.,高效液相色譜法,HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC,.,高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。為了更好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進(jìn)行比較：,第一節(jié)概述,.,1高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法,HPLC優(yōu)點：高速、高效、高靈敏度、高自動化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達(dá)10cm3min-1.如分離苯的羥基化合物，7個組分只需1min就可完成。對氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，柱長約170cm，柱徑0.9cm，流動相速度為30cm3h-1，需用20多小時才能分離出20種氨基酸；而用HPLC，只需lh之內(nèi)即可完成。又如用25cm0.46cm的LichrosorbODS(5)的柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中104個組分.,第一節(jié)概述,.,2HPLC與GC,(1)GC分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機(jī)物總數(shù)的20。對于占有機(jī)物總數(shù)近80的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用HPLC進(jìn)行分離和分析。(2)GC采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用。而HPLC中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流動相對分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。,第一節(jié)概述,.,(3)GC一般都在較高溫度下進(jìn)行的，而HPLC法則經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作?？傊?，HPLC是吸取了GC與經(jīng)典液相色譜優(yōu)點，并用現(xiàn)代化手段加以改進(jìn)，因此得到迅猛的發(fā)展。目前HPLC已被廣泛應(yīng)用于分析對生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。HPLC主要缺點：儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴(yán)格。,第一節(jié)概述,.,3.液相色譜分離原理及分類,和GC一樣，LC分離系統(tǒng)也由固定相和流動相組成。其固定相可以是吸附劑、化學(xué)鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹脂或多孔性凝膠；流動相是各種溶劑。被分離混合物由流動相液體推動進(jìn)入色譜柱。根據(jù)各組分在固定相及流動相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進(jìn)行分離。色譜分離的實質(zhì)是樣品分子（以下稱溶質(zhì)）與溶劑（即流動相或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力的大小，決定色譜過程的保留行為。根據(jù)分離機(jī)制不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、液液分配色譜、化合鍵合色譜、離子交換色譜以及分子排阻色譜等類型。,第一節(jié)概述,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,一、流程（processofHPLC）,首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入,檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,.,二、主要部件（mainassemblyofHPLC）,第二節(jié)高效液相色譜儀器,4（6）個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)；脫氣裝置；梯度洗脫；進(jìn)樣系統(tǒng)；分離系統(tǒng)；檢測系統(tǒng)；,此外還配有自動進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等輔助裝置。,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,.,1高壓輸液系統(tǒng)由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成。高壓輸液泵核心部件。壓力：150350105Pa。應(yīng)符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。,第二節(jié)高效液相色譜儀器,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。恒流泵特點：在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關(guān)；恒壓泵特點：能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重視性差。它們各有優(yōu)缺點。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機(jī)械泵，它又分機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵兩種，應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)泵。,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,輸液泵按工作方式分為氣動泵和機(jī)械泵兩大類。機(jī)械泵中又有螺旋傳動注射泵、單活塞往復(fù)泵、雙活塞往復(fù)泵和往復(fù)式隔膜泵。幾種輸液泵的基本性能見下表。,名稱恒流或恒壓脈沖更換流動相梯度洗脫再循環(huán)價格氣動放大泵恒壓無不方便需兩臺泵不可高螺旋傳動注射泵恒流無不方便需兩臺泵不可中等單活塞往復(fù)泵恒流有方便可可較低雙活塞往復(fù)泵恒流小方便可可高隔膜往復(fù)泵恒流有方便可可中等,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,（動畫）,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,雙活塞往復(fù)泵：如下圖a所示，雙活塞往復(fù)泵有一個精心設(shè)計的偏心凸輪，用同步電機(jī)或變速直流電機(jī)驅(qū)動偏心凸輪，偏心凸輪再推動兩活塞作往復(fù)運動。偏心凸輪短半徑端所對應(yīng)的活塞向外伸，使該活塞的下單向閥打開吸入流動相，與此同時，偏心凸輪的長半徑端所對應(yīng)的另一活塞被推入，使其上單向閥打開，并將流動相送至色譜柱。