項目名稱： 基因組穩(wěn)定性和細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白質(zhì)群的功能及作用機制研究 首席科學家： 尹玉新 北京大學 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部門： 教育部 一、研究內(nèi)容 （ 一）擬解決的關(guān)鍵科學問題 面對我國生命和健康科學的重大需求和癌癥等重大疾病研究的挑戰(zhàn)，結(jié)合我們前期的研究基礎，本項目將圍繞遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性這一中心課題，選擇細胞周期調(diào)節(jié)的各個環(huán)節(jié)，從蛋白質(zhì)群入手解決如下關(guān)鍵科學問題： 1. 蛋白質(zhì)群在 細胞生長分裂過程中細胞周期各個階段的調(diào)控機制和相互作用。相關(guān)的信號傳導通路在 細胞增殖過程中如何維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。 細胞異常增殖過程中相關(guān)蛋白質(zhì)群的變化規(guī)律及其對細胞周期和基因組穩(wěn)定性的影響。 2. 癌基因 細胞增殖和凋亡的分子調(diào)控機制， 其中發(fā)揮的作用。 （ 二）主要研究內(nèi)容 1. 研究真核細胞 定 相互作用蛋白及闡明它們的生化功能；大規(guī)模確定新的明 定的機理以及 示檢驗點在維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性中的作用；從 S 期細胞中鑒定新的受 挑選適當?shù)墓δ芑蚧虻鞍?，在細胞水平和整體水平（動物模型）分析、驗證，且探討其機制及意義。 2. 檢測有絲分裂期間 定更多檢測 用；通過基因敲除小鼠模型和轉(zhuǎn)基因小鼠模型評價有絲分裂破壞與腫瘤發(fā)生的關(guān)系；深入探討 網(wǎng)絡。 3. 以癌癥和衰老模型為主要研究對象，對前期已鑒定出的，與癌癥發(fā)生或轉(zhuǎn)移及衰老密切相關(guān)蛋白進行生物學功能及蛋白質(zhì)糖基化修飾研究，探究其相互作用和信號轉(zhuǎn)導途徑，從蛋白質(zhì)水平上揭示腫瘤或衰老細胞增殖異常的分子機制。研究調(diào)控細胞周期 期的新蛋白 過對其所調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)群的相互作用研究，揭示其調(diào)控細胞周期和腫瘤侵襲性生長的分子機制。 4. 篩選 路上游調(diào)節(jié)蛋白及下游靶基因，探索該通路已知蛋白之間的動態(tài)互作及通路激活機制，檢測 而影響基因組穩(wěn) 定性的分子機制；探索 微管結(jié)合蛋白之間的關(guān)系， 解析上述各蛋白協(xié)同或獨立調(diào)控細胞增殖與凋亡、影響基因組穩(wěn)定性的分子機理。 二、預期目標 （一）總體目標 瞄準國家戰(zhàn)略需求和國際腫瘤相關(guān)科學研究前沿，從與遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)蛋白質(zhì)群這一關(guān)鍵科學問題出發(fā)，在細胞周期的各個環(huán)節(jié)探討相關(guān)蛋白質(zhì)群的分子調(diào)控機制以及相互作用網(wǎng)絡。在此基礎上，鑒定一批新的與細胞正常、異常增殖調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)群，建立全細胞水平的細胞周期相關(guān)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫；確定一些與維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定 性相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)群的結(jié)構(gòu)、功能、相互作用和一些重要靶蛋白的動態(tài)調(diào)控機制，并研究它們的信號調(diào)控網(wǎng)絡。此外，還將探索一些與細胞周期失調(diào)后決定細胞命運的信號通路調(diào)控細胞增殖和凋亡的分子機制。通過本課題的實施將使我國在細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白研究的相關(guān)領(lǐng)域達到或領(lǐng)先國際水平。同時，以本項目的實施為契機 , 促進蛋白質(zhì)組學、生物學、醫(yī)學、生物信息學等多學科研究的銜接和集成，培養(yǎng)一批交叉學科新型研究隊伍。 （二）五年目標 1. 確定 規(guī)模確定新的 闡明 示檢驗點在維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性中的作用。鑒定 期細胞中新的受 2. 評價 定更多與有絲分裂調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)群。揭示抑癌基因 臨床診斷和化療提供理論基礎。 3. 揭示蛋白質(zhì)群在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移及衰老中的生物學功能，著重研究調(diào)控細胞周期的新蛋白 過對其所調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)群的研究，揭示其調(diào)控細胞周期的分子機制。通過穩(wěn)定同位素標記建立細胞核蛋白質(zhì)動態(tài)表達分析鑒定的實驗方法，并由此獲得新的標志蛋白；針對所發(fā)現(xiàn)的新的相互作用蛋白，驗證其與靶蛋白的相互關(guān)系并確定其生物功能并鑒定出關(guān)鍵核蛋白質(zhì)修飾類型與可用于新藥開發(fā)的重要靶標，并探討其在腫瘤治療、延緩衰老和保護細胞方面應用的可能性。 4. 闡明 定新的靶蛋白及其在定 示 心分子對基因組穩(wěn)定性的調(diào)控機制； 分析 探討 管結(jié)合蛋白質(zhì)群 的關(guān)系及其 在調(diào)控細胞分裂和誘發(fā)凋亡中的作用 。 5. 取得具有國際影響的原創(chuàng)性成果，在國際重要學術(shù)刊物上發(fā)表高水平論文 50篇以上。其中，在影響因子大于 10的刊物發(fā)表 15養(yǎng)一批從事腫瘤基礎研究和轉(zhuǎn)化醫(yī)學的交叉學科人才。 三、研究方案 （一）總體研究思路、技術(shù)路線及可行性分析 1. 總體研究思路 在細胞增殖過程中遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性有賴于細胞周期的系統(tǒng)調(diào)節(jié)， 復制和 白質(zhì)群在此過程中的相互作用使細胞周期的精密調(diào)控成為可能。 機體通過細胞周期調(diào)控維持基因組穩(wěn)定性，這一過程是經(jīng)由細胞周期的各個環(huán)節(jié)實現(xiàn)的。細胞周期分為 S、 期，研究細胞周期的調(diào)控應該分解到細胞周期自然過程的各個環(huán)節(jié)中。細胞周期調(diào)控的正常進行以及遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性與腫瘤的發(fā)生以及衰老等生命重大事件密切相關(guān)。因此，鑒定參與調(diào)控細胞周期各個環(huán)節(jié)的蛋白質(zhì)群并且評價這些蛋白質(zhì)群在調(diào)控細胞周期的各個階段、維持基因組穩(wěn)定性中所發(fā)揮的作用機制以及蛋白質(zhì)群之間的相互作用對于癌癥等重大疾病研究 至關(guān)重要。對我們認識與了解這些疾病發(fā)生的機理，有效防治這些疾病具有重大意義。 基于以上思路，本課題重點圍繞細胞周期的各個環(huán)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)群開展研究，闡明這些蛋白質(zhì)群在細胞周期各個時期： 成、有絲分裂期的調(diào)控機制。評價蛋白質(zhì)群對于細胞周期調(diào)控正常進行，維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性中的作用。在此基礎上，我們將利用一個大型高通量蛋白質(zhì)分析平臺，大規(guī)模鑒定和分析與細胞周期調(diào)控和維持基因組穩(wěn)定性相關(guān)的蛋白質(zhì)群， 探究其相互作用蛋白和信號轉(zhuǎn)導途徑。 此外，我們還將研究多細胞生物如何處理細胞周期失調(diào)而發(fā)生遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定的情況 下而對細胞命運進行調(diào)節(jié)，探討細胞生存、死亡與遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的綜合關(guān)系，即在細胞周期失調(diào)、基因組不穩(wěn)定的情況下通過何種機制調(diào)控細胞命運，對細胞生存和死亡進行決斷。這將不僅闡釋機體清除癌細胞的機制，還將為癌癥治療提供更多的靶向藥物選擇。 