 aa a it as is in 140a 424 aa a 2it is a of FP 5by 5by to of in to A by to to 0 CR US 錄 第一章 文獻(xiàn)綜述 . 1 物與病原菌互作分子機(jī)制的研究進(jìn)展 1 因?qū)驅(qū)W說 1 發(fā)子 /受體模型 1 衛(wèi)模型 1 物抗病基因 1 稻與白葉枯病菌互作的分子機(jī)制 3 稻白葉枯病 3 稻白葉枯病菌無毒基因研究概況 3 稻抗白葉枯病基因研究進(jìn)展 3 稻感病基因研究 5 因功能分析策略 5 物信息學(xué) 5 因陷阱 6 于突變的基因功能 分析技術(shù) 6 白質(zhì)組學(xué)研究 6 因沉默技術(shù) 7 因功能研究的重要方法 擾技術(shù) 7 擾技術(shù)發(fā)展歷程 7 擾的機(jī)制 7 制的模型 8 用 術(shù)研究水稻基因功能研究 9 究水稻基因功能的關(guān)鍵技術(shù) 9 稻遺傳轉(zhuǎn)化的 受體 9 稻遺傳轉(zhuǎn)化的方法 9 研究的目的意義和研究內(nèi)容 10 究目的和意義 10 要研究內(nèi)容 10 術(shù)路線 11 第二章 目的基因 隆、測(cè)序及生物信息學(xué)分析 . 12 料和方法 12 稻總 提取 12 成 13 的基因的擴(kuò)增 14 的基因 隆 16 的基因序列分析 19 碼蛋白同源性比對(duì)及蛋白結(jié)構(gòu)分析 19 果與分析 19 的基因 克隆 19 因序列分析 22 碼蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)與分析 23 章小結(jié)與討論 26 第三章 原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位 . 27 料與方法 27 原核表達(dá) 27 亞細(xì)胞定位 29 果與分析 33 原核表達(dá) 33 亞細(xì)胞定位 34 章小結(jié)與討論 36 第四章 因過量表達(dá)和 性植株的獲得 . 38 料與方法 38 桿菌的轉(zhuǎn)化 38 養(yǎng)基的準(zhǔn)備 39 傷組織的轉(zhuǎn) 化及抗性苗的再生 40 果與分析 41 桿菌的轉(zhuǎn)化 41 傷組織的誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)化及再生 42 章小結(jié)與討論 44 第五 章 因 元表達(dá)載體的構(gòu)建 和 基因植株的獲得 . 46 料與方法 46 元表達(dá)載體的構(gòu)建 46 桿菌轉(zhuǎn)化 48 傷組織的誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)化及再生 48 基因苗 檢測(cè) 48 V 基因苗的 色 49 果與分析 50 元表達(dá)載體 構(gòu)建 50 基因苗的獲得 51 基因苗的檢測(cè) 52 章小結(jié)與討論 53 第六章 全文結(jié)論 . 55 文結(jié)論 55 參考文獻(xiàn) . 56 致 謝 . 62 附錄 . 63 作 者 簡 歷 . 66 文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 2, 4,4, 4AS 酰丁香酮 6bp 基對(duì) 5S 椰菜花葉病毒 35S 啟 動(dòng)子 補(bǔ) 氧核糖核苷 三磷酸 二胺四乙酸 霉素 使 S S 培養(yǎng)基 6 56 大量 量培養(yǎng)基 乙酸 脂堿合成酶基因 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 分鐘轉(zhuǎn)數(shù) 二烷基苯磺酸鈉 移 羥甲基氨基甲烷 碳酸二乙酯 EB 化乙錠 OD 密度 酸 酶 落酸 甲基乙二胺 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 物與病原菌互作 分子機(jī)制的研究進(jìn)展 因?qū)驅(qū)W說 具有小種?；钥共⌒缘募闹髦参锱c其病原物之間具有復(fù)雜的相互作用。 1956年 亞麻銹病的 病理學(xué) ,提出 了 “基因?qū)驅(qū)W說 ”（ ,闡明了這類相互作用的遺傳學(xué)特點(diǎn) （ 956） 。 其基本內(nèi)容是：病原體與寄主的關(guān)系分親和與不親和兩種類型，親和與不親和病原體分別含毒性基因 (無毒基因 (親和與不親和寄主分別含感病基因 (r)和抗病基因 (R)。當(dāng)攜 有 因的病原體與攜 R 基因的寄主互作時(shí)，二者表現(xiàn)不親和，即寄主表現(xiàn)抗病性；其他 3種組合則表現(xiàn)為親和，即寄主感病。