項目名稱： 胚胎發(fā)育的核小體重排和染色質(zhì)重塑 首席科學家： 江賜忠 同濟大學 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部門： 教育部 上海市科委 一、研究內(nèi)容 從受精卵到胚胎的發(fā)育過程是一個非常復雜的生理過程，要求基因在時空上的精確轉(zhuǎn)錄表達。而核小體作為染色質(zhì)的最基本結構，通過屏蔽和開 放 調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。前人研究已經(jīng)表明在胚胎發(fā)育過程中，染色質(zhì)結構發(fā)生了巨大的變化。但是，還不清楚胚胎發(fā)育、胚胎干細胞分化、以及成熟體細胞逆分化為多能干細胞（ 胞）的過程中核小體定位、染 色質(zhì)結構發(fā)生了什么樣的變化？以及這些變化對胚胎發(fā)育、干細胞分化、 胞多能性獲得等具有怎樣的決定作用？這些變化的分子機制是什么？（構成核小體的）組蛋白修飾和基化在核小體重排和染色質(zhì)重塑中的作用及機制如何？以上這些都是本項目的關鍵科學問題。 針對上述科學問題，本項目包括以下主要研究內(nèi)容 : 1. 從胚胎發(fā)育、體細胞重編程、干細胞分化三個方向研究核小體重排和染色質(zhì)重塑。具體來說 : 1) 在胚胎水平上 , 以果蠅為模式生物 , 在典型的兩個發(fā)育時間點 , 分別繪制果蠅胚胎高分辨率全基因組核小體圖譜，再 比較核小體定位和染色質(zhì)結構的變化 ; 類似地，分析比較野生型和突變體中核小體定位和染色質(zhì)結構的變化 ;揭示核小體定位和染色質(zhì)結構變化的本質(zhì)規(guī)律。以期闡明核小體定位和染色質(zhì)結構在維護胚胎正常發(fā)育中的作用和分子機制。并建立一套穩(wěn)定適用于多物種的高分辨率全基因組核小體圖譜的高效繪制方法。 2) 分別繪制胚胎干細胞和 胞多能性誘導后的高分辨率全基因組核小體圖譜，通過比較核小體定位和染色質(zhì)結構的異同 , 可以揭示核小體定位和染色質(zhì)重塑對這兩種不同細胞維持多能性中的作用機制，這為理解干細胞分化、 胞多能性獲得具 有重要意義。同時分析特定組蛋白修飾對核小體定位的影響， 鑒定發(fā)現(xiàn)與體細胞重編程有關的因子，研究該因子對組蛋白特異性修飾與核小體定位的影響。 2. 影響核小體重排和染色質(zhì)重塑的因素很多 , 其中 基化和組蛋白修飾是重要的兩個。利用模式蛋白 究 基化和組蛋白甲基化之間的互動關系 , 以及二者對核小體定位和染色質(zhì)重塑的調(diào)控機制。再以經(jīng)基因剔除處理過的小鼠胚胎干細胞為材料 , 進一步研究 基化、組蛋白甲基化和核小體重排對干細胞分化的作用。 3. 基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑因子的作用 、核小體重排和染色質(zhì)重塑是個復雜的調(diào)控網(wǎng)絡。因此，本項目還將從表觀遺傳組學的角度上宏觀分析這一調(diào)控網(wǎng)絡 : 整合基因組學、比較基因組學和細胞信號轉(zhuǎn)導通路數(shù)據(jù)，構建表觀遺傳組學數(shù)據(jù)中心；建立表觀遺傳組學分析平臺；系統(tǒng)研究核小體重排、組蛋白修飾與轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用。另外 , 本項目涉及高通量數(shù)據(jù)的處理 , 我們將開發(fā)相應高通量鑒定組蛋白修飾差異和核小體定位變化的分析工具。 