.,熒光定量PCR技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用及注意事項(xiàng),.,內(nèi)容提要,一、基因診斷技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的地位二、熒光探針定量PCR在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用三、熒光探針定量PCR在臨床醫(yī)學(xué)中的主要問(wèn)題,.,基因診斷的物質(zhì)基礎(chǔ)及與其它診斷方法的區(qū)別,基因診斷,免疫學(xué)診斷,臨床診斷,細(xì)胞膜,細(xì)胞核,DNA,轉(zhuǎn)錄,mRNA,翻譯,蛋白質(zhì),臨床表現(xiàn),生化診斷,.,臨床實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)發(fā)展,三個(gè)時(shí)代標(biāo)志技術(shù)性質(zhì)生化診斷時(shí)代生化分析表象免疫學(xué)診斷時(shí)代酶免、放免表象分子(基因)診斷時(shí)代基因體外擴(kuò)增(PCR)本質(zhì),.,1、病原體的定量檢測(cè)及藥物療效考評(píng)（HBV）2、腫瘤基因和腫瘤標(biāo)志物表達(dá)(mRNA)的檢測(cè)（P53）3、遺傳病基因的檢測(cè)（地中海貧血）4、與疾病相關(guān)的各種蛋白質(zhì)的基因表達(dá)的定量檢測(cè)6、建立病原體的分子診斷標(biāo)準(zhǔn),熒光定量PCR在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,.,熒光定量PCR在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用,一、肝炎病毒定量檢測(cè)二、性病病原體檢測(cè)三、優(yōu)生優(yōu)育相關(guān)項(xiàng)目檢測(cè)四、結(jié)核桿菌及呼吸道病原體檢測(cè)五、其他病原體檢測(cè),.,病毒性肝炎概況,病毒性肝炎是由多種肝炎病毒引起，以肝臟炎癥和壞死病變?yōu)橹鞯囊唤M傳染病。按病毒的生物學(xué)特征、臨床和流行病學(xué)特征，1989年在日本東京的國(guó)際肝炎學(xué)術(shù)討論會(huì)上，將其分為甲（A）型、乙（B）型、（C）型、丁（D）型、戊（E）型肝炎，以后還報(bào)道了己（F）型和庚（G）型。我國(guó)是個(gè)肝炎大國(guó)，病毒性肝炎發(fā)病數(shù)位居法定管理傳染病的第一位，僅乙型肝炎病毒感染者就達(dá)1.2億，每年新增加的感染者也在百萬(wàn)以上，丙肝發(fā)病率亦趨上升。慢性乙型肝炎病程遷延，如得不到及時(shí)的治療，部分將會(huì)發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，嚴(yán)重危害人類健康。,.,HBV基因型與血清型關(guān)系及流行病學(xué)分布,.,病原學(xué),乙型肝炎檢測(cè)標(biāo)志物,HBsAg，抗-HBsHBeAg，抗-Hbe抗HBcHBV-DNA,.,乙型肝炎免疫檢測(cè)和PCR結(jié)果異同,“大三陽(yáng)”P(pán)CR結(jié)果陰性抗-HBs陽(yáng)性，PCR結(jié)果陽(yáng)性,.,熒光定量PCR技術(shù)對(duì)性傳播疾病的檢測(cè),一、淋球菌（NGH）二、沙眼衣原體、解脲脲原體（CT、UU）(有證）三、梅毒螺旋體（TP）四、單純庖疹病毒（HSV）五、乳頭瘤病毒（HPV）（有證）六、人類免疫缺陷病毒（HIV）,.,PCR技術(shù)對(duì)性傳播疾病檢測(cè)的注意事項(xiàng),1標(biāo)本的選取TPHSV2臨床療效考評(píng),.,超高倍,.,熒光定量PCR診斷TORCH綜合征,傳統(tǒng)的TORCH病原體：TOX,other,RV,CMV,HSV新近發(fā)現(xiàn)的TORCH：麻疹V、腮腺炎V、水痘帶狀庖疹V、腸道V、乙肝V、丙肝V、HPV、EBV、HIV、人庖疹V6、人微小病毒B19等,.,TORCH感染的實(shí)驗(yàn)室診斷,一、組織培養(yǎng)：慢，費(fèi)力，陽(yáng)性率低二、血清學(xué)診斷：IgG：IgM：1、不能定量分析2、抗體的產(chǎn)生受多種因素的影響3、產(chǎn)生假陽(yáng)性三、基因診斷方法原理：檢測(cè)TORCH病原體的核酸優(yōu)點(diǎn)：1、客觀指標(biāo)2、敏感性、特異性高3、定量指標(biāo)熒光定量PCR在TORCH診斷中的應(yīng)用：1、篩選TORCH的患者2、建立TORCH的分子診斷標(biāo)準(zhǔn),.,熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)TOX,孕婦TOX感染的危害孕早期（多少，也可對(duì)樣本稀釋后再檢測(cè)；如低于此范圍，則報(bào)告多少，如103拷貝數(shù)/ml，而不能報(bào)告為0拷貝數(shù)/ml或陰性?？截悢?shù)與病原體的關(guān)系：拷貝數(shù)與病原體的數(shù)量成正相關(guān)。一般來(lái)說(shuō)細(xì)菌是多拷貝的，病毒是單拷貝的。DNA拷貝數(shù)單位和質(zhì)量單位：100拷貝HBV0.04fg國(guó)際單位IU,.,拷貝數(shù)/ml的確定：,DNA/RNA參考品（質(zhì)粒等）,測(cè)量OD260的值得到mg/ml,通過(guò)與分子量的計(jì)算，得到拷貝數(shù)/ml,不同實(shí)驗(yàn)室得到的結(jié)果差別很大。,.,HCV國(guó)際單位與拷貝數(shù)換算,NGISuperQuant:1IU/mL=3.4copies/ml(NGIProductLicenseApplicationtoFDA)RocheAmplicorMonitorv2.01IU/mL=0.9copies/ml(RocheMolecularSystems)CobasAmplicorMonitorHCVv2.01IU/mL=2.7copies/ml(RocheMolecularSystems)LCxHCVRNAQuantitativeAssay1IU/mL=3.8copies/ml(AbbottDiagnostics)BayerbDNA3.0:1IU/mL=5.2copies/ml(BayerDevelopmentGroup),.,未知HCVRNA樣本,甲實(shí)驗(yàn)室5000拷貝/ml,乙實(shí)驗(yàn)室10000拷貝/ml,丙實(shí)驗(yàn)室50000拷貝/ml,丁實(shí)驗(yàn)室20000拷貝/ml,實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的互通性,.,20000IU/mlHCVRNA樣本,甲實(shí)驗(yàn)室40000拷貝/ml1IU/ml2拷貝