淀粉酶的分離與純化（上）浸提、鹽析、透析、濃縮,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、掌握蛋白質(zhì)分離純化的一般程序。2、掌握鹽析、透析、濃縮的基本原理與操作。,二、實(shí)驗(yàn)原理,蛋白質(zhì)作為溶液穩(wěn)定存在的兩大因素：1.蛋白質(zhì)顆粒表面大多為親水基團(tuán)，可吸引水分子，使顆粒表面形成一層水化膜，從而阻斷蛋白質(zhì)顆粒的相互聚集，防止溶液中蛋白質(zhì)的沉淀析出；2.蛋白質(zhì)顆粒表面可帶相同電荷顆粒之間相互排斥不易聚集沉淀，也可以起穩(wěn)定顆粒的作用。若去除蛋白質(zhì)顆粒這兩個穩(wěn)定因素，蛋白質(zhì)極易從溶液中沉淀。,鹽析是一種與蛋白質(zhì)的沉淀的性質(zhì)相關(guān)的分離方法：它用硫酸銨、硫酸鈉等中性鹽來破壞蛋白質(zhì)在溶液中穩(wěn)定存在的兩大因素，故能使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀。不同蛋白質(zhì)分子顆粒大小不同，親水程度不同，故鹽析所需要的鹽濃度不同，從而將蛋白質(zhì)分離。如用硫酸銨分離清蛋白和球蛋白，在半飽和的硫酸銨溶液中，球蛋白即可從混合溶液中沉淀析出除掉，而清蛋白在飽和硫酸銨中才會沉淀。鹽析的優(yōu)點(diǎn)是不會使蛋白質(zhì)發(fā)生變性。,三、儀器與試劑,1、緩沖液：0.05M磷酸氫鈉緩沖液（PH7.0），含5mmol/l2-巰基乙醇，1mmol/lEDTA,0.5mmol/l，PMSF。2、儀器：離心機(jī)，量筒，研缽，,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（一）浸提,采用緩沖液從固態(tài)粗酶粉中浸提粗酶液。稱取粗酶粉2.5g，加入20ml緩沖液，研磨5-10min，3500rpm離心分離10min，收集上清液。為提高收率，沉渣可加入適量緩沖液再浸提12次，離心，合并上清液，即為粗酶液，測定體積。測定粗酶液的酶活力，計(jì)算總酶活1(酶活力體積),（二）分級鹽析,根據(jù)粗酶液體積，計(jì)算出達(dá)到相應(yīng)飽和度需要加入的硫酸銨的量。慢慢的向粗酶液中加入硫酸銨至30%飽和度，靜置20min后，在12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心20min，分別收集上清液與沉淀A。測量上清液體積，再慢慢向上清液中加入硫酸銨至70%飽和度，靜置20min后，在12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心20min，分別收集上清液與沉淀B。按同樣的方法再次調(diào)節(jié)硫酸銨飽和度100%，靜置20min后，在12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心20min，分別收集上清液與沉淀C。,收集每一飽和度下沉淀出的蛋白質(zhì)（沉淀A,B,C），分別用5ml的緩沖液溶解.測定組分A,B,C的酶活力和蛋白質(zhì)濃度，以確定淀粉酶主要存在于哪一級的沉淀中，并計(jì)算組分B的收率。如果需要，可將采用更細(xì)的分級。,組分B的收率=（B的酶活力B的體積）/總酶活1100%,（三）透析,1、透析袋的預(yù)處理：透析袋的處理主要是除去污染物，特別是重金屬和蛋白酶等對蛋白質(zhì)有毒害作用的物質(zhì)?？稍?.1mol/l的EDTA溶液中煮30min，再換用蒸餾水煮7次，每次20分鐘。,2、透析：將所收集的具有酶活力的組分（組分B），放入透析袋，置于清水中，電磁攪拌，透析24h，中間換水3-4次。為了防止酶失活，整個透析系統(tǒng)應(yīng)低溫放置。銨離子是否除盡采用納氏試劑檢測。,（四）濃縮,透析后，透析袋中液體濃度低，體積較大，可用蔗糖或PEG6000包埋濃縮至1-