二、預期目標 總體目標： 本項目以模式動物胚胎發(fā)育和細胞分化過程中核小體重排和染色質(zhì)重塑為基本問題，整合國內(nèi)優(yōu)秀團隊，利用當前最先進的研究手 段和技術，從分子生物學、發(fā)育學和基因組學等方向上進行研究。 具體來說是， 闡明果蠅胚胎發(fā) 育、體細胞重編程和干細胞分化中核小體分布和染色質(zhì)結構的 變化規(guī)律，組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑因子對核小體重排和染色質(zhì)重塑的作用機制。以期 揭示核小體重排和染色質(zhì)重塑在維護胚胎正常發(fā)育中的作用和分子機理，以及在 體細胞重編程中的作用 ；同時開發(fā)高 通量分析方法，建立表觀遺傳組學數(shù)據(jù)中心和分析平臺，進一步闡明核小體重排和組蛋白修飾在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡中的重要作用。通過本項目的結題，將獲得一批有自主知識產(chǎn)權的重要成果，提高國家科研實力，為解決不斷 上升的由發(fā)育異常導致的缺陷新生兒以及預防、診斷和治療其它與 表觀調(diào)控 異常關聯(lián)的疾病提供理論依據(jù)，并提高 胞誘導效率，為加快 胞在組織移植和器官移植中的臨床應用打下技術基礎。 五年預期目標： 1. 繪制果蠅 胚胎 發(fā)育關鍵 時期 和特定基因突變體的高分辨 率全基因組核小體圖譜，闡明核小體重排和染色質(zhì)結構在發(fā)育過程中的 變化和 功能， 建立一套穩(wěn)定的可應用于不同物種的繪制高分辨率核小體圖譜的 方法 。 2. 繪制胚胎干細胞和 胞 的 高分辨 率全基因組核小體圖譜， 分析比較二者的 核小體重排和染色質(zhì) 重塑的異同。揭示核小體重排和染色質(zhì) 重塑在維持胚胎干細胞和 胞 全 /多能性中的作用。 3. 以 模 式蛋白 ，研究組蛋白修飾和 基化之間的互動 關系，并對 核小體重排的作用 。 利用 除小鼠胚胎干細胞為材料 ，闡明組蛋白修飾 、 基化 和 核小體重排 在 胚胎干細胞 分化 中 的作用機制 。 4. 開發(fā)一套高效分析鑒定核小體定位變化和組蛋白修飾差異的計算生物學方法，建立國內(nèi)首個專門針對核小體定位、組蛋白修飾、順式調(diào)控元件、及它們相互作用的表觀遺傳組學數(shù)據(jù)中心和分析平臺。 5. 預期本課題結題時，在國際一流學術刊物 （ 0）上發(fā)表論文 8，在有影 響力的雜志（ ）上發(fā)表論文 23以上。申請專利 4 項以上。 6. 培養(yǎng)博士后 12，博士研究生 25，繼續(xù)培養(yǎng)和壯大國內(nèi)核小體重排與染色質(zhì)重塑在胚胎發(fā)育和細胞分化中的作用這一表觀遺傳調(diào)控領域的專業(yè)研究隊伍。 三、研究方案 本項目的研究設置分為四部分， 力圖闡明胚胎發(fā)育、干細胞分化、 胞重編程過程中核小體重排和染色質(zhì)重塑的機制和功能；把核小體重排和染色質(zhì)重塑等表觀遺傳機制與發(fā)育異常相關的疾病等有機結合起來。 第一、二部分分別從果蠅胚胎不同發(fā)育時期、不同突變體，及成熟體細胞向多能干細胞重編 程的角度，研究組蛋白修飾、核小體定位和染色質(zhì)結構的變化規(guī)律和作用機制；鑒定在成熟體細胞重編程過程中起關鍵作用的調(diào)控因子和信號分子，及其在核小體重排和染色質(zhì)重塑中的作用機制；第三部分從關鍵組蛋白修飾識別蛋白出發(fā)，分析其調(diào)控組蛋白修飾、核小體定位和染色質(zhì)重塑的分子機制，及這些表觀遺傳機制在干細胞全能性維持和分化中的功能；第四部分從表觀組學角度，收集和整合本項目數(shù)據(jù)與公共數(shù)據(jù)，開發(fā)集數(shù)據(jù)中心和分析平臺于一體的表觀組學數(shù)據(jù)綜合分析系統(tǒng)，系統(tǒng)研究組蛋白修飾、核小體重排與轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，及三者在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡 中的協(xié)同功能。 