這一假說構(gòu)成了 克隆病原體無毒基因和植物抗病基因的理論基礎(chǔ)。 它 不僅可用以 改進(jìn)品種抗病基 因型與病原物致病性基因型的鑒定方法，預(yù)測(cè)病原物新小種的出現(xiàn)，而 且 對(duì)于抗病性機(jī)制和植物與病原物 協(xié)同 進(jìn)化理論的研究也 具 有指導(dǎo)作用。 發(fā)子 /受體模型 (激發(fā)子 /受體模型是對(duì)基因?qū)蚣僬f從生物化學(xué)角度的闡釋。該模型認(rèn)為：病原體的 無毒基因 直接或間接地編碼一種配體 (激發(fā)子 )，它與 抗性 基因編碼的產(chǎn)物 (受體 )相互識(shí)別后發(fā)生作用，從而觸發(fā)受侵染部位細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞過程，激活其他防衛(wèi)基因的表達(dá)，產(chǎn)生過敏性反應(yīng)（ R） (et 這種相互識(shí)別是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括病原菌通過特定的分泌系統(tǒng)把激發(fā)子輸送到植物細(xì)胞以及在此之前寄主植物與病原菌的感知過程（ Ji et et 。 例如： 擬南芥的 過識(shí)別假單胞 菌的 et 在番茄 et 衛(wèi)模型 (盡管 “ 基因?qū)驅(qū)W說 ” 以及 “ 激發(fā)子 /受體模型 ” 可以解釋很多病原菌與寄主的互作，但更多情況下還是缺乏直接的證據(jù)。這種情況下有人提出了 防衛(wèi)模型 ( 最初 這個(gè)模型用來解釋 模型認(rèn)為： 在病原物 侵染植物并營造 適合其生長的有利環(huán)境時(shí)，病原體把植物體內(nèi)的一種蛋白作為靶標(biāo)并加以改變，這種改變是植物受到病原體侵害的信號(hào)。植物抗病基因蛋白 (檢測(cè)到這種信號(hào)。當(dāng)植物抗病基因蛋白 發(fā)現(xiàn)其衛(wèi)兵受到攻擊時(shí)，抗病性被觸發(fā)。防衛(wèi)模型中植物抗病基因蛋白不僅能識(shí)別無毒基因蛋白，而且能監(jiān)視被病原體毒性 /致病蛋白作為攻擊目標(biāo)的重要植物蛋白 /復(fù)合體 (et 2002)。 物抗病基因 （ R 植物的抗病性是指植物避免、中止或阻滯病原物侵入與擴(kuò)展，減輕發(fā)病和損失程度的一類特中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 2 性?？共⌒允侵参锱c其病原生物在長期的協(xié)同進(jìn)化中相互適應(yīng)、相互選擇的結(jié)果，病原物發(fā)展出不同類別、不同程度的寄生性和致病性，植物也相應(yīng)地形 成了不同類別、不同程度的抗病性。病原物的寄生?；栽綇?qiáng)，則寄主植物的抗病性分化也越明顯。寄主的抗病性僅僅針對(duì)病原物群體中的少數(shù)幾個(gè)特定小種，這稱為小種?；共⌒裕?具有該種抗病性的寄主品種與病原物小種間有特異性的相互作用。與小種專化抗病性相對(duì)應(yīng)的是非小種?；共⌒裕?具有該種抗病性的寄主品種與病原物小種間沒有明顯特異性相互作用，是針對(duì)病原物整個(gè)群體的一類抗病性 。 從廣義上講植物抗病基因 (防御反應(yīng)基因 (是在植物抗病反應(yīng)過程中起抵抗病菌侵染及擴(kuò)展的有關(guān)基因。所謂抗病基因就是基因?qū)?( 說中所指的與病原菌無毒基因相對(duì)應(yīng)的，存在于植物特定品種中，在植物生長的整個(gè)周期或其中某個(gè)階段為組成型表達(dá)的植物抗病品種所特有的一類基因 （ 001） 。植物防御反應(yīng)基因的特點(diǎn)是，在抗病和感病品種中均存在，其差異主要體現(xiàn)在基因表達(dá)的時(shí)間、空間及產(chǎn)物含量的不同，為組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)的一類基因。 目前已經(jīng)有許多 R 基因被克隆 （ et 。盡管這些基因使寄主株植物分別對(duì)真菌、細(xì)菌、病毒或者線蟲等不同的病原生物具有抗性，但是它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上都具有一定的相似性。它們編碼的蛋白一般都具有富亮氨酸重復(fù)（ 序或者絲氨酸 酶 結(jié)構(gòu)域 (根據(jù)它們編碼的蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通常 劃分為 5 個(gè)類別 （ et ： 1） 這類基因編碼類似胞質(zhì)受體的蛋白 （ ， 這類蛋白具有一個(gè)苷酸結(jié)合位點(diǎn)（ 這個(gè)家族的基因包括擬南芥中的 茄 中的 草中的 麻中的 基因等等。 