.,免疫學(xué)檢驗(yàn),.,第二十二章免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù),.,免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)-是利用標(biāo)記的特異性抗體（或抗原）與組織細(xì)胞內(nèi)抗原（或抗體）進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)組織和細(xì)胞抗原進(jìn)行定性、定位、定量測定的免疫檢測方法。,.,免疫組化的檢測原理,.,免疫組化的檢測原理,.,免疫組化的檢測原理,.,第一節(jié)免疫組化檢驗(yàn)技術(shù)基本知識(shí),.,免疫組化全過程,.,一、標(biāo)本制作,標(biāo)本制作是獲得良好的免疫細(xì)胞組織化學(xué)分析的保障，良好的細(xì)胞和組織學(xué)結(jié)構(gòu)將有助于抗原的準(zhǔn)確顯示和定位。（一）標(biāo)本的主要來源主要有：活體組織各種體液及穿刺液培養(yǎng)細(xì)胞等,.,（二）標(biāo)本的固定與保存1組織材料的固定目的防止組織細(xì)胞的死后變化，以保持其固有形態(tài)使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)等各種抗原成份轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起來而產(chǎn)生不同的折射率，以便染色后易于鑒別和觀察固定劑兼有硬化作用，使組織硬化，便于制片防止細(xì)胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)經(jīng)過固定的組織能對(duì)染料產(chǎn)生不同的親和力而著色清晰，便于辨認(rèn)。,.,2固定劑的選擇最佳固定劑的標(biāo)準(zhǔn)最好地保持細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)最大限度地保存抗原的免疫活性3固定方法固定方法常用浸泡法主要適用于活檢和手術(shù)標(biāo)本以及其它不能進(jìn)行灌注的組織固定。灌注法適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。,.,.,（三）玻片的處理玻片的處理是做好免疫組化染色的重要步驟之一一般用免疫組織化學(xué)的載玻片均需涂一定的黏合劑，常用的切片黏合劑有樹脂膠、多聚賴氨酸和防脫片劑（四）切片方法的選擇,.,.,二、抗原處理,（一）進(jìn)行抗原的暴露和修復(fù)的原因1.固定液的影響2.抗體制備的影響（二）抗原的暴露主要采用酶消化的方法在選擇酶消化時(shí)，應(yīng)針對(duì)要顯示的不同的抗原成分而選用不同的酶在日常工作中用胰蛋白酶消化即可,.,（三）熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)抗原修復(fù)是以高溫、高壓對(duì)常規(guī)固定石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)以提高抗原抗體的陽性檢出率微波處理法水浴鍋法壓力鍋法,.,三、抗體處理,抗體是免疫組織化學(xué)技術(shù)的首要試劑（一）抗體的選擇具有高度特異性和穩(wěn)定性的優(yōu)質(zhì)抗體（二）抗體的稀釋抗原抗體反應(yīng)須有適當(dāng)?shù)谋壤?，過量或不足均不能達(dá)到預(yù)期結(jié)果（三）抗體的合理保存要特別注意保持抗體的生物活性,.,四、常用標(biāo)記物,（一）熒光素如：異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明等（二）酶如：辣根過氧化物酶(HRP)（三）生物素-親和素系統(tǒng)（四）免疫金標(biāo)記技術(shù)（五）免疫鐵蛋白技術(shù),.,五、免疫組織化學(xué)技術(shù)的結(jié)果判斷,（一）對(duì)照染色設(shè)計(jì)為了保證免疫組織化學(xué)染色的準(zhǔn)確性，證明和肯定陽性結(jié)果的特異性，排除某些非特異性染色，通常需針對(duì)第一抗體設(shè)立對(duì)照。1.陽性對(duì)照用已知抗原陽性的切片與待檢標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。目的是證實(shí)所用免疫組化染色流程的有效性，排除假陰性的可能。2.陰性對(duì)照用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對(duì)照，應(yīng)呈陰性結(jié)果，稱陰性對(duì)照。目的是排除假陽性。,.,3.陰性試劑對(duì)照是指用于證實(shí)在免疫組化染色中所用試劑（尤其是特異性抗體試劑的有效性和可靠性）而設(shè)立的同步免疫染色對(duì)照，包括有：空白對(duì)照、替代對(duì)照、吸收試驗(yàn)和抑制試驗(yàn)等。