細胞生長和 制相 關(guān) 蛋白 質(zhì) 群課題 1有 絲分裂 和 復相 關(guān) 蛋白 質(zhì) 群課題 2細胞 異 常增殖相 關(guān) 蛋白 質(zhì) 群課題 3調(diào)節(jié) 細胞 增殖 和凋亡蛋白 質(zhì) 群課題 4細胞生長和 復 制相 關(guān) 蛋白 質(zhì) 群課題細胞生長和 復 制相 關(guān) 蛋白 質(zhì) 群課題課題有 絲分裂 和 修 復相 關(guān) 蛋白 質(zhì) 群課題有 絲分裂 和 修 復相 關(guān) 蛋白 質(zhì) 群課題課題細胞 異 常增殖相 關(guān) 蛋白 質(zhì) 群課題細胞 異 常增殖相 關(guān) 蛋白 質(zhì) 群課題課題調(diào)節(jié) 細胞 增殖 和凋亡蛋白 質(zhì) 群課題調(diào)節(jié) 細胞 增殖 和凋亡蛋白 質(zhì) 群課題課題附圖：主要技術(shù)途徑流程圖 2. 技術(shù)路線 根據(jù)我們的學術(shù)思路，本項目的總體研究技術(shù)途徑如附圖所示。研究細胞周期的各個時期相關(guān)蛋白質(zhì)群的結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控機制和相互作用，并且闡述細胞正常增殖過程中遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的維持。還將研 究細胞異常增殖中蛋白質(zhì)群的變化和細胞凋亡的程序控制。主要途徑為：【課題一】 用遺傳的方法篩選 接從細胞內(nèi)分離 蛋白親和層析的方法分離 用生化，遺傳及熒光單分子技術(shù)闡明一些已知及一些新確定的 明 基因干擾技術(shù)（ 示該通路相關(guān)的檢驗點在維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性中的作用。采用基因表達譜芯片或蛋白組學的方法，與課題二和課題三合作，篩選受 定 期細胞中新的受 課題二】確定 用基因芯片技術(shù)鑒定出新的 采用染色質(zhì) 法確定 用蛋白質(zhì) 通過傳統(tǒng)的蛋白 質(zhì) 定向誘變、熒光素酶 分析等方法 檢測 用，利用課題組三的蛋白質(zhì)分析平臺鑒定 過建立小鼠動物模型從活體角度綜合評價 持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的重要性。最后利用這一動物模型揭示抑癌基因 課題三】 以癌癥和衰老模型為主要研究對象， 探討在細胞異常增殖過程中相關(guān)蛋白質(zhì) 群，如 變化規(guī)律。通過對目的基因進行表達干預（過表達或沉默），從體外到體內(nèi)深入研究候選蛋白質(zhì)群對細胞增殖、細胞周期調(diào)控的影響。結(jié)合信號通路的特異性抑制藥物等分析目的基因表達干預后導致的新差異蛋白及所涉及的信號通路。采用 用穩(wěn)定同位素標記并結(jié)合高靈敏度的生物質(zhì)譜鑒定技術(shù)，研究細胞核蛋白質(zhì)和 飾位點，闡明其信號轉(zhuǎn)導機制及其在衰老過程中的功能。 采用 在體鑒定快速腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的實驗系統(tǒng)，提高甄 別在細胞周期中調(diào)控異常增殖蛋白質(zhì)群的效率。選擇調(diào)控細胞異常增殖的代表性新蛋白，建立其與腫瘤病人的相關(guān)性?！菊n題四】研究 示 析 全基因組水平上通過干擾基因的表達（ 選 結(jié)合微陣列分析鑒定 過上位分析（ 過質(zhì)譜分析鑒定蛋白修飾，特別是磷酸化修飾調(diào)控 統(tǒng)分析 析 胞增殖以及基因組穩(wěn)定性之間的關(guān)系；通過蛋白共定位研究探討 而探討多細胞生物在細胞周期失調(diào)而發(fā)生遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定的情況下如何對細胞命運進行調(diào)節(jié) 。各課題組還將充分利用課題組三具備的大型蛋白質(zhì)鑒定分析技術(shù)平臺對 更多參與維持基因組穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)群進行大 規(guī)模鑒定和分析。 3. 可行性分析 (1) 本項目的科研隊伍以從事生物化學、分子生物學、細胞生物學、蛋白質(zhì)組學、生物信息學等國家和部門重點實驗室、教育部 985創(chuàng)新平臺為主體，集中了目前從事基因組穩(wěn)定性和細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白質(zhì)群研究的優(yōu)勢科研團隊。