密級： 論文編號 ： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文 水稻白葉枯病菌 控系統(tǒng)的鑒定及其對運(yùn)動(dòng)性和毒性調(diào)控功能的分析 of a 士研究生：許景升 指 導(dǎo) 教 師：何晨陽 研究員 申請學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)博士 專 業(yè)：植物病理學(xué) 研 究 方 向：植物病原物分子互作 培 養(yǎng) 單 位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院 植物保護(hù)研究所 提交日期 2007 年 6 月 of a U E 007 獨(dú) 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下 進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時(shí)間： 2007 年 06 月 20 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議 ) 論文作者簽名： 時(shí)間： 2007 年 06 月 20 日 導(dǎo)師簽名： 時(shí)間： 2007 年 06 月 21 日 論文評閱人、答辯委員名單 論文題目 水稻白葉枯病菌 控系統(tǒng)的鑒定及其對運(yùn)動(dòng)性和毒性調(diào)控功能的分析 論文作者 許景升 指導(dǎo)教師 何晨陽 培養(yǎng)單位 植物保護(hù)研究所 姓名 職稱職務(wù) 導(dǎo)師類別 單位 專業(yè) 徐世昌 研究員 博導(dǎo) 植物保護(hù)研究所 植物病理學(xué)國立耘 教授 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物病理學(xué)評 閱 人 范在豐 教授 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物病理學(xué)答辯 主席 于嘉林 教授 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物病理學(xué)王慧敏 教授 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物病理學(xué)李懷方 教授 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物病理學(xué)劉玉樂 教授 博導(dǎo) 清 華 大 學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué) 陳萬權(quán) 研究員 碩導(dǎo) 植物保護(hù)研究所 植物病理學(xué)馮 潔 研究員 博導(dǎo) 植物保護(hù)研究所 植物病理學(xué)段霞瑜 研究員 博導(dǎo) 植物保護(hù)研究所 植物病理學(xué)答 辯 委 員 答辯時(shí)間與地址 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所六樓會(huì)議室 2007 年 06 月 19 日 10:300 記錄人員 吳茂森 副研究員 摘 要 水水稻白葉枯病菌( 稱 起的白葉枯病是世界水稻生產(chǎn)上最嚴(yán)重的細(xì)菌病害之一，也是植物病原物互作研究的重要模式系統(tǒng)之一。近十年來，對 大增加了人們對其致病機(jī)理以及與水稻互作分子基礎(chǔ)的認(rèn)識。雖然已經(jīng)從 鑒定出了幾十個(gè)致病相關(guān)基因，但由于 水稻之間的互作關(guān)系以及致病機(jī)理比較復(fù)雜，許多毒性和無毒機(jī)制至今仍不清楚，致病相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其機(jī)理尚待闡明。對病調(diào)控機(jī)理的解析，將為發(fā)展新型、有效和可持續(xù)的病害控制策略和方法提供科學(xué)依據(jù)。最近公布的 基因組序列，為全面和系統(tǒng)地開展 因組學(xué)研究提供了前所未有的機(jī)遇。 為了發(fā)掘 性/ 運(yùn)動(dòng)性及其基因表達(dá)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和途徑，本研究以在植物病原細(xì)菌普遍存在的雙組分調(diào)控系統(tǒng)(靶標(biāo)，根據(jù)丁香假單胞番茄致病變種應(yīng)答調(diào)節(jié)因子因序列，搜索 基因組序列，鑒別了該基因的同源序列 計(jì)引物 因組中克隆出 列分析表明，長 648 碼 215個(gè)氨基酸，分子量為 23.2 黃單胞菌中是保守的。 其他 有 守結(jié)構(gòu)域。采用標(biāo)記置換方法，構(gòu)建了變體。水稻的致病性、對非寄主植物煙草的致敏性和胞外酶類產(chǎn)生與野生型菌株相比無明顯差異，但是其運(yùn)動(dòng)能力明顯減弱。