4.自身對(duì)照是指在同一標(biāo)記切片上的自身組織成分的陰性背景對(duì)照。,.,（二）陽性結(jié)果陽性細(xì)胞的顯色可位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核免疫顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞密度是定性、定量指標(biāo)陽性細(xì)胞的著色形態(tài)（如胞膜型、胞核型、胞質(zhì)(漿)型等）及組織分布特點(diǎn)（如局灶型、彌漫型、片塊型等）主要是定位指標(biāo)哪怕只有少數(shù)細(xì)胞陽性（只要是抗原所在部位）也應(yīng)視為陽性表達(dá),.,（三）陰性結(jié)果陰性結(jié)果不能簡單視為抗原不表達(dá)，由于染色方法靈敏度有高低之分，有時(shí)可因靈敏度不夠，而導(dǎo)致陰性反應(yīng)。（四）特異性顯色和非特異性顯色的鑒別1.分布位置特異性反應(yīng)必須分布于特定抗原部位非特異性反應(yīng)無一定的分布規(guī)律,.,2.顯色強(qiáng)度特異性反應(yīng)由于細(xì)胞內(nèi)抗原含量不同，顯色強(qiáng)度不一。陽性細(xì)胞的染色常定位于細(xì)胞，并與陰性細(xì)胞間有明顯間隔而非特異性染色常不限于單個(gè)細(xì)胞，常為成片的細(xì)胞3.其他在過大的組織塊，中心固定不良也會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色,.,.,六、質(zhì)量控制,質(zhì)量控制是免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)取得滿意結(jié)果的必要條件。（一）試劑質(zhì)量控制抗體的質(zhì)量是免疫組織化學(xué)染色成功的關(guān)鍵（二）操作過程質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)本的質(zhì)量控制（三）儀器設(shè)備和器具的質(zhì)量控制,.,第二節(jié)酶免組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù),酶免組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)是在一定條件下，應(yīng)用酶標(biāo)抗體（抗原）與組織或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原（抗體）發(fā)生反應(yīng)，然后加入酶的底物，催化底物顯色，借助光鏡或電鏡，就可識(shí)別出標(biāo)本中抗原（抗體）的分布和性質(zhì)；也可通過圖像分析技術(shù)達(dá)到定量的目的。,.,一、標(biāo)本制作,常用的標(biāo)本有組織切片、組織印片和細(xì)胞涂片酶免組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)可分為酶標(biāo)記抗體免疫組織化學(xué)染色法非標(biāo)記抗體酶免疫組織化學(xué)染色法,.,二、酶標(biāo)記抗體的免疫組化染色法,（一）原理酶標(biāo)記抗體的免疫組織化學(xué)染色法是借助交聯(lián)劑的共價(jià)鍵作用將酶直接連接在抗體（或抗抗體）上，酶標(biāo)抗體（或抗抗體）與組織內(nèi)特異抗原或抗原抗體復(fù)合物反應(yīng)后，通過酶對(duì)底物的催化作用，生成不溶性有色產(chǎn)物并沉淀在特定位置，達(dá)到對(duì)抗原定性、定位、定量檢測的目的。,.,（二）技術(shù)類型1.直接法形成抗原一抗體一酶復(fù)合物2.間接法形成Ag-Ab1-Ab2E復(fù)合物3.酶標(biāo)抗體三步染色法為間接法的改良法形成Ag-Ab1-Ab2E-Ab3E復(fù)合物（三）方法評(píng)價(jià),.,三、非標(biāo)記抗體酶免疫組化染色法,（一）原理該技術(shù)首先用酶免疫動(dòng)物，制備效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗酶抗體（Ab3），將酶與Ab3結(jié)合形成復(fù)合物，然后利用第二抗體（Ab2）作橋，Ab2既可與Ab3的Fc段結(jié)合，又可與結(jié)合在組織抗原上的第一抗體（Ab1）的Fc段結(jié)合，經(jīng)酶催化底物的顯色反應(yīng)，達(dá)到對(duì)抗原的檢測。,.,（二）技術(shù)類型1.