其中，各課題負責人都是本領(lǐng)域的專家，親自設計各自的課題并將指導項目的具體實施。 (2) 本項目著眼于大規(guī)模蛋白質(zhì)組（群）而非單個蛋白的研究。 2007年 10月召開的國際蛋白質(zhì)組學組織大會標志著從大規(guī)模技術(shù)性研究向差異和動態(tài)組學研究的趨勢。但迄今已有的技術(shù)幾乎都限于檢測 和比較蛋白的累積量。課題三近期自主建立的 術(shù)對蛋白真正表達水平差異的測定提供了更敏感和更精密的手段，并且保持了高通量的能力。另一方面利用穩(wěn)定同位素同時摻入細胞核蛋白質(zhì)和 些新技術(shù)方法都是針對細胞調(diào)控中的蛋白質(zhì)組（群）動態(tài)研究而開發(fā)的。本研究具備扎實的前期研究工作基礎和創(chuàng)新技術(shù)平臺，以及用于功能研究的基因敲除動物模型和高精確度的質(zhì)譜分析鑒定蛋白質(zhì)動態(tài)表達和蛋白質(zhì)修飾平臺。良好的工作基礎和強大的蛋白質(zhì)組學技術(shù)平臺為本課題研究計劃的順利 進行提供了有力的保障。 (3) 參加本項目研究的各實驗室具備優(yōu)良的研究條件。同時，各課題間早已經(jīng)形成了緊密的協(xié)作關(guān)系，各方面的研究相互交叉、組成了一個有機的整體。 課題二中建立的基因敲除小鼠模型以及轉(zhuǎn)基因小鼠模型在國際上也具有領(lǐng)先地位，為其他課題順利實施提供了珍貴的活體動物模型。課題三的高通量蛋白質(zhì)鑒定和分析平臺為其他各個課題組的研究分析提供了可靠、高效的技術(shù)平臺。 （二）創(chuàng)新點 1. 本項目瞄準國際前沿，面向國家需求，綜合利用多學科優(yōu)勢，集中針對遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)蛋白質(zhì)群的分子調(diào)控網(wǎng)絡和相互作用，展開多層 面更又互相關(guān)聯(lián)的研究。 2. 本項目將細胞周期的各個時期有機地整合在一起，通過研究各個環(huán)節(jié)相關(guān)的蛋白質(zhì)群及其調(diào)控和相互作用機理而探討這些蛋白質(zhì)群對細胞周期調(diào)控的分子機制，評價其作為有機整體和分子網(wǎng)絡對遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的相關(guān)性，在此基礎上大規(guī)模鑒定和分析與細胞周期調(diào)控相關(guān)的各種蛋白質(zhì)群，并探索這些蛋白質(zhì)群之間的相互作用，構(gòu)建與細胞周期調(diào)控和基因組穩(wěn)定性維持相關(guān)的蛋白質(zhì)組分子調(diào)控網(wǎng)絡。此外，還進一步研究當細胞周期失調(diào)發(fā)生遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定后，多細胞生物作為有機整體利用何種機制對細胞命運進行決斷，從而綜合性評價細胞周期 調(diào)控與基因組穩(wěn)定性的內(nèi)在聯(lián)系和相關(guān)蛋白質(zhì)群的功能和相互作用。 3. 本項目 在研究內(nèi)容方面具有完全創(chuàng)新性： 孔道春實驗室在裂殖酵母 S. 們證明 鐵邦教授在細胞周期和 現(xiàn)了一條新的調(diào)控通路（ 該通路在 1玉新課題組研究設想 這種調(diào)節(jié)在國際上也是全新發(fā)現(xiàn)。 張宏權(quán)課題組發(fā)現(xiàn)跨膜 受體整合素結(jié)合蛋白 絲分裂 中期（ 必須的，并證明這一作用是通過一個全新的 肖雪媛和紀建國課題組以腫瘤和衰老為實驗模型，研究新發(fā)現(xiàn)的與細胞增殖異常相關(guān)蛋白的生物學功能及組蛋白修飾變化規(guī)律。而以此為基礎構(gòu)建靶蛋白表達干預后的交替多輪差異蛋白篩選策略。 4. 本項目在研究方法方面也具有獨到之處，在國際上處于領(lǐng)先水平。 尹玉新課題組 在多年的研究基礎上，發(fā)展了一系列體內(nèi)、體外活體研究模型，例如小鼠基因敲除模型系統(tǒng)：他們已經(jīng)成功敲除 且建立了一系列 過這些模型檢測 究 這些作用可與特定小鼠模型的腫瘤發(fā)生直接關(guān)聯(lián)，從而更加直觀地評價 外，他們正在建立轉(zhuǎn)基因小鼠模型預測某些重要蛋白過度表達是否可促進腫瘤發(fā)生。 張宏權(quán)課題組首次在斑馬魚 模型中建立了在 3 7天內(nèi)在體鑒定腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的實驗系統(tǒng)，為增殖異常的腫瘤細胞進行大規(guī)模體內(nèi)評價提供了快速、經(jīng)濟和方便 的最新方法。 