于是，兩活塞交替伸縮，往復(fù)運動，獲得的排液特性如圖b所示，即具有穩(wěn)定的輸出流量，這樣就能避免單活塞泵液流脈沖的問題。,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,雙活塞往復(fù)泵的輸液流量比單活塞泵小得多。優(yōu)點：不必使用消除脈沖的阻尼器，避免了阻尼器的壓力消耗。缺點：設(shè)備成本較高，流量調(diào)節(jié)也比單活塞泵復(fù)雜。,雙活塞往復(fù)泵的構(gòu)造和排液特性,.,（動畫）,第二節(jié)高效液相色譜儀器,優(yōu)點：隔膜泵活塞不直接與流動相接觸，故不存在活塞密封墊磨損對流動相的污染。隔膜泵死體積?。s0.1mL），因此，更換流動相后平衡快，利于梯度洗脫。缺點：結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，價格較貴，和單活塞機(jī)械往復(fù)泵一樣，也產(chǎn)生脈沖，也需要配置阻尼裝置來消除脈沖。,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,2.脫氣裝置流動相溶液往往因溶解有氧氣或混入了空氣而形成氣泡。氣泡進(jìn)入檢測器后會在色譜圖上出現(xiàn)尖銳的噪音峰。小氣泡慢慢聚集后會變成大氣泡，大氣泡進(jìn)入流路或色譜柱中會使流動相的流速變慢或出現(xiàn)流速不穩(wěn)定，致使基線起伏。氣泡一旦進(jìn)入色譜柱,排出這些氣泡則很費時間。在熒光檢測中,溶解氧還會使熒光淬滅。溶解氣體還可能引起某些樣品的氧化或使溶液pH值發(fā)生變化。,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,目前，液相色譜流動相脫氣使用較多的是：離線超聲波振蕩脫氣；在線惰性氣體（氦氣）鼓泡吹掃脫氣；在線真空脫氣。,真空脫氣裝置：將流動相通過一段由多孔性合成樹脂膜制造的輸液管，該輸液管外有真空容器，真空泵工作時，膜外側(cè)被減壓，分子量小的氧氣、氮氣、,單流路真空脫氣裝置的原理,二氧化碳就會從膜內(nèi)進(jìn)入膜外而被脫除。一般真空脫氣裝置有多條流路，可同時對多個溶液進(jìn)行脫氣。,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,3.梯度洗脫裝置在進(jìn)行多成分的復(fù)雜樣品的分離時，經(jīng)常會碰到前面的一些成分分離不完全，而后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰型較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時間內(nèi)全部洗脫并達(dá)到相互分離，往往要用到梯度洗脫技術(shù)。HPLC的梯度洗脫是指流動相梯度，即在分離過程中改變流動相的組成或濃度。,線性梯度;階梯梯度,高壓梯度,低壓梯度,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,高壓梯度裝置結(jié)構(gòu),優(yōu)點：只要通過梯度程序控制器控制每臺泵的輸出，就能獲得任意形式的梯度曲線，而且精度很高，易于實現(xiàn)自動化控制。缺點：使用了兩臺高壓輸液泵，使儀器價格變得更昂貴，故障率也相對較高，而且只能實現(xiàn)二元梯度操作。,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,四元低壓梯度系統(tǒng)結(jié)構(gòu),只需一個高壓泵，混合就在泵前安裝了一個比例閥中完成。因比例閥是在泵之前，所以是在常壓（低壓）下混合，在常壓下混合易形成氣泡，常配置在線脫氣裝置，來自于四種溶液瓶的四根輸液管分別與真空脫氣裝置的四條流路相接，經(jīng)脫氣后進(jìn)入比例閥，混合后從一根輸出管進(jìn)入泵體。,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,梯度淋洗裝置,外梯度:利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。,.,4進(jìn)樣系統(tǒng),HPLC柱比GC柱短得多（約530cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此HPLC法中對進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置。結(jié)構(gòu)如圖所示：,第二節(jié)高效液相色譜儀器,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,（動畫）,.,5.分離系統(tǒng)色譜柱,色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長530cm，內(nèi)徑為45mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑312mm，制備柱內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm以上。一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離柱的性能不受影響。,第二節(jié)高效液相色譜儀器,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細(xì)粒度的填料（20m）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。,一般柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16mm，柱長540cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。,.,6檢測系統(tǒng),在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，電導(dǎo)檢測器等。,第二節(jié)高效液相色譜儀器,.,（l）紫外檢測器應(yīng)用最廣，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。其特點：靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm10mm，容積8L）；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。,第二節(jié)高效液相色譜儀器,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,UV/Visdetecter,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,(2)光電二極管陣列檢測器,紫外檢測器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,Photodiodearraydetecter,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,光電二極管陣列檢測器,.,二極管陣列檢測器（DAD）優(yōu)點：,第二節(jié)高效液相色譜儀器,1.可實施一個樣品的全波長掃描，方便快速確定最佳吸收波長。