酶橋法用辣根過氧化物酶（HRP）免疫動(dòng)物（如兔）制備抗HRP的抗體（Ab3），經(jīng)Ab2（如羊抗兔）作橋，將結(jié)合在組織抗原上的Ab1(兔抗相應(yīng)組織抗原的抗體)與Ab3連接起來，最后將HRP與Ab3結(jié)合形成Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP復(fù)合物，加底物顯色,.,.,2.PAP法即過氧化物酶（P）-抗過氧化物酶（AP）法，為酶橋法的改良，技術(shù)要點(diǎn)基本上與酶橋法相同，但該法將抗酶抗體（抗過氧化物酶（AP）與酶（過氧化物酶（P）制成了可溶性復(fù)合物（PAP）,該復(fù)合物由2個(gè)抗酶抗體和3個(gè)過氧化物酶分子組成，呈五角形，非常穩(wěn)定。通過橋抗體（Ab2）將特異性識(shí)別組織抗原的抗體（Ab1）與PAP復(fù)合物的抗酶抗體連接起來,.,.,.,3.雙橋PAP法該法是PAP法的改良，通過兩次連接橋抗體和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP復(fù)合物，在抗原抗體復(fù)合物上結(jié)合了比PAP法更多的酶分子，大大增強(qiáng)了方法的敏感性。4.APAAP法APAAP法就是以堿性磷酸酶代替HRP建立的堿性磷酸酶（AP）-抗堿性磷酸酶（AAP）法，簡稱APAAP法。技術(shù)要點(diǎn)與PAP法相似。,.,（三）方法評(píng)價(jià)該技術(shù)既可檢測抗原，又可檢測抗體。由于酶不是標(biāo)記在抗體上，而是經(jīng)抗原（酶）抗體反應(yīng)與抗酶抗體結(jié)合，避免了酶標(biāo)抗體的缺點(diǎn)，提高了方法的敏感性。尤其是雙橋PAP法，是當(dāng)今免疫組化技術(shù)中敏感性較高的方法。,.,四、臨床應(yīng)用,酶免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)主要用于組織切片或其它抗原的定性、定位、定量檢測。組織切片中各類抗原性物質(zhì)，如各類蛋白質(zhì)、酶、激素、細(xì)胞、病毒、腫瘤抗原、漿細(xì)胞中的免疫球蛋白、各種多肽、細(xì)胞表面標(biāo)志等均可檢測。,.,第三節(jié)熒光免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù),利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先用熒光素標(biāo)記已知抗體并以此作為探針，檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后，即會(huì)發(fā)出一定波長的熒光，進(jìn)而對(duì)組織中的某種抗原進(jìn)行定性、定位和定量分析。,.,一、標(biāo)本制作,常見的臨床標(biāo)本材料主要有組織、細(xì)胞和細(xì)菌三大類，按不同標(biāo)本性質(zhì)可制作涂片、印片或組織切片等。（一）載玻片和蓋玻片的處理載玻片和蓋玻片要厚薄均勻、潔凈及透光性好,.,（二）制片1組織切片組織材料可制備成冰凍切片或石蠟切片。2印片組織材料也可制成印片。3涂片細(xì)胞或細(xì)菌要制成涂片，涂片應(yīng)薄且均勻。,.,（三）標(biāo)本的固定主要目的是：1.防止細(xì)胞或切片從玻片上脫落2.去除妨礙抗原抗體結(jié)合的類脂3.便于保存。除活細(xì)胞外，其他標(biāo)本應(yīng)在染色前以適當(dāng)?shù)姆绞焦潭?。（四）?biāo)本片的保存固定好的標(biāo)本片應(yīng)盡快熒光染色檢查，如需保存，置-20下低溫干燥保存。,.,二、熒光抗體標(biāo)記及染色,熒光抗體是熒光免疫技術(shù)的關(guān)鍵試劑，是將熒光素與特異性抗體通過共價(jià)鍵的方式結(jié)合而成。其制備過程通常包括抗體的標(biāo)記、純化和鑒定三步。在已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光抗體，置于帶蓋的濕盒內(nèi)，37溫育30min。檢測不耐熱抗原以4過夜為宜。溫育后充分洗滌、干燥、鏡檢。,.,三、臨床應(yīng)用,1.在自身免疫性疾病中的應(yīng)用2.各種病原微生物的快速檢查和鑒定3.寄生蟲感染的診斷4.白細(xì)胞分化抗原的檢測此外還應(yīng)用于HLA、腫瘤組織中的腫瘤抗原、組織中的免疫球蛋白和補(bǔ)體組分、激素和酶的定位等。,.,第四節(jié)親和組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù),親和組織化學(xué)是利用兩種物質(zhì)之間的高度親和力而建立的一種方法。一些具有雙價(jià)或多價(jià)結(jié)合力的物質(zhì)如生物素、葡萄球菌A蛋白、植物血凝素等，對(duì)某種組織成分具有高度親和力，可與蛋白質(zhì)、糖類、熒光素和酶等多種類型的大小分子結(jié)合形成相應(yīng)復(fù)合物，采用熒光顯微鏡、酶加底物的顯色反應(yīng)等技術(shù)，在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平進(jìn)行對(duì)應(yīng)親和物質(zhì)的定位、定性或定量分析。