.,第六章陽性重組子的篩選和鑒定（檢）,由于重組率和轉化率不可能達到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉化子與非轉化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子。,轉化子,重組子,目的重組子,陽性重組子的篩選和鑒定（檢）,一、根據(jù)遺傳表型篩選二、應用限制性內(nèi)切酶酶切分析篩選三、核酸探針篩選四、PCR篩選五、菌落原位雜交技術,.,不同檢測方法可以歸類于以下三個層次：載體遺傳標記檢測克隆DNA序列檢測外源基因表達產(chǎn)物檢測,一、根據(jù)遺傳表型篩選,1抗生素平板篩選2互補篩選3插入表達篩選4噬菌斑篩選,1抗生素平板篩選,大多數(shù)克隆載體均帶有抗生素抗性基因，常見的有抗氨芐青霉素基因(Ampr)、抗四環(huán)素基因(Tetr)、抗卡那霉素基因(Kanr)等。如果外源DNA片段插入載體的位點在抗藥性基因之外，不導致抗藥性基因的插入失活，仍能編碼抗藥性基因，這種含有重組子的轉化細胞能夠在含有相應藥物的瓊脂平板上生長成菌落。,但是除陽性重組子以外自身環(huán)化的載體、未酶解完全的載體以及非目的基因插入載體形成的重組子均能轉化細胞而能生長，故本法僅是陽性重組子的初步篩選。,同樣還可應用插入失活雙抗生素對照篩選法，在含有兩個抗藥性基因的載體中，通過插入失活其中一個基因，可用兩個分別含有同藥物的平板對照篩選陽性重組子。如pBR322質粒含有Tetr、Ampr雙抗藥性，插入失活Tetr后，Tetr、Ampr為含載體的陰性菌落，Tet-、Ampr表型的菌落為陽性，Tet-、Amp-的表型不能生長，對未轉化的受體細胞，該方法篩選出陽性重組子的幾率較高(Tetr：四環(huán)素抗性；Ampr：氨芐毒霉素抗性，Tet-：對四環(huán)素敏感；Amp-：對氨芐青霉素敏感),Ampicillinresistant?yesyesTetracyclineresistant?Noyes,BXB,B,B,X,Ampr,ori,Ampr,Tcr,ori,Screeningbyinsertionalinactivationofaresistancegene,Replicaplating:transferofthecoloniesfromoneplatetoanotherusingabsorbentpadorVelvet(絨布).,transferofcolonies,+ampicillin,+ampicillin+tetracycline,thesecolonieshavebacteriawithrecombinantplasmid,2互補篩選,利用-半乳糖苷酶基因構建的載體如pUC系列的質粒常采用互補篩選。-半乳糖苷酶(-galactosidase)是一種把乳糖分解成葡萄糖和半乳搪的酶，最常用的-半乳糖酶基因來自大腸桿菌的Lac操縱子，它們使載體中帶有大腸桿菌Lac操縱子的調(diào)節(jié)序列和編碼-半乳糖苷酶N末端146個氨基酶的序列。用異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)可誘導這個氨基末端片段的合成，合成的片段能與宿主編碼的-半乳糖苷酶缺陷型進行基因內(nèi)互補，恢復該酶的活性，這一過程稱-互補。,因此當載體帶有LacZ調(diào)節(jié)序列和編碼半乳糖苷酸N末端146個氨基酸的序列，而宿主中該部分序列缺陷、其他部分完整時，雖然宿主編碼的或質粒編碼的片段本身都沒有活性，但它們互相協(xié)助則可在大腸桿菌內(nèi)形成一個具有酶活性的蛋白質。故在誘導物IPTG存在下，細菌在含生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)培養(yǎng)基的平板上可形成藍色菌落。當在質粒多克隆位點中插入外源DNA時，可使-半乳糖苷酶的氨基末端失活，從而不能進行互補，因此帶有重組質粒的細菌產(chǎn)生白色菌落。,.,藍白篩選,3插入表達篩選,有些載體設計時，在篩選標志基因前面連接一段負調(diào)控序列，當插入失活該負調(diào)控序列時，其下游的篩選標志基因才能表達，如pTR262質粒其Tetr基因上游存在CI基因的負調(diào)控序列，CI基因可以抑制Tetr基因的表達，當外源DNA片段插入CI基因的Hind或BglI位點時，Tetr基因阻礙解除而表達，陽性重組子為Tetr表型，而質粒本身為Tet-表型，故轉化細菌在Tetr平板中，只有含外源DNA插入片段的陽性重阻子的轉化菌才能生長成菌落。,4噬菌斑篩選,對于以噬菌體載體系統(tǒng)，外源DNA插入噬菌體載體后，重組DNA分子大小必須在野生型DNA長度的78105范圍內(nèi)，才能在體外包裝成具有感染活力的噬菌體顆粒，感染細菌后，形成清晰的噬菌斑。沒有外源DNA片段插入的載體不能包裝成噬菌體顆粒，不能感染細胞并形成噬菌斑，從而達到初步篩選的作用。,二、應用限制性內(nèi)切酶酶切分析篩選,對于初步篩選鑒定具有重組子的菌落，應小量培養(yǎng)后，再分離出重組質粒或重組噬菌體DNA，用相應的內(nèi)切酶(1種或2種)切割重組子釋放出插入片段，對于可能存在雙向插入的重組子還要內(nèi)切酶消化鑒定插入方向，然后凝膠電泳檢測插入片段和載體的大小。,.,所謂的限制性酶切圖譜法就是對載體上插入的外源DNA片段進行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉化子篩選時，工作量極大，實驗成本也高。,三、核酸探針篩選,為了進一步確定DNA插入片段的正確性，在內(nèi)切酶消化重組子凝膠電泳分離后，通過Southern印跡轉移將DNA移至硝酸纖維膜上，再用放射性核素或非放射性標記的相應外源DNA片段作為探針，進行分子雜交，鑒定重組子中的插入片段是否是所需的靶基因片段。,四、PCR篩選,PCR技術具有高度的靈敏度和特異性，能在極短的時間內(nèi)將目的基因擴增至數(shù)百萬倍，通過電泳，可直接觀察到產(chǎn)物的存在。,一些載體的外源DNA插入位點兩側，存在恒定的序列，通過與插入片段兩側的SP6及T7啟動子互補的引物，對小量抽提的質粒DNA進行PCR分析，不但可迅速擴增插入片段，而且可以直接進行DNA序列分析。對于原核或真核系統(tǒng)表達型重組子，其插入片段的序列正確性是非常關鍵的，故有必要對重組子進行序列測定。也可利用已知的外源DNA的核酸序列，設計特異的引物直接用PCR進行擴增，并檢測產(chǎn)物。,五、菌落原位雜交技術,迄今最為通用的篩選重組子技術仍為菌落或噬菌斑原位雜交技術