2.可同時給出紫外光譜和色譜圖，便于組分定性和定量。3.提供多種色譜峰純度判斷方法，包括：等高線圖法、光譜色譜三維圖法、重疊光譜圖法、波長比圖法和色譜峰純度計算法等?？蛇M(jìn)行峰的純度檢測。4.可提供各種類型的色譜圖，其中包括：單波長色譜圖、任意兩個波長的吸收比色譜圖、波長時間程序色譜圖、最大吸收波長色譜圖以及總體吸收色譜圖。其中最大吸收波長色譜圖為靈敏度最高的檢測方式，而總體吸收色譜圖為定量重復(fù)性最好的方法。,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,(3)示差折光率檢測器（differentialrefractiveindexdetector）,除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；幾乎所有物質(zhì)都有各自不同的折射率，因此差示折光檢測器是一種通用型檢測器。靈敏度可達(dá)10-7gcm-3。主要缺點：對溫度變化敏感，靈敏度低、并且不能用于梯度淋洗。分類：偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,示差折光檢測器,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,（4）熒光檢測器（fluorescencedetector）,特點：高靈敏度、高選擇性；對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,（5）電導(dǎo)檢測器conductometricdetector測量溶劑電導(dǎo)率，特別適合于離子溶液。,（6）電化學(xué)檢測器electrochemicaldetector,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,（7）電流檢測器Amperometricdetector,（8）蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）Evaporativelightscatteringdetector,由霧化器、加熱漂移管（溶劑蒸發(fā)室）、激光光源和光檢測器（光電轉(zhuǎn)換器）等部件構(gòu)成。,.,色譜柱流出液導(dǎo)入霧化器，被載氣（壓縮空氣或氮氣）霧化成微細(xì)液滴，液滴通過加熱漂移管時，流動相中的溶劑被蒸發(fā)掉，只留下溶質(zhì)，激光束照在溶質(zhì)顆粒上產(chǎn)生光散射，光收集器收集散射光并通過光電倍增管轉(zhuǎn)變成電信號。因為散射光強只與溶質(zhì)顆粒大小和數(shù)量有關(guān)，而與溶質(zhì)本身的物理和化學(xué)性質(zhì)無關(guān)，所以ELSD屬通用型和質(zhì)量型檢測器。適合于無紫外吸收、無電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測。其靈敏度與載氣流速、汽化室溫度和激光光源強度等參數(shù)有關(guān)。與示差折光檢測器相比，它的基線漂移不受溫度影響，信噪比高，也可用于梯度洗脫。,第二節(jié)高效液相色譜儀器,.,第二節(jié)高效液相色譜儀器,蒸發(fā)光散射檢測器原理（動畫）,.,。,.,一、液-固吸附色譜法(LSAC)liquid-solidadsorptionchromatography,液-固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相。吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進(jìn)行分離的。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是510m的硅膠吸附劑；流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。,.,1分離原理當(dāng)流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當(dāng)試樣分子（X）被流動相帶入柱內(nèi)，只要它們在固定相有一定程度的保留就要取代數(shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃酉嗳軇谑窃诠潭ㄏ啾砻姘l(fā)生競爭吸附:X+nSad=Xad+nS,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,達(dá)平衡時,有,其中Kad為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑上保留強，難于洗脫。Kad值小,則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。Kad值可通過吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。,適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；,.,2固定相,吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點較多，如線性容量較高，機(jī)械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，因此，以硅膠用得最多。在HPLC中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料均勻、粒度小?？籽\的優(yōu)點，能極大地提高柱效。但表面多孔型由于試樣容量較小，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,3.流動相,一般把吸附色譜中流動相稱作洗脫劑。在吸附色譜中：對極性大的試樣往往采用極性強的洗脫劑；對極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。洗脫劑的極性強弱可用溶劑強度參數(shù)（0）來衡量。0越大，表示洗脫劑的極性越強。下表列出一些常用溶劑在氧化鋁吸附劑中的0值。在硅膠吸附劑中0值的順序相同，數(shù)值可換算（0硅膠=0770氧化鋁）。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,在液-液色譜中,流動相和固定相都是液體（互不相溶）。它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。1分離原理液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。,二、液一液分配色譜法（LLPC）liquid-liquidpartitionchromatography,.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,所不同的是液液色譜的分配是在柱中進(jìn)行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。2.固定相由于液液色譜中流動相參與選擇競爭，因此，對固定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題。