ICS6502020B16DB45廣西壯族自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)DB45/TXXXXXXXXX水稻品種抗南方水稻黑條矮縮病人工接種鑒定技術(shù)規(guī)范TECHNICALSPECIFICATIONFOREVALUATINGRICEVARIETIESRESISTANCETOSOUTHERNRICEBLACKSTREAKEDDWARFVIRUSDISEASEBYINOCULATION點(diǎn)擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識（征求意見稿）（本稿完成日期）XXXXXXXX發(fā)布XXXXXXXX實(shí)施廣西壯族自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DBXX/XXXXXXXXXI前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T112009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所、廣西作物病蟲害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人秦碧霞、李戰(zhàn)彪、謝慧婷、周彤、黃所生、崔麗賢、李丹婷、蔡健和、夏秀忠、蘭瑩。DBXX/XXXXXXXXX1水稻品種抗南方水稻黑條矮縮病人工接種鑒定技術(shù)規(guī)范1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水稻品種抗南方水稻黑條矮縮病（病原南方水稻黑條矮縮病毒（SOUTHERNRICEBLACKSTREAKEDDWARFVIRUS，SRBSDV）人工接種鑒定的技術(shù)規(guī)范及抗性評價標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水稻品種材料抗南方水稻黑條矮縮病性狀的鑒定與評價。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。NY/T26312014南方水稻黑條矮縮病測報技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。31病株INFECTEDPLANTS指表現(xiàn)南方水稻黑條矮縮病毒病癥狀的水稻植株（病害鑒定調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)見48）32發(fā)病率RATEOFINFECTEDPLANTS指病株占調(diào)查水稻總植株數(shù)的百分率。33無毒白背飛虱VIRUSFREEWHITEBACKEDPLANTHOPPER本標(biāo)準(zhǔn)中特指不攜帶南方水稻黑條矮縮病毒的白背飛虱（SOGATELLAFURCIFERAHORVTH）。4人工接種鑒定41接種用白背飛虱的準(zhǔn)備411白背飛虱的采集DBXX/XXXXXXXXX2白背飛虱若蟲或成蟲采集自田間。412飼養(yǎng)白背飛虱的基本設(shè)備可調(diào)控溫光的養(yǎng)蟲室（溫度保持于（261）范圍內(nèi)，相對濕度8090，光照每天12H）；1000ML玻璃或透明塑料杯、尼龍紗布（網(wǎng)眼規(guī)格1MM）、養(yǎng)蟲架、適宜白背飛虱繁殖的水稻種子（宜采用白背飛虱喜食性品種如特優(yōu)63等）；轉(zhuǎn)移白背飛虱用黑布、試管、吸蟲管等。413無毒白背飛虱群體的獲得選取飼喂白背飛虱的水稻種子用水浸種24H后，紗布覆蓋，恒溫箱（322）催芽（24H48H），選取發(fā)芽良好的種子（25粒30粒）均勻播于盛有自然肥力土壤的塑料杯中內(nèi)徑80MM110MM；大約6D7D后，待苗長至15葉期時，將待產(chǎn)的單頭白背飛虱移入杯中產(chǎn)卵，約3D后將成蟲移出，單獨(dú)保存，7D10D后孵化出若蟲。按NY/T26312014，附錄C的規(guī)定對產(chǎn)卵的白背飛虱進(jìn)行檢測，篩選其中無毒白背飛虱的后代進(jìn)行繁殖，每批隨機(jī)取出30頭50頭白背飛虱進(jìn)行帶毒率檢測，帶毒率始終為0，則該批白背飛虱為無毒白背飛虱群體。42病株準(zhǔn)備421病株采集到重病區(qū)采集表現(xiàn)南方水稻黑條矮縮病疑似癥狀的水稻植株種植在防蟲網(wǎng)籠中的塑料桶中。