肖雪媛課題組則首次提出使穩(wěn)定同位素同時摻入細胞核蛋白質(zhì)和 而可以快速、定量鑒定表觀遺傳修飾的動態(tài)變化，這將有助于組蛋白修飾密碼及其作用機制的確定。 （三）課題設置 課題一： 真核細胞 研究目標： 本課題將研究真核細胞 定 定人細胞的 規(guī)模確定新的 明 明 示檢驗點在維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性中的作用。闡明 示檢驗點在維持復制叉穩(wěn)定的作用；鑒定 研究內(nèi)容： 1. 確定 采用下面三種方法確定 是用遺傳的方法篩選 是直接從細胞內(nèi)分離 是用蛋白親和層析的方法分離 2. 確定新的 在裂殖酵母 S. 果另一個復制蛋白由于突變使得它的活性降低，該蛋白就能拮抗 該方法已經(jīng)篩選到了幾百個突變株，現(xiàn)正確定它們的突變基因，并進一步與課題組三合作，利用高通量蛋白質(zhì)鑒定分析平臺研究新的 3 闡明 已發(fā)現(xiàn) 也發(fā)現(xiàn) 暗示 用生化和遺傳的方法確定該蛋白，并最終闡明 4 鑒定新的 其機理和調(diào)控機制 本課題組最近發(fā)現(xiàn)，在 期的調(diào)控中也起重要作用。將用 基因表達譜芯片或蛋白組學的方法， 鑒定新的 受 挑選適當?shù)墓δ芑蚧虻鞍?，在細胞水平和整體水平（動物模型）進行分析、驗證，并探討其作 用機制及意義。同時，本課題組還發(fā)現(xiàn) 而調(diào)控有絲分裂的過程 。本課題擬鑒定 被 討 承擔單位：中山大學、北京大學 課題負責人：康鐵邦， 特聘教授， 42歲 , 中山大學腫瘤防治中心 學術(shù)骨干：孔道春、張麗君等 預算經(jīng)費： 課題二： 研究目標： 本課題旨在探討 首先了解 后研究 三建立活體動物模型以評價 后揭示 研究內(nèi)容： 1. 檢測有絲分裂期間 示著絲粒中 體外和體內(nèi)的 絲粒 察 色體錯排和分離錯誤，以及恢復著絲粒功能和關(guān)卡應答。 利用基因芯片技術(shù)鑒定出新的 采用染色質(zhì) 法確定 2. 鑒定與 我們已建立了成熟的蛋白質(zhì) 且成功地發(fā)掘出與有絲分裂相關(guān)的蛋白激酶，如 課題將利用這一成熟的系統(tǒng)通過標記 有絲分裂相關(guān)的蛋白質(zhì)群。通過傳統(tǒng)的蛋白質(zhì) 定向誘變、熒光素酶 分析等方法 檢測 用并且利用課題組三的蛋白質(zhì)分析平臺鑒定 3. 建立 評價 前期研究中已成功地建立了條件性 些 利用這些模型評價 絲分裂及其維持基 因組穩(wěn)定性的作用，并且衡量基因組不穩(wěn)定性與腫瘤發(fā)生的因果關(guān)系。 4. 揭示 課題組的前期研究結(jié)果顯示： 失去 致自發(fā)性細胞死亡。我們將利用已建立的組織特異性 此評價抑癌基因之間的分子網(wǎng)絡聯(lián)系及對化療藥物敏感性的影響，為臨床化療、藥物的篩選提供理論依據(jù)。 承擔單位：北京大學、中山大學 課題負責人： 尹玉新，教授， 49歲 , 北京大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院 學術(shù)骨干： 張輝等 預算經(jīng)費： 課題三： 細胞增殖異常模型中的相關(guān)蛋白質(zhì)群及其調(diào)控網(wǎng)絡研究 研究目標： 本課題以腫瘤和衰老模型為主要研究對象，對前期已鑒定出的，與癌癥發(fā)生或轉(zhuǎn)移及衰老密切相關(guān)蛋白進行生物學功能的研究，鑒定新的參與細胞周期 期的蛋白并研究其在細胞異常增殖過程中的作用。從蛋白質(zhì)群調(diào)控網(wǎng)絡水平上揭示細胞增殖調(diào)控失常的分子機制。 研究內(nèi)容： 1、對已初步選定的一些與異常增殖特異相關(guān)的關(guān)鍵蛋白， 如 和 用基因干擾技術(shù)和 課題二中所建立的轉(zhuǎn)基因小鼠和 條件性基因敲除 等平臺，從體外培養(yǎng)細胞到體內(nèi)動物模型驗證并研究其在腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移以及衰老過程中的生物功能及其變化規(guī)律。 2、利用 選鑒定腫瘤或衰老相關(guān)蛋白的相互作用蛋白及其在干預靶蛋白情況下的動態(tài)變化規(guī)律。結(jié)合信號通路特異性抑制劑等手段探索和確定其所參與的信號轉(zhuǎn)導通路，特別是與 路的關(guān)系。闡明其導致調(diào)控異常的分子機制。 