例如，最常用的強極性固定液，氧二丙睛，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊?fù)榈取?.,固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；為了更好解決固定液在載體上流失問題。產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相。化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。它將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面代替了固定液的機(jī)械涂漬，因此它的產(chǎn)生對液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，可以認(rèn)為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個重大突破。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計，約有3/4以上的分離問題是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行的。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,在液液色譜中為了避免固定液的流失。對流動相的一個基本要求是流動相盡可能不與固定相互溶，而且流動相與固定相的極性差別越顯著越好。根據(jù)所使用的流動相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜。正相分配色譜normalphase：采用流動相的極性小于固定相的極性，它適用于極性化合物的分離。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。反相分配色譜reversephase：采用流動相的極性大于固定相的極性。它適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,3流動相,.,三、化學(xué)鍵合相色譜法（CBPC）chemicalbondedpartitionchromatography,采用化學(xué)鍵合相的液相色譜稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜。由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團(tuán)可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,1鍵合固定相類型,用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機(jī)物可成鍵,即可得到各種性能的固定相。一般可分三類：（1）極性鍵合固定相（極性基團(tuán)）：鍵合在載體表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團(tuán)的有機(jī)分子。,.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,（2）非極性鍵合固定相（疏水基團(tuán)）：鍵合在載體表面的功能分子是烷基、苯基等非極性有機(jī)分子。如最常用的ODS（OctaDecyltrichloroSilane）柱或C18柱，它是將十八烷基三氯硅烷通過化學(xué)反應(yīng)與硅膠表面的硅羥基結(jié)合，在硅膠表面形成化學(xué)鍵合態(tài)的十八烷基，其極性很小。（3）離子交換基團(tuán)如作為陰離子交換基團(tuán)的胺基，季鍍鹽；作為陽離子交換基團(tuán)的磺酸等.,.,2鍵合固定相的制備（l）硅酸酯（Si一OR）鍵合固定相,它是最先用于液相色譜的健合固定相。用醇與硅醇基發(fā)生酯化反應(yīng)：SiOHROHSiORH20由于這類鍵合固定相的有機(jī)表面是一些單體，具有良好的傳質(zhì)特性,但這些酯化過的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇的流動相。（2）SiC或Si一N共價鍵合固定相制備反應(yīng)如下,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,共價鍵健合固定相不易水解，且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。缺點是格氏反應(yīng)不方便；當(dāng)使用水溶液時，必須限制pH在48范圍內(nèi).,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,（3）硅烷化（SiOSiC）鍵合固定相制備反應(yīng)如下：,這類鍵會固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機(jī)溶劑的優(yōu)點。能在70以下，pH=28范圍內(nèi)正常工作，應(yīng)用較廣泛.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,3反相鍵合相色譜法,此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠C18H37、硅膠苯基等；流動相是采用極性較強的溶劑，如甲醇、乙腈、水和無機(jī)鹽的緩沖溶液等。它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液為流動相，也可用于分離極性化合物；若采用水和無機(jī)鹽的緩沖液為流動相，則可分離一些易離解的樣品，如有機(jī)酸、有機(jī)堿、酚類等。反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無拖尾色譜峰的優(yōu)點。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,3反相鍵合相色譜法,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,關(guān)于反相鍵合相色譜的分離機(jī)理，可用所謂疏溶劑作用理論來解釋。這種理論把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有較強的疏水特性。當(dāng)用極性溶劑為流動相來分離含有極性官能團(tuán)的有機(jī)化合物時，一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動相的作用，促使它離開固定相，并減小其保留作用，見下圖。顯然，兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,4.正相鍵合相色譜法,此法是以極性的有機(jī)基團(tuán)，CN、NH2雙羥基等鍵合在硅膠表面，作為固定相；而以非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙臘等）為流動相，分離極性化合物。此時，組分的分配比k值隨其極性的增加而增大，但隨流動相極性的增加而降低。這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,5.