用于親和組織化學(xué)的物質(zhì)有生物素與親和素、植物凝集素與糖類、SPA與IgG、鏈霉親和素與生物素等。,.,一、生物素-親和素法,生物素可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素也稱抗生物素，每個(gè)親和素分子有生物素結(jié)合的4個(gè)位點(diǎn)，二者可牢固結(jié)合成不可逆的復(fù)合物。,.,常用的技術(shù)類型有：1.標(biāo)記親和素-生物素法（LAB法）將親和素與標(biāo)記物（HRP）結(jié)合，一個(gè)親合素可結(jié)合多個(gè)HRP；將生物素與抗體（一抗與二抗）結(jié)合，一個(gè)抗體分子可連接多個(gè)生物素分子，抗體的活性不受影響。細(xì)胞的抗原（或通過一抗）先與生物素化的抗體結(jié)合，繼而將標(biāo)記親和素結(jié)合在抗體的生物素上，如此多層放大，提高了檢測抗原的敏感性。,.,.,2.橋連親和素-生物素法（BAB法）先使抗原與生物素化的抗體結(jié)合，再以游離親和素將生物素化的抗體與酶標(biāo)生物素搭橋連接，也達(dá)到多層放大效果。,.,.,3.親和素-生物素-辣根過氧化物酶復(fù)合物法（ABC法）此法是前兩種方法的改進(jìn)，即先按一定比例將親和素與酶（辣根過氧化物酶）標(biāo)生物素結(jié)合在一起，形成親和素-生物素-辣根過氧化物酶復(fù)合物（ABC復(fù)合物），當(dāng)其與檢測反應(yīng)體系中的生物素化抗體（直接法）或生物素化第二抗體（間接法）相遇時(shí)，ABC中未飽和的親和素結(jié)合部位即可與抗體上的生物素結(jié)合，最終形成晶格樣結(jié)構(gòu)的復(fù)合體，其中網(wǎng)絡(luò)了大量酶分子，加底物顯色，可大大提高檢測抗原的靈敏度。,.,.,二、SPA法,SPA具有和人及許多動(dòng)物如豚鼠、豬、小鼠、猴等的IgGFc結(jié)合的能力，這種結(jié)合不會(huì)影響抗體的活性。每個(gè)SPA分子可同時(shí)結(jié)合兩個(gè)IgG分子，也可一方面同IgG相結(jié)合，一方面與標(biāo)記物如熒光素、過氧化物酶、膠體金和鐵蛋白等相結(jié)合。,.,.,三、鏈霉親和素生物素技術(shù),鏈霉親和素與生物素的結(jié)合是已知自然界中最強(qiáng)的非共價(jià)相互作用之一，其功能類似親和素。利用生物素結(jié)合的二抗與酶標(biāo)記的鏈霉親和素蛋白就組成酶標(biāo)鏈霉親和素-生物素方法（LSAB）。LSAB法的特點(diǎn):特異性強(qiáng)；分子量小，穿透力強(qiáng)，放大效應(yīng)遠(yuǎn)超ABC法，故其敏感性更強(qiáng)；等電點(diǎn)中性更適合組織，可明顯減少非特異性染色，低背景著色使特異性著色更清晰；操作時(shí)間縮短，更簡便。,.,.,四、凝集素法,一種凝集素具有專一性結(jié)合某種特異性糖基的能力，同時(shí)所有生物膜都含有一定量的糖類，后者主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。因此，凝集素可作為一種探針來研究細(xì)胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多價(jià)結(jié)合能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金和鐵蛋白等示蹤物結(jié)合，從而在光鏡或電鏡水平顯示其結(jié)合部位。,.,一般認(rèn)為細(xì)胞膜上特定的糖基可用以區(qū)別細(xì)胞的類型并反映細(xì)胞在分化、成熟和細(xì)胞病變中的變化。標(biāo)記了相應(yīng)示蹤物的凝集素可用來：作為細(xì)胞分化和成熟的標(biāo)記作為細(xì)胞特殊類型的標(biāo)記腫瘤細(xì)胞伴有細(xì)胞膜的改變，細(xì)胞膜上的糖基也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化，也可用凝集素檢測出腫瘤細(xì)胞。,.,常用下列染色法：直接法標(biāo)記物直接標(biāo)記在凝集素上，使之直接與切片中的相應(yīng)糖蛋白或糖脂相結(jié)合間接法將凝集素直接與切片中的相應(yīng)糖基結(jié)合，而將標(biāo)記物結(jié)合在抗凝集素抗體上糖凝集素糖法本法是利用過量的凝集素與組織切片中特定的糖基相結(jié)合，經(jīng)沖洗后，凝集素上還存在未被占用的結(jié)合部位，未結(jié)合部位與有過氧化物酶標(biāo)記的特異性糖基相結(jié)合，形成一個(gè)“三明治樣”的糖凝集素糖的結(jié)合物。,.,第五節(jié)其他免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù),一、金免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水