3、利用前期研究所建立的體內(nèi)快速檢驗異常增殖的與腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)群的斑馬魚 技 術(shù)平臺 ，鑒定出調(diào)控腫瘤細胞異常增殖的重要蛋白質(zhì)群，并在臨床病人中建立相關(guān)性驗證，以明確其在腫瘤診斷、預防和治療中的意義，以及作為潛在藥物靶標的可能性。 4、進一步改進和優(yōu)化已初步建立的，可對組蛋白基因調(diào)控區(qū)的甲基化等修飾及修飾位點進行系統(tǒng)性定量鑒定的新技術(shù)，進而探索特殊修飾在細胞增殖調(diào)控異常中的作用。力求發(fā)現(xiàn)和鑒定個關(guān)鍵核蛋白質(zhì)修飾類型及有可能用于新藥開發(fā)的重要靶標。 承擔單位：北京師范大學、北京大學 課題負責人：張宏權(quán)，教授， 46歲，北京大學 學術(shù)骨干：肖雪媛、紀建國等 預算經(jīng)費： 課題四： 調(diào)控細胞增殖與細胞凋亡的分子機制研究 研究目標： 本課題將主要研究 析微 研究內(nèi)容： 1、 過上位分析（ 過質(zhì)譜分析鑒定 別是激酶 2、鑒定新的靶蛋白。利用已有的 過 定新的 通過上位分析（ 定其在 3、鑒定 課題組三合作，利用高通量蛋白質(zhì)分析平臺和已制備的 過小分子定新的 別是上游調(diào)控分子并分析其功能，分析通路的激活機制。 4、系統(tǒng)分析 速離心分離細胞組分，確定 胞質(zhì)、細胞核以及細胞器的定位；在細胞整體水平上觀察通路蛋白的定位與轉(zhuǎn)位，分析引起蛋白轉(zhuǎn)位的因素與意義； 可以調(diào)控中心體的復制與染色體的分離，從而影響基因組的穩(wěn)定性。我們將與課題組二合作，探討三者之間的相互關(guān)系，為 5、探索 析上述各蛋白協(xié)同或獨立調(diào)控細胞增殖與凋亡的分子機理 。 承擔單位：南開大學 課題負責人： 吳世安 ，教授， 40歲， 南開大學生命科學學院特聘教授 學術(shù)骨干：周軍、朱玉山等 預算經(jīng)費： （四）各課題間的相互關(guān)系，以及與項目總體目標和五年目標的關(guān)系 根據(jù)總體目標的要求，本項目的中心思想是維持細胞增殖與分裂過程中遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性，而這一穩(wěn)定性的維持有賴于細胞周期的精細調(diào)節(jié)，在此過程中不同蛋白組群相互作用、相互影響和相互調(diào)節(jié)。本課題組將根據(jù)這個原則進行分解、設計，了解與探索在細胞周期各個階段蛋白質(zhì)活動的規(guī)律 ，探索信息傳導在細胞周期調(diào)節(jié)過程中的重要作用，評價細胞生存和死亡調(diào)控機制的價值。各個項目圍繞細胞周期的不同階段或不同檢驗點，選擇特定的研究渠道進行機制研究和探索。各個課題之間相互聯(lián)系、互相促進，旨在實現(xiàn)本項目的總體目標，即從與遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)蛋白質(zhì)群這一關(guān)鍵科學問題出發(fā)，在細胞周期的各個環(huán)節(jié)探討相關(guān)蛋白質(zhì)群的分子調(diào)控機制以及相互作用網(wǎng)絡。 本項目五年目標的完成則具體表現(xiàn)在以上所述四個課題的研究計劃中：課題一、著重研究 時研究 作用 ；課題二、了解有絲分裂過程中 將進一步探討 上兩個課題主要探討細胞正常生長分裂過程中的兩個重要事件： 題三則利用現(xiàn)有的蛋白質(zhì)分析技術(shù)平臺來對細胞異常增殖中涉及的各種蛋白質(zhì)群進行系統(tǒng)的大規(guī)模的鑒定和分析，以達到全面理解細胞周期調(diào)節(jié)中各個系統(tǒng)蛋白質(zhì)相互作用的機制和形式。此外，細胞周期的完善與精細調(diào)節(jié)體現(xiàn)在遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的保持。如果細胞周期不能進行正確調(diào)節(jié)，多細胞系統(tǒng)將通過信號傳遞及 細胞生長調(diào)控來實現(xiàn)細胞的存亡。課題四將研究不同細胞信號通路如何對細胞的生存和死亡進行精細調(diào)控。因而，以上四個課題相互關(guān)聯(lián)，層次遞進，從作為中心的遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性，到細胞周期各階段的精確調(diào)節(jié)，到細胞周期失調(diào)導致細胞異常增殖，再到異常增殖導致的細胞信號通路的改變對細胞生物學功能的影響。這些從細胞周期衍生出來的變化，讓細胞必須做出抉擇：生或死；正常增殖或發(fā)生腫瘤。 課題組間在技術(shù)平臺層面還存在廣泛的聯(lián)系和互助。