離子性鍵合相色譜法,當(dāng)以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各種離子交換基團(tuán)，如一SO3H一CH2NH2、COOH、一CH2N（CH3）等時，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相；流動相一般采用緩沖溶液。其分離原理與離子交換色譜類同。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,鍵合相色譜的最大優(yōu)點：通過改變流動相的組成和種類，可有效地分離各種類型化合物（非極性、極性和離子型）。此外，由于鍵合到載體上的基團(tuán)不易流失，特別適用于梯度淋洗。據(jù)統(tǒng)計，在高效液相色譜法中，約有80的分離問題是用鍵合相色譜法解決。此法的最大缺點：不能用于酸、堿度過大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動相的體系。如何根據(jù)樣品極性種類來選擇化學(xué)鍵合的固定相，見下表。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,四、離子交換色譜法（IEC）ion-exchangechromatography,此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離。,例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,1離子交換原理離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：陽離子交換：,陰離子交換：,一般形式：RABRBA,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,達(dá)平衡時，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)）：,式中Ar，Br分別代表樹脂相中洗脫劑離子（A）和試樣離子（B）的濃度，A、B則代表它們在溶液中的濃度。離子交換反應(yīng)的選擇性系數(shù)見從表示試樣離子B對于A型樹脂親和力的大?。篕B/A越大，說明B離子交換能力越大，越易保留而難于洗脫。一般說來，B離子電荷越大，水合離子半徑越小，KB/A值就越大。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,對于典型的磺酸型陽離子交換樹脂，一價離子的KB/A值按以下順序：Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+二價離子的順序為：Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+Zn2+Mg2+對于季鋁型強堿陰離子交換樹指，各陰離子的選擇性順序為：ClO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-OH-HCO3-H2P04-IO3-CH3COOF,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,2固定相作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強弱之分。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種：（l）多孔型離子交換樹脂它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為520m，有微孔型和大孔型之分。（2）薄膜型離子交換樹脂它是在直徑約對30m的固體情性核上，凝聚12m厚的樹脂層。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,（3）表面多孔型離子交換樹脂,它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹脂。,（4）離子交換鍵合固定相,它是用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。它也分為兩種類型。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，其載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點是機(jī)械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來實現(xiàn)快速分離。,.,3流動相,離子交換色譜法所用流動相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強度）的緩沖溶液。通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。對于陰離子交換樹脂來說，各種陰離子滯留次序為：檸檬酸離子SO42C2O42-I-NO3-CrO42-Br-SCN-Cl-HCOO-CH3COO-OH-F-所以用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,陽離子的滯留次序大為：Ba2+Pb2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+MgAg+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li十但差別不如陰離子明顯。關(guān)于pH值的影響，要視不同情況而定。例如，分離有機(jī)酸和有機(jī)堿時，這些酸堿的離解程度可通過改變流動相的pH值來控制。增大pH值會使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低pH值，其結(jié)果相反。但無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會使樣品的保留增大。,.,六、離子對色譜法（IPC）ionpairchromatography,離子對色譜法是分離分析強極性有機(jī)酸和有機(jī)堿的極好方法。它是離子對革取技術(shù)與色譜法相結(jié)合的產(chǎn)物。在20世紀(jì)70年代中期，Schill等人首先提出離子對色譜法，后來，這種方法得到十分迅速的發(fā)展。1離子對色譜法原理離子對色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對離子或反離子）加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,關(guān)于離子對色譜機(jī)理，至今仍不十分明確，已提出三種機(jī)理：離子對形成機(jī)理；離子交換機(jī)理；離子相互作用機(jī)理?，F(xiàn)以離子對形成機(jī)理說明之。假如有一離子對色譜體系，固定相為非極性鍵合相，流動相為水溶液，并在其中加入一種電荷與組分離子A-相反的離子B+，B+離子由于靜電引力與帶負(fù)電的人組分離子生成離子對化合物A-B+。離子對生成反應(yīng)式,.,由于離子對化合物A-B+具有疏水性，因而被非極性固定相（有機(jī)相）提取。組分離子的性質(zhì)不同，它與反離子形成離子對的能力大小不同以及形成的離子對流水性質(zhì)不同，導(dǎo)致各組分離子在固定相中滯留時間不同，因而出峰先后不同。這就是離子對色譜法分離的基本原理。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,2鍵合相反相離子對色譜法離子對色譜法類型很多，根據(jù)流動相和固定相的極性可分為反相離子對和正相離于對色譜法。