.,熒光定量PCR技術(shù)在臨床醫(yī)學研究中的應用及注意事項,.,內(nèi)容提要,一、基因診斷技術(shù)在醫(yī)學檢驗中的地位二、熒光探針定量PCR在臨床醫(yī)學中的應用三、熒光探針定量PCR在臨床醫(yī)學中的主要問題,.,基因診斷的物質(zhì)基礎及與其它診斷方法的區(qū)別,基因診斷,免疫學診斷,臨床診斷,細胞膜,細胞核,DNA,轉(zhuǎn)錄,mRNA,翻譯,蛋白質(zhì),臨床表現(xiàn),生化診斷,.,臨床實驗醫(yī)學發(fā)展,三個時代標志技術(shù)性質(zhì)生化診斷時代生化分析表象免疫學診斷時代酶免、放免表象分子(基因)診斷時代基因體外擴增(PCR)本質(zhì),.,1、病原體的定量檢測及藥物療效考評（HBV）2、腫瘤基因和腫瘤標志物表達(mRNA)的檢測（P53）3、遺傳病基因的檢測（地中海貧血）4、與疾病相關(guān)的各種蛋白質(zhì)的基因表達的定量檢測6、建立病原體的分子診斷標準,熒光定量PCR在臨床醫(yī)學中的應用,.,熒光定量PCR在病原體檢測中的應用,一、肝炎病毒定量檢測二、性病病原體檢測三、優(yōu)生優(yōu)育相關(guān)項目檢測四、結(jié)核桿菌及呼吸道病原體檢測五、其他病原體檢測,.,病毒性肝炎概況,病毒性肝炎是由多種肝炎病毒引起，以肝臟炎癥和壞死病變?yōu)橹鞯囊唤M傳染病。按病毒的生物學特征、臨床和流行病學特征，1989年在日本東京的國際肝炎學術(shù)討論會上，將其分為甲（A）型、乙（B）型、（C）型、?。―）型、戊（E）型肝炎，以后還報道了己（F）型和庚（G）型。我國是個肝炎大國，病毒性肝炎發(fā)病數(shù)位居法定管理傳染病的第一位，僅乙型肝炎病毒感染者就達1.2億，每年新增加的感染者也在百萬以上，丙肝發(fā)病率亦趨上升。慢性乙型肝炎病程遷延，如得不到及時的治療，部分將會發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，嚴重危害人類健康。,.,HBV基因型與血清型關(guān)系及流行病學分布,.,病原學,乙型肝炎檢測標志物,HBsAg，抗-HBsHBeAg，抗-Hbe抗HBcHBV-DNA,.,乙型肝炎免疫檢測和PCR結(jié)果異同,“大三陽”PCR結(jié)果陰性抗-HBs陽性，PCR結(jié)果陽性,.,熒光定量PCR技術(shù)對性傳播疾病的檢測,一、淋球菌（NGH）二、沙眼衣原體、解脲脲原體（CT、UU）(有證）三、梅毒螺旋體（TP）四、單純庖疹病毒（HSV）五、乳頭瘤病毒（HPV）（有證）六、人類免疫缺陷病毒（HIV）,.,PCR技術(shù)對性傳播疾病檢測的注意事項,1標本的選取TPHSV2臨床療效考評,.,超高倍,.,熒光定量PCR診斷TORCH綜合征,傳統(tǒng)的TORCH病原體：TOX,other,RV,CMV,HSV新近發(fā)現(xiàn)的TORCH：麻疹V、腮腺炎V、水痘帶狀庖疹V、腸道V、乙肝V、丙肝V、HPV、EBV、HIV、人庖疹V6、人微小病毒B19等,.,TORCH感染的實驗室診斷,一、組織培養(yǎng)：慢，費力，陽性率低二、血清學診斷：IgG：IgM：1、不能定量分析2、抗體的產(chǎn)生受多種因素的影響3、產(chǎn)生假陽性三、基因診斷方法原理：檢測TORCH病原體的核酸優(yōu)點：1、客觀指標2、敏感性、特異性高3、定量指標熒光定量PCR在TORCH診斷中的應用：1、篩選TORCH的患者2、建立TORCH的分子診斷標準,.,熒光定量PCR技術(shù)檢測TOX,孕婦TOX感染的危害孕早期（多少，也可對樣本稀釋后再檢測；如低于此范圍，則報告多少，如103拷貝數(shù)/ml，而不能報告為0拷貝數(shù)/ml或陰性?？截悢?shù)與病原體的關(guān)系：拷貝數(shù)與病原體的數(shù)量成正相關(guān)。一般來說細菌是多拷貝的，病毒是單拷貝的。DNA拷貝數(shù)單位和質(zhì)量單位：100拷貝HBV0.04fg國際單位IU,.,拷貝數(shù)/ml的確定：,DNA/RNA參考品（質(zhì)粒等）,測量OD260的值得到mg/ml,通過與分子量的計算，得到拷貝數(shù)/ml,不同實驗室得到的結(jié)果差別很大。,.,HCV國際單位與拷貝數(shù)換算,NGISuperQuant:1IU/mL=3.4copies/ml(NGIProductLicenseApplicationtoFDA)RocheAmplicorMonitorv2.01IU/mL=0.9copies/ml(RocheMolecularSystems)CobasAmplicorMonitorHCVv2.01IU/mL=2.7copies/ml(RocheMolecularSystems)LCxHCVRNAQuantitativeAssay1IU/mL=3.8copies/ml(AbbottDiagnostics)BayerbDNA3.0:1IU/mL=5.2copies/ml(BayerDevelopmentGroup),.,未知HCVRNA樣本,甲實驗室5000拷貝/ml,乙實驗室10000拷貝/ml,丙實驗室50000拷貝/ml,丁實驗室20000拷貝/ml,實驗室結(jié)果的互通性,.,20000IU/mlHCVRNA樣本,甲實驗室40000拷貝/ml1IU/ml2拷貝