因此，因可能參與了 動(dòng)性的調(diào)控。 通過酵母雙雜交（術(shù)，以 誘餌蛋白，從 庫中篩選出與 中一個(gè)與 作的蛋白 有 構(gòu)域。序列分析表明， 969 個(gè)氨基酸組成， 1為信號肽， 55為 構(gòu)域，608為 構(gòu)域。 細(xì)菌外膜蛋白同源，具有接收胞外信號功能的胞外環(huán)和跨膜功能的反向- 折疊桶結(jié)構(gòu)。采用插入突變的方法，對 因進(jìn)行功能分析。與野生型菌株相比，病性喪失，不產(chǎn)生胞外酶和胞外多糖，運(yùn)動(dòng)能力減弱，生長受到嚴(yán)重抑制，但是仍能引起煙草的 物被膜形成能力增強(qiáng)。因此，推測 能位于 胞外膜，負(fù)責(zé)接受來自植物或環(huán)境信號的未知信號；突變可能影響了體外信號的識別或營養(yǎng)成分( 如蔗糖) 的轉(zhuǎn)運(yùn)。 柑桔潰瘍病菌(、甘藍(lán)黑腐病菌(辣椒斑點(diǎn)病菌(、水稻白葉枯病菌(和水稻白葉枯病菌(基因組中分別存在 68、65 、64 、 52、 36 和 36 個(gè)因。在所分析的 226 種G細(xì)菌中，因分布存在差異，27% 的細(xì)菌不具有因，但是 細(xì)菌具有 30 個(gè)以上的 些細(xì)菌絕大部分屬于或- 變形菌綱或者擬桿菌屬。因此，推測這些細(xì)菌中可能具有功能保守性。 總之，在 存在 控途徑，推測 細(xì)胞外膜蛋白，可以識別胞外環(huán)境中的信號，并將信號傳遞至胞內(nèi)。 與調(diào)控了 種生物學(xué)表型的表達(dá)，包括致病性、運(yùn)動(dòng)性、胞外多糖產(chǎn)生、胞外酶活性、生物被膜形成和細(xì)菌生長。此外，位于 游的 與了 動(dòng)性的調(diào)控。 關(guān)鍵詞：水稻白葉枯病菌；毒性；運(yùn)動(dòng)性；調(diào)控途徑 I of of is of of in a to In of of oo by of is oo is to in is to of oo oo on a A NA by to 648a 15 in 3.2 kD a pI to be in a to of A a CR of m by no in on of on on is in of oo by as to An is to a ,910 bp 69 a 3 a 5 67 a 08 69 An to a is to be in a of PS In in is to to or or is 8, 65, 64, 52, 36 6 . pv 06, X. pv 004, X. pv 3913, X. pv 5X. pv . pv 11018, of 26 27% 0 As a in In a oo in is in of to of oo is to be in or is of in of 目 錄 第一章 緒論 . 物病原細(xì)菌的相互作用 . 致病因子. 植物病原細(xì)菌的早期侵染事件 . 植物病原細(xì)菌致病因子的調(diào)控機(jī)制 .病相關(guān)基因的突變方法 . 誘變 . 標(biāo)記置換（ . 基因的轉(zhuǎn)移 .母雙雜交系統(tǒng)的發(fā)展及應(yīng)用 .稻白葉枯病菌致病性的分子機(jī)理 . . 全基因組序列比較 . 活動(dòng)組分 . 代謝特征和統(tǒng) . 致病相關(guān)基因 . . . . . 原物互作中的調(diào)控研究 .研究的目的意義和技術(shù)路線 . 研究目的和意義 . 技術(shù)路線 .二章 水稻白葉枯病菌.驗(yàn)材料 . 菌株和質(zhì)粒 . 生化試劑 . 培養(yǎng)基和菌株培養(yǎng)條件 .驗(yàn)方法 . . . . . 質(zhì)粒提取 .V 記置換法構(gòu)建變體 . 構(gòu)建變體的互補(bǔ)菌株 . 變體致病性測試和過敏性反應(yīng)(分析 . 變體運(yùn)動(dòng)性(檢測 .0 .1 .果與分析 . . . 構(gòu)建 . 因突變體的互補(bǔ)分析 . 變體導(dǎo)能力和致病性測試 . 變體運(yùn)動(dòng)性分析 . 變體胞外酶活性分析 .論 .三章 酵母雙雜交系統(tǒng)分析與.驗(yàn)材料 . 菌株和質(zhì)粒 . 生化試劑 . 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 . 酵母菌株的活化 .驗(yàn)方法 . 制備雙酶切誘餌載體. 制備餌質(zhì)粒 . 取 . 除 . . 酵母菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備 . 誘餌載體和捕獲文庫共轉(zhuǎn)化酵母 . 超聲波法提取質(zhì)粒. 質(zhì)粒擴(kuò)增 .0 互作蛋白的再次驗(yàn)證 .1 陽性克隆質(zhì)粒列分析 .果與分析 . . 提取和純化. 合成和純化雙鏈. 誘餌載體. .論 .四章 水稻白葉枯病菌.驗(yàn)材料 . 菌株和質(zhì)粒 . 生化試劑 . 培