其中以鍵合相離子對色譜法最重要。這種色譜法的固定相采用非極性的疏水鍵合相如十八烷基鍵合相（ODS）等，流動相為加有平衡離子（反離子）的極性溶液（如甲醇-水或乙睛-水）。根據(jù)離子對生成反應(yīng)式，平衡常數(shù)KAB可表示為,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,根據(jù)上兩式，有,式中為相比率。容量因子k隨KAB和B+水相的增大而增大。鍵合相反相離子對色譜法操作簡便，只要改變流動相的pH值、平衡離子的濃度和種類，就可在較大范圍內(nèi)改變分離的選擇性，能較好解決難分離混合物的分離問題。此法發(fā)展迅速，應(yīng)用較廣泛.,根據(jù)定義，溶質(zhì)的分配系數(shù),第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子；陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；,.,七、尺寸排阻色譜法（SEC）size-exclusionchromatography,尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機(jī)理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的。尺寸排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級，即用來分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,尺寸排阻色譜具有其他液相色譜所沒有的特點：（1）保留時間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息。（2）保留時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低的檢測器（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強保留分子，因此柱壽命長。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質(zhì)量差別必須大于10才能得以分離。,.,1分離原理尺寸排阻色譜是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法。其固定相為化學(xué)情性多孔物質(zhì)凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴。體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其滲透過程模型見圖。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,凝膠色譜分離過程（動畫）,.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,分類：凝膠過濾色譜（gelfiltrationchromatography,GFC）：以水或緩沖溶液作流動相的凝膠色譜法。主要適合于水溶性高分子的分離。凝膠滲透色譜（gelpermeationchromatography,GPC）：以有機(jī)溶劑作流動相的凝膠色譜法。主要適合于脂溶性高分子的分離。如甲苯和四氫呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用于合成高分子的分子量（分布）的測定。,.,2固定相排阻色譜固定相種類很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。凝膠：指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。（1）軟性凝膠如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,（2）半剛性凝膠如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機(jī)溶劑作流動相。用于高效液相色譜時，流速不宜大。,（3）剛性凝膠如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，又可用有機(jī)溶劑作流動相，可在較高壓強和較高流速下操作。一般控制壓強小于7MPa，流速1cm3s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分離。,.,排阻色譜所選用的流動相必須能溶解樣品，并必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤濕凝膠。當(dāng)采用軟性凝膠時，溶劑也必須能溶脹凝膠。另外，溶劑的粘度要小，因為高粘度溶劑往往限制分子擴(kuò)散作用而影響分離效果。這對于具有低擴(kuò)散系數(shù)的大分子物質(zhì)分離，尤需注意。選擇溶劑還必須與檢定器相匹配。常用的流動相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。以水溶液為流動相的凝膠色譜適用于水溶性樣品，以有機(jī)溶劑為流動相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,3流動相,.,八、親和色譜法（AC）Affinitychromatograph,定義：利用蛋白質(zhì)或生物大分子等樣品與固定相上生物活性配位體之間的特異親和力進(jìn)行分離的液相色譜方法。固定相：將具有生物活性的配位體以共價鍵結(jié)合到不溶性固體基質(zhì)上制得。生物活性配位體：常用的有酶（如底物及其類似物）、輔酶（如類固醇）、抗體（植物激素）、激素（如糖和多糖）、抗生素（核苷酸）等?；|(zhì)：通常為凝膠，許多無機(jī)和有機(jī)聚合物都可形成凝膠，如瓊脂糖衍生物、多孔玻璃。,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,分離過程：親和色譜是吸附色譜的發(fā)展，在分離過程中涉及疏水相互作用、靜電力、范德華力和立體相互作用。在鍵合了某類配體的親和色譜柱上加入含生物活性大分子的樣品，只有那些與該柱中配位體表現(xiàn)出明顯親和性的生物大分子才會被吸附，這些被吸附的生物分子只有在改變流動相（緩沖溶液）的組成時才會被洗脫。應(yīng)用：親和色譜主要用于蛋白質(zhì)和生物活性物質(zhì)的分離與制備。,.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,.,第三節(jié)HPLC分離類型與原理,Affinitychromatograph,.,第四節(jié)HPLC的固定相和流動相,HPLC固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.01081.0109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，就是鍵合固定相，可擴(kuò)大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。承受壓力上限為3.5108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。