422病株檢測確定采病株葉片按NY/T26312014，附錄C的規(guī)定或參考附錄A進(jìn)行檢測，確認(rèn)感染南方水稻黑條矮縮病毒則作為毒源保存，并經(jīng)白背飛虱接種擴(kuò)繁病株。43飼毒方法將42的病株種于大燒杯內(nèi)徑100MM200MM中,土面覆蓋濾紙,將適量1齡2齡無毒白背飛虱移入其中,并用60目防蟲網(wǎng)封口。飼毒2D后將蟲移入塑料杯內(nèi)徑80MM110MM,預(yù)先育有白背飛虱喜食品種如特優(yōu)63的秧苗中飼養(yǎng),11D后，每批隨機(jī)取出30頭白背飛虱高齡若蟲或成蟲，按NY/T26312014，附錄C的規(guī)定檢測白背飛虱群體帶毒情況，計(jì)算白背飛虱群體的帶毒率。44育苗方法441催芽參鑒品種（含感病對照）經(jīng)413方法浸種、催芽；選取30粒左右發(fā)芽良好的種子均勻播于盛有自然肥力土壤的塑料杯內(nèi)徑80MM110MM中。442重復(fù)按441育苗方法每品種重復(fù)3次。45接種苗齡（152）葉齡期。46接種方法選取43已飼毒且度過循回期的白背飛虱成蟲接種群體，計(jì)算接蟲數(shù)量，DBXX/XXXXXXXXX3人工接種鑒定的有效接種蟲量用IVS表示，數(shù)值以頭/苗計(jì)，按公式1計(jì)算IVSNPVS（1）式中IVS人工接種鑒定的有效接種蟲量；N接種白背飛虱數(shù)量；PVS白背飛虱帶毒率。當(dāng)IVS值處于1頭/株2頭/株范圍內(nèi)，方可認(rèn)為試驗(yàn)有效。從接種群體中隨機(jī)抽取50頭以上蟲，測定帶毒率，計(jì)算接蟲數(shù)量后接入已育有參鑒品種的塑料杯內(nèi)徑80MM110MM中，接種時間為2D，接種溫度（261），且每天上午和下午各趕蟲一次，使白背飛虱分布均勻，2D后用殺蟲劑將接種用白背飛虱全部撲殺，將秧苗移出塑料杯，至1530條件下培育，常規(guī)管理，定期觀察植株發(fā)病情況。47調(diào)查時間接種20D后進(jìn)行調(diào)查；共調(diào)查3次，每次調(diào)查間隔期不少于7D，第一次調(diào)查時同時確定有效鑒定株數(shù)。48調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)SRBSDV苗期發(fā)病癥狀秧苗葉色濃綠，葉片短小僵直，心葉扭曲，或現(xiàn)鋸齒葉；植株矮化不明顯，葉背沿葉脈有縱向不規(guī)則蠟白色瘤狀突起，后變黑褐色；植株矮小，葉色稍濃綠。出現(xiàn)或癥狀的植物直接記為病株；出現(xiàn)癥狀的植株，用DOTELISA（按NY/T26312014，附錄C的規(guī)定）或RTPCR檢測確認(rèn)（參考附錄A）。49發(fā)病率計(jì)算根據(jù)三次感病對照的最高發(fā)病率確定發(fā)病率計(jì)算方式，若三次調(diào)查中感病對照最高發(fā)病率超過30，則按三次發(fā)病調(diào)查最高病株數(shù)計(jì)算發(fā)病率；若出現(xiàn)感病對照的最高發(fā)病率小于30，則認(rèn)定本鑒定結(jié)果不可用。發(fā)病率RI表示，數(shù)值以計(jì)，按公式2計(jì)算RINI/NT100（2）式中RI發(fā)病率；NI病株數(shù)；NT總株數(shù)。計(jì)算結(jié)果精確到小數(shù)點(diǎn)后兩位。5水稻品種抗南方水稻黑條矮縮病性狀的評價51抗性分級標(biāo)準(zhǔn)抗性分級標(biāo)準(zhǔn)如下0級，發(fā)病率為0，免疫；1級，發(fā)病率為015，高抗；3級，發(fā)病率為5115，中抗；5級，發(fā)病率為15130，中感；DBXX/XXXXXXXXX47級，發(fā)病率為30160，感??；9級，發(fā)病率大于601，高感。52抗性評價當(dāng)品種抗性在不同地區(qū)間、不同年度間或批次間鑒定結(jié)果表現(xiàn)不一致時，以最差的抗性表現(xiàn)為準(zhǔn)。_DBXX/XXXXXXXXX5AA附錄A（資料性附錄）南方水稻黑條矮縮病毒檢測技術(shù)RTPCR法A1試劑除特別說明以外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純，所有試劑均用無RNA酶污染的容器，可用1DEPC（焦碳酸乙二酯）水處理后高壓滅菌并分裝。