密級： 論文編號： 中國農業(yè)科學院 博士學位論文 雞源鸚鵡熱衣原體主要外膜蛋白（基因重組腺病毒活載體疫苗研究 on of of 士研究生： 周繼章 指 導 教 師： 邱昌慶 研究員 申請學位類別： 農學博士 專 業(yè)： 預防獸醫(yī)學 研 究 方 向： 動物傳染病分子流行病學與免疫學 培 養(yǎng) 單 位： 研究生院 蘭州獸醫(yī)研究所 提交日期 2006 年 5 月 on of of 2006 獨 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下 進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中國農業(yè)科學院或其它教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時間： 年 月 日 關于論文使用授權的聲明 本人完全了解中國農業(yè)科學院有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：中國農業(yè)科學院有權保留送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。同意中國農業(yè)科學院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學位論文的全部或部分內容。 (保密的學位論文在解密后應遵守此協(xié)議) 論文作者簽名： 時間： 年 月 日 導師簽名： 時間： 年 月 日 I 論文評閱人、答辯委員名單 論文題目 雞源鸚鵡熱衣原體主要外膜蛋白（基因重組腺病毒活載體疫苗研究論文作者 周繼章 指導教師 邱昌慶 培養(yǎng)單位 蘭州獸醫(yī)研究所 姓名 職稱職務 導師類別 單位 專業(yè) 評 閱 人 答辯 主席 才學鵬 研究員 博士生導師 蘭州獸醫(yī)研究所 預防獸醫(yī)學才學鵬 研究員 博士生導師 蘭州獸醫(yī)研究所 預防獸醫(yī)學黃有德 教 授 碩士生導師 甘肅農業(yè)大學 臨床獸醫(yī)學 吳 潤 教 授 博士生導師 甘肅農業(yè)大學 預防獸醫(yī)學 胡永浩 教 授 博士生導師 甘肅農業(yè)大學 預防獸醫(yī)學 殷 宏 研究員 博士生導師 蘭州獸醫(yī)研究所 預防獸醫(yī)學 劉湘濤 研究員 碩士生導師 蘭州獸醫(yī)研究所 預防獸醫(yī)學 答 辯 委 員 劉在新 研究員 博士生導師 蘭州獸醫(yī)研究所 預防獸醫(yī)學 答辯時間與地址 2006 年 6 月 16 日于蘭州獸醫(yī)研究所學術廳 記錄人員 魯炳儀 雞源鸚鵡熱衣原體主要外膜蛋白（因重組腺病毒 活載體疫苗研究 摘 要 本研究分離了雞源鸚鵡熱衣原體，建立了雞衣原體病 斷方法。利用 失的人腺病毒 5 型載體，首次在國內外成功構建了含有雞源鸚鵡熱衣原體主要外膜蛋白（基因的重組腺病毒。并用重組腺病毒對本動物雞進行了免疫試驗和安全試驗。 （1 ） 從疑似患鸚鵡熱衣原體病雞分離到衣原體，經涂片觀察、接種雞胚，碘染色試驗、磺胺嘧啶鈉試驗、電子顯微鏡觀察，確定為鸚鵡熱衣原體，命名為，100擇 立了雞源鸚鵡熱衣原體斷方法，并對其特異性、敏感性和靈敏度進行了驗證。 （2 ） 對雞源鸚鵡熱衣原體 因進行了克隆和測序，并與禽源鸚鵡熱衣原體其他菌株的 因進行了序列比較。結果表明，與禽源衣原體鴨（的 基酸序列同源性為 與火雞（株 基酸序列同源性為 與鴿子（ 基酸序列同源性為 與長尾小鸚鵡（株的 基酸序列同源性為 （3 ） 通過基因操作的方法，將雞源鸚鵡熱衣原體因置于腺病毒穿梭載體的巨細胞瘤（啟動子和 ) 尾巴之間，構建成目的基因的表達盒。構建的穿梭載體與腺病毒骨架載體在 程菌內進行同源重組，篩選陽性重組腺病毒質粒，命名為列測定表明， 因的氨基酸序列完全正確。轉染胞，用間接免疫熒光對表達產物檢測，證明所構建的重組腺病毒能正確表達目的基因。減蛋綜合征（性血清中和試驗表明，不能中和重組腺病毒。