課題一的高精度蛋白分離技術(shù)將會用于所有課題所面臨的蛋白質(zhì)純化和分析的需求；課題二的基因敲除小鼠模型系統(tǒng)和課 題三的斑馬魚腫瘤轉(zhuǎn)移模型系統(tǒng)可為其它課題組提供珍貴的活體動物模型，同時課題三建立的快速鑒定調(diào)控細胞異常增殖蛋白質(zhì)群的動物在體技術(shù)平臺，將大大加速對四個課題研究的與遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)蛋白質(zhì)群的功能研究，并結(jié)合不同信號通路的在體研究，有助于快速揭示這些蛋白質(zhì)群的作用機制；課題四的果蠅細胞快速增殖模型和轉(zhuǎn)基因小鼠模型可用于測試各個課題組鑒定出的新的蛋白質(zhì)群的功能。 四、年度計劃 第一年： 研究內(nèi)容 1. 篩選與 互作用的蛋白，并且大規(guī)模鑒定和 制有關(guān)的蛋白。 2. 建立穩(wěn)定高表達 3. 確定 便最大限度地純化出 4. 基因芯片法篩選出差異基因群，該基因群可能在轉(zhuǎn)錄水平直接或間接受 5. 著手研究 其意義。 6. 創(chuàng)建一系列 使其在結(jié)構(gòu)上具有 這些 體轉(zhuǎn)染 + 胞。對細胞周期中不同時期的細胞進行分析以獲得 7. 在含有野生型 系中對動粒功能進行分析。 8. 建立 除 統(tǒng)和 導表達系統(tǒng)。通過 9. 通過基因表達干預等方法從體內(nèi)外系統(tǒng)研究與肺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)蛋白 10. 建立神經(jīng)細胞衰老和衰老模型，制備不同發(fā)育或分化階段的樣品材料，進行亞細胞器分級實驗，提取關(guān)鍵蛋白質(zhì)組分。 11. 在 并在腫瘤病人標本上建立相關(guān)性。 12. 利用微陣列方法鑒定 13. 合成雙鏈 建果蠅 14. 完成 路主要已知組成蛋白如 及微管結(jié)合蛋白蛋白 析上述蛋白的細胞內(nèi)定位、共定位與轉(zhuǎn)位情況。 15. 分析微管結(jié)合蛋白對細胞周期進程的影響，檢測微管結(jié)合蛋白在腫瘤和對照組織中表達水平的變化及其表達對反映細胞生長或死亡的克隆形成率的影響，并通過 析微管結(jié)合蛋白表達對細胞增殖的 影響。 16. 制備并純化 預期目標 1. 質(zhì)譜確定和 互作用的候選蛋白。篩選得到一些和 互作用的蛋白。篩選得到 100個突變株。并開始突變株的形態(tài)分析、開始突變株突變基因的確定。 2. 分別得到 3株以上穩(wěn)定高表達 3. 初步確定 4. 篩選出干擾 5. 確定 步確定 6. 揭示動粒中 7. 確定 集和集合障礙，動粒 8. 完成不同 定 9. 確認 或發(fā)展中的生物學作用。 10. 獲得不同發(fā)育和衰老階段的亞細胞器樣品。 11. 選擇 2 調(diào)的與腫瘤增殖和侵襲有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，闡明其調(diào)控機制。 12. 得到 量表達后靶蛋白表達增加與減少的順序列表，分析得到 3候選蛋白用于進一步分析。 13. 完成約 5， 000個果蠅基因雙鏈 14. 獲得 定位和轉(zhuǎn)位情況，完成對 15. 獲得微管結(jié)合蛋白對參與調(diào)控細胞增殖與凋亡機制的了解。 16. 得到 第二年： 研究內(nèi)容 1. 用體外生化方法，驗證和 手開展這些蛋白基因的突變株的篩選。開始篩選人細胞的 2. 對第一年篩選的突變株進行形態(tài)分析，確定突變株的突變基因。 列對比分析這些基因表達的蛋白及可能的功能域。 3. 體外驗證和 互作用的蛋白。 研究 路的中間蛋白。著手開始篩選這些蛋白的突變株并開始功能分析。 4. 利用生物信息學找出其中與細胞周期、 5. 利用 用 6. 以 規(guī)模純化 胞系與對照 胞系裂解蛋白， 及生物信息學鑒定出差異蛋白群。 7. 深入探討 8. 將 過免疫熒光法和活細胞成像對上述細胞中的染色體排列和分離進行監(jiān)測。 9. 采用 略從人類乳癌 胞中分離純化在核內(nèi)與 所得蛋白進行質(zhì)譜分析后 搜索蛋白數(shù)據(jù)庫進行鑒定。 10. 采用染色質(zhì)免疫共沉淀法（ 測 動子 理上的關(guān)聯(lián)。熒光素酶分析法檢測 動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。進行 指紋圖譜分析，通過核心指紋圖譜系統(tǒng)精確限定 動子的結(jié)合區(qū)域。在 動子區(qū)域構(gòu)建一系列的缺失來縮小 合的最小的必需序列。 11. 