液氮可保存于液氮罐或保溫桶中TRIZOLREAGENTSRNAISOPLUS，購自寶生物工程（大連）有限公司氯仿異丙醇20預(yù)冷75酒精（DEPC水配制）DEPC水用1DEPC處理后的去離子水，用于溶解RNA瓊脂糖TRIS堿冰乙酸EDTA（05MOL/L）50TAE配方TRIS堿242G；冰乙酸571ML；EDTA（05MOL/L）100ML，定容至1000MLPRIMESCRIPTTMONESTEPRTPCRKIT一步反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司DNAMARKER3（國產(chǎn)，購于圣比奧公司）GELRED染色工作液購于INVITROGEN公司參照使用說明進(jìn)行A2儀器設(shè)備稱量天平精度等級為001G高速臺式冷凍離心機(jī)（離心速度12000R/MIN以上）冰箱（28和20兩種）微量可調(diào)移液器（10L、100L、1000L）及配套帶濾芯吸頭EPPENDORF管（15ML）研砵A3檢測引物正向引物SRBS10F5CCACATCGCGTCATCTCAAACTAC3反向引物SRBS10R5CGGTCTTACGCAACGATGAACC3A4試驗(yàn)操作A41采樣工具DBXX/XXXXXXXXX6下列采樣工具必須經(jīng)（1212），15MIN高壓滅菌并烘干剪刀，鑷子，研缽，EPPENDORF管（15ML、20ML）A42樣品采集用剪刀剪取新鮮水稻葉片或莖稈組織，放入密閉的自封袋內(nèi)（一個采樣點(diǎn)的樣品，放一個塑料袋），盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室4條件下保存待檢，存放不能超過7D。A43樣品保存新鮮樣品若需長期保存應(yīng)置于70以下，避免反復(fù)凍融（凍融不超過3次）。A44樣品處理A441取水稻組織01G，放入研缽中，倒入適量液氮，以研磨棒將樣本磨碎至粉末狀，轉(zhuǎn)移至EPPENDORF管中。A442加入1MLRNAISOPLUS，充分混勻。A443每1MLRNAISOPLUS加入02ML氯仿，蓋好管蓋，大力震蕩15S，室溫靜置5MIN；12000R/MIN，4離心15MIN。A444吸取243各管中的上清液轉(zhuǎn)移至EPPENDORF管中，切勿吸到中間層，向EPPENDORF管中加入等體積異丙醇，顛倒混勻，1530靜置10MIN。A44512000R/MIN，4離心10MIN，棄上清，加入600L75乙醇，上下顛倒洗滌。A44612000R/MIN，4離心5MIN（EPPENDORF管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），棄上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）。A4474000R/MIN離心10S（EPPENDORF管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），將管壁上的殘余液體甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個吸頭，吸頭不要碰到沉淀，室溫干燥3MIN5MIN。A448加入10L15LDEPC水，輕輕混勻，冰上保存?zhèn)溆?。提取的RNA須在2H內(nèi)進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增；若需長期保存須放置70冰箱。A45檢測A451擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行從試劑盒中取出相應(yīng)的RTPCR反應(yīng)液，,設(shè)所需RTPCR檢測總數(shù)為N，其中N為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和，每個樣品測試反應(yīng)體系配制見下表。表2每個樣品測試反應(yīng)體系試劑使用量終濃度PRIMESCRIPT1STEPENZYMEMIX2L21STEPBUFFER（DYEPLUS）25LDBXX/XXXXXXXXX7正向引物SRBS10F1L04M反向引物SRBS10R1L04MTEMPLATERNA1L3LRNASEFREEDH2O補(bǔ)充反應(yīng)體積至50LA452循環(huán)條件設(shè)置將451中離心后的PCR管放入PCR儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。循環(huán)條件設(shè)置第一階段，反轉(zhuǎn)