重組腺病毒穩(wěn)定性試驗表明，該重組病毒能穩(wěn)定攜帶外源基因進行傳代（23 代）。 （4 ） 禽源鸚鵡熱衣原體因重組腺病毒免疫雞，第 21 天測定抗體，達到 132，用 109雞，能夠抵抗 1010的攻擊獲得保護，保護率達 9/10；用減蛋綜合征病毒（測重組腺病毒抗體，表明二者無抗原抗體交叉反應。用野生型腺病毒和胞免疫的對照組均未產生任何的免疫保護效果。肌肉與皮下兩種免疫途徑試驗結果表明，二者基本無差別，考慮到田間免疫的實用性，選擇肌肉免疫。 （5 ） 根據雞免疫攻毒試驗結果，用 109 日齡小雞， 21天后用同源強毒進行攻擊，觀察結果 6個月，表明免疫小雞能夠抵抗 1010護率達 8/10。對照組 10 只雞剖檢后全部表現(xiàn)出鸚鵡熱衣原體癥狀。抗體持續(xù)期試驗表明，免疫后 21 天抗體水平達到最高（164），隨后開始逐漸下降，至 180 天時，抗體水平仍然維持在保護水平。應用衣原體法檢測了小雞的體液免疫和細胞免疫，表明二者都有應答。重組腺病毒安全性試驗表明，小雞生長正常，無排毒現(xiàn)象。重組腺病毒保存期試驗顯示，保存 1 年后 該重組腺病毒滴度有所下降，但不影響免疫力。 關鍵詞：雞源鸚鵡熱衣原體，因，重組腺病毒疫苗，雛雞 on of of CR of 1 3 in in It is to of on (1) of in 00pL as CR (2) of pL of of pL (3) of MV A) of to a of in t an CR it no in (4) of PF 1it 32. 091010on 1 , to V in of In to we of in (5) to PF 7 091 of 010 64 1a on 80 HA of no on no In 20 a a of of 目 錄 第一章 緒 言 . 1 原體概述 . 1 原體分類 . 1 衣原體病 . 2 國動物衣原體病流行情況 . 3 行情況 .原體分子生物學結構與功能 . 5 因組研究進展 . 蛋白組學研究進展 .鵡熱衣原體疫苗研究進展 . 減毒活疫苗 . 滅活疫苗 . 基因工程疫苗 . 11 語 .病毒載體的應用 . 腺病毒概況 . 腺病毒載體在疫苗研究中的應用 .國動物衣原體病研究概況 .二章 雞源鸚鵡熱衣原體分離與鑒定 . 16 料和方法 . 雞胚、實驗動物及試劑 . 方法 .果 . 血清學檢查 . 病原分離鑒定 .論 .三章 雞衣原體病 . 22 料 . 菌種、儀器及試劑 . 引物 .法 . 雞衣原體基因組提取 . . . 減蛋綜合癥病毒（ 城疫病毒（ 染性支氣管炎病毒（的. 雞衣原體白基因引物特異性檢測 . 雞衣原體敏度的檢測 .I 衣原體病斷與間接血凝（驗敏感性的比較 . 雞源鸚鵡熱衣原體病斷穩(wěn)定性試驗 .果 . 套式應結果 . . 靈敏度試驗 . 雞衣原體病斷與間接血凝（驗敏感性的比較 . 雞衣原體病斷方法穩(wěn)定性試驗 .論 .四章 雞源鸚鵡熱衣原體 . 28 料和方法 . 試劑 . 雞源鸚鵡熱衣原體（）因的 . . 回收的 體的連接與轉化 . 質粒提取 . 重組質粒酶切鑒定 . 重組質粒定 . 序列測定 . 序列同源性分析 .果 . 重組質粒酶切鑒定 . 重組質粒定 . 序列同源性比較 .論 .五章 雞源鸚鵡熱衣原體 . 33 料與方法 . 質粒載體與宿主菌 . 引物 . 增 . 載體的連接 . . 受態(tài)細胞的制備 . 細菌內同源重組 .果 . 組質粒定 . . 重組穿梭質粒酶切鑒定和定 . 重組穿梭質粒序列測定 . 重組腺病毒質粒定和酶切鑒定 .論 . 第六章 雞源鸚鵡熱衣原體 . 42 轉染與鑒定 . 42 料與方法 . 細胞、菌株和試劑 . 重組腺病毒質粒轉染胞 . 重組腺病毒的培養(yǎng) . . 間接免疫熒光檢測目的基因的表達 . 重組腺病毒與減蛋綜合征陽性血清的中和試驗 . 重組腺病毒穩(wěn)定性試驗 . 有限稀釋法測定重組腺病毒毒價 . 重組腺病毒噬斑試驗測定毒價 .0 重