密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文 表達(dá)犬瘟熱病毒 F 和 H 基因的重組犬 2 型 腺病毒的構(gòu)建 ( 博士研究生: 周 潔 指 導(dǎo) 教 師: 陳洪巖 研究員 申請(qǐng)學(xué)位類(lèi)別: 農(nóng)學(xué)博士 專(zhuān)業(yè):預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 研究方向: 動(dòng)物病毒分子生物學(xué)與免疫學(xué) 培養(yǎng)單位: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院 哈爾濱獸醫(yī)研究所 提交日期 2007 年 6 月 ( 2007 獨(dú) 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下 進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。 研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議 ) 論文作者簽名： 時(shí)間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時(shí)間： 年 月 日 論文評(píng)閱人、答辯委員名單 論文題目 表達(dá)犬瘟熱病毒 F 和 H 基因的重組犬 2 型腺病毒的構(gòu)建 論文作者 周 潔 指導(dǎo)教師 陳洪巖 培養(yǎng)單位 哈爾濱獸醫(yī)研究所 姓名 職稱(chēng)職務(wù) 導(dǎo)師類(lèi)別 單位 專(zhuān)業(yè) 評(píng)閱人 盲 評(píng) 答辯 主席 華育平 教授 博士導(dǎo)師 東北林業(yè)大學(xué) 野生動(dòng)物 疾病防制 劉文周 教授 博士導(dǎo)師 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 預(yù)防獸醫(yī) 師東方 教授 博士導(dǎo)師 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 預(yù)防獸醫(yī) 童光志 研究員 博士導(dǎo)師 哈爾濱獸醫(yī)研究所 預(yù)防獸醫(yī) 劉勝旺 研究員 博士導(dǎo)師 哈爾濱獸醫(yī)研究所 預(yù)防獸醫(yī) 于 力 研究員 博士導(dǎo)師 哈爾濱獸醫(yī)研究所 預(yù)防獸醫(yī) 曲連東 研究員 博士導(dǎo)師 哈爾濱獸醫(yī)研究所 預(yù)防獸醫(yī) 答 辯 委 員 答辯時(shí)間與地址 2007/06/16 哈爾濱獸醫(yī)研究所 記錄人員 高玉龍 I 摘 要 犬瘟熱 (由犬瘟熱病毒 (染引起的急性、高度接觸性傳染病，是當(dāng)前對(duì)養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)危害最大的疾病之一。 雖然常規(guī)弱毒疫苗在控制 也存在難以克服的缺點(diǎn)，弱毒苗可引起免疫抑制和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損壞，隨著 毒疫苗的使用還可能致死某些易感動(dòng)物并帶來(lái)散毒的危險(xiǎn)。因此研制安全、高效的犬瘟熱疫苗具有重要的實(shí)際意義?；钶d體疫苗具有成本低、效果好和使用安全、方便等諸多優(yōu)點(diǎn)。犬 2型腺病毒 (弱毒株是批準(zhǔn)用于犬傳染性肝炎和犬傳染性喉氣管炎免疫預(yù)防的疫苗株，其 失或插入外源基因不會(huì)影響病毒的復(fù)制。因此， 研究旨在構(gòu)建表達(dá) 3區(qū)缺失的重組 達(dá)到同時(shí)預(yù)防犬瘟熱、犬傳染性肝炎和犬傳染性喉氣管炎的目的。 本研究首先從 苗株中提取了全基因組，克隆了包括 及其側(cè)翼序列 p基因和部分 因在內(nèi)的 4164基因片段。對(duì)該片段的核苷酸序列及氨基酸序列的分析結(jié)果表明 全長(zhǎng) 1504向有 2 個(gè)開(kāi)放閱讀框，分別編碼大小為 13.3 40.7 兩個(gè)多肽。其中 肽的基因編碼框與 p基因的編碼框有部分重疊。距 起始位置的上游 340發(fā)現(xiàn)一 測(cè)為 的啟動(dòng)子序列。將該片段的序列與強(qiáng)毒株 26/61 株進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)二者在 僅有 2 個(gè)堿基不同，氨基酸同源性則為 100，由此推斷編碼的蛋白對(duì) 毒力沒(méi)有影響，這一結(jié)果為構(gòu)建 缺失載體提供了理論依據(jù)。 根據(jù)對(duì) 別選取基因組中 240502495363627238下游同源重組臂，針對(duì)這兩段序列設(shè)計(jì)兩對(duì) 切位點(diǎn)，將擴(kuò)增的兩目的片段順次克隆于 失了 14123區(qū)序列，并在缺失位置插入了 克隆位點(diǎn)，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因（ 建了 該載體轉(zhuǎn)染 過(guò)連續(xù) 6輪蝕斑篩選獲得了表達(dá)綠色熒光蛋白的重組病毒單一克隆株 鑒定 物試驗(yàn)證實(shí) 研究為進(jìn)一步開(kāi)展 在成功構(gòu)建了重組病毒 基礎(chǔ)上，利用 增得到了犬瘟熱病毒( 株的融合蛋白基因（ F）和血凝蛋白基因（ H），對(duì)其進(jìn)行序列分析后將 F 和 H 基因分別用 酶消化后，定向插入到載體 ，替代了 因，構(gòu)建了重組轉(zhuǎn)移載體 親本病毒，反向蝕斑篩選、純化獲得了表達(dá) F 及 H 基因的重犬 2 型腺病毒 接免疫熒光試驗(yàn)與 驗(yàn)均證明 和 H 基因分別在在 染 胞中獲得表達(dá)， 并具有良好的反應(yīng)原性， 為下一步重組活載體疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。 