2） 絲氨酸 這類基因主要以 蘇氨酸激酶，這個(gè)激酶與哺乳動(dòng)物的 3） 這類基因包括番茄中的 及甜菜中的 中 4） 這類基因以 括一個(gè)胞外 蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。 5） 毒素還原酶類 這類抗病基因以 個(gè)還原酶可以使 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 3 稻與白葉枯病菌互作的 分子機(jī)制 稻白葉枯病 水稻白葉枯病是由 黃單胞桿菌水稻 致病 變種（ 侵染引起的重要的水稻病害。該病害是一種維管束病害，在自然條件下， 入木質(zhì)部，在其中繁殖，并向?qū)Ч芤苿?dòng)。一旦進(jìn)入導(dǎo)管， 至導(dǎo)管被菌體和胞外多糖、黃原膠堵塞。如果在苗期或分蘗早期侵染，將會(huì)造成稻苗的萎蔫。如果在后期侵染，病斑會(huì)沿著葉脈擴(kuò)展，并逐漸變成灰綠色至黃色。種植抗病品種是控制水稻白葉枯病的主要措施，但因 和新毒性群體的出現(xiàn)，往往使經(jīng)過多年 培育 的抗病品種在推廣種植幾年后就失去了抗病性。 近年來，隨著水稻全基因組及水稻白葉枯病菌（ 基因組測(cè)序的完成，大大方便了對(duì)水稻與 于水稻與 此也可以看作是細(xì)菌病害的模式病害。目前對(duì)該病害的研究從理論上和應(yīng)用上都取得了許多進(jìn)展，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面 :（ i）從基因?qū)驅(qū)W說角度解釋寄主與病原菌的相互作用，通過遺傳圖譜和物理圖譜的構(gòu)建，對(duì)抗性基因進(jìn)行定位和克隆 ;（ 克隆的白葉枯病抗性基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能研究，尋找抗性基因作用的模式 ;（ 分子水平研究白葉枯病抗性基因和無毒基因的作用模式 :（ 核酸水平和蛋白質(zhì)水平研究白葉枯病抗性基因的形成和進(jìn)化 ;（ v）利用分子標(biāo)記技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)， 針 對(duì)水稻白葉枯病進(jìn)行抗性育種 （劉小豐 2006） 。 稻白葉枯病菌無毒基因研究概況 目前已從 中 基因組合，這也證實(shí)了 et 李平 等， 2004） 。 稻抗白葉枯病基因研究進(jìn)展 抗性基因的鑒定是開展抗病性育種的重要基礎(chǔ)性工作。通過各國科學(xué)家的努力，現(xiàn)在已經(jīng)鑒定了 30個(gè)水稻抗白葉枯病基因。在這 30個(gè)基因中， 21個(gè)為顯性基因 ( 9個(gè)為隱性基因 ( 5個(gè)基因已經(jīng)被克隆； 其中 表 1） （章琦 2005） 。 表 1 至 2005年 已鑒定的水稻白葉枯病抗性基因 . of to in up 005. 鑒定基因 命名 用菌株 (小種 ) 表品種 色體 日本菌株 玉， 日本 4 尼菌株 生愛國， 1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 4 7147,律賓菌 ) 菲律賓菌 ) 菲律賓菌 ) 律賓菌 ) 菲律賓菌 ) 1 菲律賓菌 ) 菲律賓菌 ) 菲律賓菌 ) 定位 菲律賓個(gè)小種 1 尼菌系 定位 尼菌系 ) 黃玉， 菲律賓小種 1,2,4,6 菲律賓小種 3,5 日本小種 I,V 未定位 日本小種 V 定位 日本小種 蘇稔 未定位 緬甸菌株 陽 23, 豐錦 未定位 6個(gè)菲律賓小種 定位 6個(gè)菲律賓小種 定位 #* 菲律賓小種 1,2,4,6 長藥野生稻（ 11 t)# 扎昌龍 11 菲律賓小種 6 普通野生稻 (11 t) 菲律賓小種 1,2,4,6 定位 t)# # 小粒野生稻 78定位 菲律賓小種 9 明恢 63 12 t)# 抗菲律賓小種 1、 3、 4 和中國 明恢 63體細(xì)胞 無性系突變體 定位 t)# 中抗菲律賓小種 13 抗菲律賓小種 5 定位 t)* 中國菌株 恢 63 11 t)#,* 菲律賓小種 2、 5 t)# 菲律賓小種 2 定位 t)# 菲律賓小種 1 藥用野生稻 1 *已克?。?# 成抗基因； # #分蘗后期表達(dá)抗性； （章琦 水稻白葉枯病抗性基因鑒定進(jìn)展及其利用 中國水稻科學(xué) 2005， 19： 453 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 5 稻感病基因研究 根據(jù)基因?qū)驅(qū)W說，人們推測(cè)與病原物毒性基因（ 對(duì)應(yīng)，應(yīng)該存在感病基因。