.,基因工程的基本操作程序,.,基因工程的基本操作程序,1.目的基因的獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測與鑒定,.,.,知識(shí)點(diǎn)一：1.原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),啟動(dòng)子,終止子,啟動(dòng)子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動(dòng)，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。,RNA聚合酶:能夠識(shí)別啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì).(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落),.,不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。,能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì),編碼區(qū),非編碼區(qū),原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,啟動(dòng)子,終止子,.,.,能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子,不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子,內(nèi)含子：,外顯子：,知識(shí)點(diǎn)一：2.真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),.,真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),非編碼區(qū),外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列,有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)等。,非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子,.,原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較,思考,編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？,連續(xù),不連續(xù),編碼區(qū),非編碼,.,1、目的基因的獲取,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4、目的基因的檢測與鑒定,知識(shí)點(diǎn)二.基因工程基本操作的四個(gè)步驟,.,.,一、獲取目的基因,1.獲取目的基因的途徑A.從自然界已有的物種中分離B.人工合成2.獲取目的基因的方法A.從基因文庫中獲取B.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增C.利用化學(xué)方法人工合成,目的基因主要是_,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,.,一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫中直接獲取,1.基因文庫：概念見P9,2.基因文庫的分類:按外源DNA片段的來源分類,種類,基因組DNA文庫：含有一種生物的全部基因,部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫,3.基因文庫的目的,為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。,4.獲取目的基因的根據(jù)：,見課本P9,.,提取某種生物的全部DNA,用適當(dāng)?shù)南拗泼盖?一定大小的DNA片段,將DNA片段與載體連接,導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存,基因組文庫,5.基因文庫的構(gòu)建方法之一,（1）直接分離法(鳥槍法),cDNA合成過程,第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。,5.基因文庫的構(gòu)建方法之,基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫)比較,.,概念：PCR全稱為_，是一項(xiàng)在生物_復(fù)制_的核酸合成技術(shù),聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),體外,特定DNA片段,2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,.,四種脫氧核苷酸(dNTP),一對引物：,熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）,模板DNA(需含有目的基因),Mg2+(激活劑),條件：,緩沖溶液,一對寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補(bǔ),一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物,前提：,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,原理:DNA雙鏈復(fù)制前提:要有一段已知目的基因的脫氧核苷酸序列，以便合成引物。,.,過程,高溫變性（解旋為單鏈）,低溫退火（引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合）,適溫延伸（在Taq酶的作用下合成與模板互補(bǔ)的DNA雙鏈）,重復(fù)循環(huán),預(yù)變性（增加DNA變性的概率）,.,2、具體過程,.,PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)),概念：PCR全稱為_，是一項(xiàng)在生物_復(fù)制_的核酸合成技術(shù),條件：_、_、_、_.等,原理：_,方式：以_方式擴(kuò)增，即_（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）,結(jié)果：,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),體外,特定DNA片段,DNA復(fù)制,四種脫氧核苷酸,一對引物,DNA聚合酶,指數(shù),2n,使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增,要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提條件）,過程：,a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_斷裂，形成_,b、退火（復(fù)性55-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,.,PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較,堿基互補(bǔ)配對,四種脫氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高溫下變性解旋,解旋酶催化,體外復(fù)制,細(xì)胞核內(nèi),熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整個(gè)DNA分子,.,目的基因的mRNA,單鏈DNA(cDNA）,雙鏈DNA(即目的基因),反轉(zhuǎn)錄,合成,1）反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,目的基因,推測,推測,化學(xué)合成,2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：,3、人工合成的目的基因,.,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的核心,1、目的：所需物質(zhì)：,使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,2、基因表達(dá)載體的組成：,復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因,.,啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來,載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵啟動(dòng)子、終止子對于目的基因表達(dá)必不可少目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。,注意,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞-植物細(xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法,易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞-動(dòng)物細(xì)胞,顯微注射法,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞-微生物細(xì)胞,Ca2+處理使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中的DNA-感受態(tài)細(xì)胞,四、目的基因的檢測與鑒定,檢測:是否插入目的基因（DNA分子雜交技術(shù)）是否轉(zhuǎn)錄（mRNA分子雜交技術(shù)）是否翻譯（抗原抗體雜交技術(shù)）鑒定:功能活性鑒定抗性鑒定,分別提取什么進(jìn)行檢測,歸納步驟,.,DNA分子雜交示意圖,采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。,歸納:基因工程的基本操作程序,獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯,基因操作的基本步驟,基因操作的基本步驟,.,練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的處，DNA連接酶作用于處。（填“a”或“b”）,a,a,.,練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和法。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用技術(shù)，該技術(shù)的核心是和。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的作探針進(jìn)行分子雜交檢測，又要用方法從個(gè)體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。,基因槍法（花粉管通道法）,植物組織培養(yǎng),脫分化和再分化,耐鹽基因,一定濃度鹽水澆灌,1）以下說法正確的是（）A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來,C,練習(xí),2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是A、能復(fù)制（）B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)C、具有標(biāo)記基因D、它是環(huán)狀DNA,D,練習(xí),3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（）A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞D、人工合成目的基因不用限制