為了配合 以鑒別重組病毒疫苗免疫的動(dòng)物和自然感染 本研究利用基因工程抗原建立了檢測(cè) 照 衣殼蛋白 (N)基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物， 擴(kuò)增了 基因，經(jīng)序列測(cè)定和分析后，將其定向克隆于原核表達(dá)載體 構(gòu)建的重組質(zhì)粒 3蛋白，經(jīng) 蛋白具反應(yīng)活性；用純化后的蛋白作為抗原，建立了間接 阻斷試驗(yàn)、交叉反應(yīng)試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)及與進(jìn)口試劑盒 感性，能夠?yàn)槲覈?guó)在犬瘟熱病流行病學(xué)調(diào)查及疫苗的免疫效果的監(jiān)測(cè)等方面提供技術(shù)支持。 關(guān)鍵詞 ：犬腺病毒，重組病毒，犬瘟熱病毒，融合蛋白基因，血凝蛋白基因，核衣殼蛋白基因，間接 by is of in in D: it it be a So as (is to be in E3 is to it of to or of to of is to a DV D, In we 164bp 3 its p 3 504bp in in 3.3 0.7 A at 40bp 3 it to 3. 3 26/61 of 00%. we 3 no 3 we 405024953bp 636227238 bp as to at of of CR 412bp 3 by a E a 3 as on as of CR of be We of In IV a of on as by by be in So be as a D. To a on DV In 3of as a of of is as be a of DV V 目 錄 前 言 . 犬瘟熱概述 .瘟熱病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) . 2 瘟熱病的免疫預(yù)防 . 4 2 腺病毒載體的研究進(jìn)展 .病毒載體構(gòu)建的理論基礎(chǔ) . 7 1 區(qū)的結(jié)構(gòu)與功能 . 8 3 區(qū)的結(jié)構(gòu)與功能 . 9 4 區(qū)的結(jié)構(gòu)與功能 . 9 病毒載體的類(lèi)型 . 10 助病毒依賴缺陷型腺病毒載體 . 10 殊細(xì)胞依賴缺陷型腺病毒載體 . 10 依賴型腺病毒載體 . 11 病毒載體的優(yōu)越性 . 11 病毒載體的應(yīng)用 . 13 病毒載體在基因治療中的應(yīng)用 . 13 病毒載體在人載體疫苗中的應(yīng)用 . 13 病毒載體在動(dòng)物載體疫苗研究中的應(yīng)用 . 14 3 犬腺病毒及犬腺病毒載體 .腺病毒的基本生物學(xué)特性 . 15 腺病毒基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn) . 16 組犬腺病毒載體的構(gòu)建 . 17 4 本研究的目的及意義 .究報(bào)告 .驗(yàn)一 犬 2 型腺病毒疫苗株 及其側(cè)翼序列的克隆與序列分析 . 材料與方法 .胞、病毒和菌種 . 21 要試劑 . 21 毒擴(kuò)增 . 21 物 . 21 毒基因組的提取 . 21 的基因的擴(kuò)增 . 22 . 22 腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 . 22 化 . 22 裂解法小量提取質(zhì)粒 . 23 組質(zhì)粒的序列測(cè)定與分析 . 23 2 結(jié)果 .3 區(qū)及其側(cè)翼序列的 . 23 列分析結(jié)果 . 24 3 討論 .驗(yàn)二表達(dá)綠色熒光蛋白的 失重組犬 2 型腺病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析 . 材料和方法 .毒、載體及細(xì)胞 . 31 要試劑 . 32 驗(yàn)動(dòng)物 . 32 3 缺失轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 . 32 量法提取 . 34 本病毒 . 34 組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 . 35 組病毒的篩選及純化 . 35 組病毒的 . 35 組病毒生長(zhǎng)特性的鑒定 . 36 組病毒的形態(tài)學(xué)鑒定 . 36 組病毒遺傳穩(wěn)定性檢測(cè) . 36 組病毒作為疫苗載體的安全性評(píng)估 . 36 2 結(jié)果 .3 缺失轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 . 36 組病毒的篩選及純化 . 41 一克隆 . 42 組病毒的形態(tài)學(xué)鑒定 . 43 組病毒的生長(zhǎng)特性 . 44 傳穩(wěn)定性檢測(cè) . 45 組病毒的安全性評(píng)估 . 46 3 討論 . 于 及其缺失后的容量 . 47 于報(bào)告基因的選擇 . 48 于轉(zhuǎn)染的方法 . 49 于重組病毒的篩選 . 49 于重組病毒生物學(xué)特性的鑒定 . 49 實(shí)驗(yàn)三 和 . 材料及方法 .毒和細(xì)胞 . 52 粒 . 52 要試劑 . 52 . 52 瘟熱病毒的增殖