,一、液相色譜固定相（stationaryphasesofLC）,.,液相色譜固定相的物理結(jié)構(gòu),.,第四節(jié)HPLC的固定相和流動相,（一）液-液分配及離子對分離固定相,1全多孔型固定相,它由直徑為10m的氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體微粒凝聚而成。早期采用100m的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用10m以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；硅膠微粒如國外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海試劑一廠的堆積硅珠，青島海洋化工廠的YWG系列，天津試劑二廠的DG系列等。也可由氧化鋁微粒凝聚成全多孔型固定相，如國外的LichrosorbALOXT。這類固定相由于顆粒很細(xì)（510m），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析.,.,第四節(jié)HPLC的固定相和流動相,2.表面多孔型固定相（薄殼型微珠擔(dān)體）,它的基體是實心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，厚度為12m。如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酸胺等。表面活性材料為硅膠的固定相如國外的Zpax，CorasilI和II，Vydac，Pellosil以及上海試劑一廠的薄殼玻璃珠等；表面活性材料為氧化鋁的固定相，如Pellumina；,.,第四節(jié)HPLC的固定相和流動相,為聚酰胺的，如Pellion。這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達(dá)平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。即表面積小，柱容量底。,.,第四節(jié)HPLC的固定相和流動相,.,第四節(jié)HPLC的固定相和流動相,3.化學(xué)鍵合固定相,化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；a.硅氧碳鍵型：SiOCb.硅氧硅碳鍵型：SiOSiC穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣；c.硅碳鍵型：SiCd.硅氮鍵型：SiN,.,第四節(jié)HPLC的固定相和流動相,化學(xué)鍵合固定相的特點,(1)傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；(2)壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定；(3)選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；(4)有利于梯度洗脫；(5)存在著雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；,.,第四節(jié)HPLC的固定相和流動相,（二）液-固吸附分離固定相,種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：510m；,（三）離子交換色譜分離固定相,按結(jié)構(gòu)類別：1.薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；,.,第四節(jié)HPLC的固定相和流動相,（2）離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)）按樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強堿性、弱堿性）,.,第四節(jié)HPLC的固定相和流動相,（四）空間排阻分離固定相,（1）軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠；非極性有機(jī)溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑,.,第四節(jié)HPLC的固定相和流動相,（3）硬質(zhì)凝膠,多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強度大，流動相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用?？煽乜讖讲Ａ⑶?，具有恒定孔徑和窄粒度分布。,.,第四節(jié)HPLC的固定相和流動相,二、液相色譜流動相（mobilephasesofLC）,1.流動相特性（1）液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。,.,第四節(jié)HPLC的固定相和流動相,2.流動相類別,按流動相組成分：單組分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時間。,.,3.對流動相溶劑的要求是：（1）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。（2）溶劑要與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。所謂溶劑的紫外截止波長指當(dāng)小于截止波長的輻射通過溶劑時，溶劑對此輻射產(chǎn)生強烈吸收，此時溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測量。,第四節(jié)HPLC的固定相和流動相,.,第四節(jié)HPLC的固定相和流動相,下表列出了一些常用溶劑的紫外截止波長。對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達(dá)最高靈敏度。,.,（3）高純度。由于高效液相靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長值增加50100nm。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好。勿選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。（5）低粘度。若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離.,第四節(jié)HPLC的固定相和流動相,.,第四節(jié)HPLC的固定相和流動相,4.流動相選擇,在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。常用溶劑的極性順序：水(最大)甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二氧六環(huán)四氫呋喃甲乙酮正丁醇乙酸乙酯乙醚異丙醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小),.,第四節(jié)HPLC的固定相和流動相,5.選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題,（1）盡量使