在第一年工作的基礎上，采用 100對獲得的候選蛋白進行質(zhì)譜鑒定。通過免疫共沉淀等方法對其中感興趣的候選蛋白進行驗證。 12. 對不同階段細胞進行穩(wěn)定同位素定量標記研究，收集研究材料進行亞細胞器分級，初步分析標記效率和蛋白質(zhì)表達情況，利用質(zhì)譜鑒定部分蛋白質(zhì)。 13. 通過免疫共沉淀并結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)新的 互作用蛋白質(zhì)、制備抗體 ，揭示 14. 通過免疫組化分析的方法在體內(nèi)驗證 路調(diào)控新靶蛋白的表達并確定其參與的生物學過程。 15. 合成雙鏈 建果蠅 16. 利用果蠅 過 預期目標 課題一： 1. 確定和 到 1或 2個和 到和人細胞 2. 完成突變株的形態(tài)分析。 完成突變株的突變基因的確定。 完成序列對比分析及蛋白功能域的確定。 3. 確定 除它們的基因。完成突變株的形態(tài)分析。 4. 驗證出 3 5. 6. 確定 7. 確定在 陷型細胞中過度表達 否能校正染色體錯排和分離錯誤，以及恢復動粒功能和檢驗點應答。 8. 分離純化若干個與 互作用的有絲分裂相關(guān)蛋白，并查詢其基本生物功能。 9. 確 定 10. 獲得若干個 其中一些蛋白將申請專利。 11. 將穩(wěn)定同位素標記進入細胞各亞細胞器，獲得蛋白質(zhì)的動態(tài)表達數(shù)據(jù)。 12. 獲得 13. 確定 3 14. 完成另外約 5， 000個果蠅基因雙鏈 15. 完成 析選擇 3 16. 培養(yǎng)研究生 8名， 培養(yǎng)博士后 4名 。 發(fā)表 0的論文 4篇， 的論文 16篇。申請專利 4項。 第三年： 研究內(nèi)容 課題一： 1. 開始 證和人細胞 2. 研究這些蛋白在細胞生長過程中的動態(tài)變化。研究它們是否是 制必需的蛋白。研究它們是作用于 3. 著手開展研究 互作用蛋白在維持 制叉穩(wěn)定性中的作用。 4. 研究 3因芯片篩選的個蛋白在翻譯水平上受 控的方式及其機理（直接調(diào)控還是間接調(diào)控）。 5. 評價該 3 對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用。 6. 細胞水平驗證 疫共沉淀實驗、 7. 從 + 轉(zhuǎn)錄為 用生物素標記探針對芯片進行雜交。比較整體基因表達譜與 8. 采用細菌表達的蛋白（ 行體外 立 該細胞系中，或瞬時轉(zhuǎn)染 及 9. 構(gòu)建含有 酸酶活性失活的哺乳動物表達質(zhì)粒，檢測 產(chǎn)生是否依賴于 時檢測存在或缺失 用免疫沉淀（ 測 10. 采用免疫共沉淀等方法對候選的相互作用蛋白進行驗證，從中選取 1感興趣蛋白或是功能未知蛋白，通過基因轉(zhuǎn)染等方法對其進行生物學功能分析。 11. 利用多種質(zhì)譜系統(tǒng)如 S 和 定不同衰老階段的蛋白質(zhì)動態(tài)表達和修飾，鑒定修飾位點和修飾類型，進行氧化修飾和組蛋白質(zhì)及和蛋白質(zhì)修飾分析。 12. 通過蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)，結(jié)合使用抑制劑和細胞實時圖像技術(shù)，揭示 13. 路候選調(diào)控蛋白體內(nèi)外功能分析。構(gòu)建候選蛋白轉(zhuǎn)基因和敲基因動物模型，觀察其表型特點；利用免疫共沉淀等方法確定候選蛋白與 路已知蛋白之間的相互作用。 14. 通過細胞共轉(zhuǎn)染、蛋白分離純化和質(zhì)譜分析鑒定 建關(guān)鍵位點 突變的轉(zhuǎn)基因和敲入（ 蠅模型，分析磷酸化位點的功能。 15. 分析 號通路主要蛋白與線粒體功能的相互關(guān)系，如 路蛋白與線粒體蛋白的共定位情況、 路對線粒體功能的影響、線粒體對 16. 整理分析數(shù)據(jù)，撰寫論文。 預期目標 1. 確定 互作用蛋白是否在 制起始中起必需作用。 驗證和確定人細胞 人細胞 2. 確定這些和 3. 確定 4. 初步闡明 5 5. 初步闡明 3對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用。 6. 驗證出 3 7. 完成基因芯片篩選分析，鑒定出若干由 8. 驗證第二年通過分離純化鑒定的若干 關(guān)蛋白與 相互作用是否為直接的。 9. 完成 定 10. 初步探究 或發(fā)展的分子機理。 11. 獲得細胞核蛋白質(zhì)動態(tài)修飾、修飾類型、修飾位點信息，為進一步功能分析打下基礎。 12. 闡明 13. 得到 3選調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)基因與敲基因果