四個部分分別側重于胚胎、細胞、基因組和高通量分析方面，進行較系統(tǒng)的表觀遺傳學研究，既突出重點，又相互促進。高分辨率全基因組核小體圖譜的繪制在國際上才剛剛起步，在我國還是空白；組蛋白修飾、核小體重排和染色質(zhì)重塑在 胞形成中的功能和機制尚不清楚；組蛋白修飾識別蛋白 控組蛋白修飾、核小體定位和染色質(zhì)結構的分子機制還未見報道。這些研究都具有很強的創(chuàng)新性和前沿性。 本項目緊密圍繞這些問題，組建國內(nèi)優(yōu)秀團隊，以期在這些問題上獲得突破。 本團隊成員繪制了果蠅的第一張核小體圖譜，建立了穩(wěn)定的 導體系，鑒定分離到 發(fā)了優(yōu)秀的生物信息學工具，在相關領域有雄厚的基礎，掌握相關的技術。 因此，本團隊完全能夠?qū)嵤┍卷椖垦芯糠桨负腿〉妙A期目標與重大突破。 下面分別詳細介紹各個部分的學術思路、研究方案，以及創(chuàng)新性和可行性。 課題一 果蠅 胚胎 發(fā)育過程中的核小體重排和染色質(zhì)高級結構的變化 果蠅從受精卵發(fā)育到成蟲的過程中， 進行快速的復制，基因要進行大量而精確的轉(zhuǎn)錄表達以供細胞分裂分化和生長發(fā)育所需。在這個生理過程中的不同階段，染色質(zhì)結構相應地發(fā)生了巨大的變化。本課題以核小體為基本研究對象，探索在果 蠅不同發(fā)育階段，全基因組核小體排列分布的變化和染色質(zhì)高級結構的變化，闡明它們在果蠅發(fā)育過程中影響基因轉(zhuǎn)錄的分子機制。 具體而言，擬在果蠅發(fā)育過程中選取兩個具有代表性的時間點： 1）原腸形成期（ 外胚層開始內(nèi)陷形成中胚層和內(nèi)胚層。 2） 神經(jīng)分化形成期 ，中央神經(jīng)系統(tǒng)（ 外周神經(jīng)系統(tǒng)（ 始分化發(fā)育。收集這兩個時期的果蠅胚胎，提取出單核小體。再用高通量測序技術測出核小體 列，把其比對定位到果蠅基因組上。這樣可以獲得這些序列在每條染色體上的位置。在此基礎上，利用生物信息學的 方法，進一步預測出核小體，并得到高分辨率全基因組核小體圖譜。果蠅的基因、各種順式調(diào)控元件、轉(zhuǎn)座子等在基因組上都有很清楚的標注。通過比較研究核小體和這些元素之間的位置關系，可以得到核小體的排列分布模式。例如，核小體是富集在基因編碼區(qū)還是非編碼區(qū)？核小體空白區(qū)又主要分布在何處？核小體的排列分布可以揭示在果蠅發(fā)育的特定階段，染色質(zhì)開放和關閉區(qū)域的分布情況，哪些基因被激活，哪些基因處在休眠。再通過比較研究染色質(zhì)開放和關閉區(qū)域的分布、激活的基因、休眠的基因在不同發(fā)育階段的變化，可以比較清楚地闡述核小體重排和染色質(zhì)結構 的變化在胚胎發(fā)育中的作用機理。 另外，選擇果蠅 變體，研究它的核小體重排和染色質(zhì)重塑。 致 果蠅 神經(jīng)發(fā)育異常。（ 變 在人類則導致 合癥， 性狀包括 發(fā)育遲緩， 智力發(fā)展遲緩 ，早衰，走路笨拙 等 。 ） 果蠅突變體 進行研究，發(fā)現(xiàn)果蠅不同體節(jié)有不同的發(fā)育途徑，由不同基因控制，并分享了 1995 的諾貝爾 生理學或 醫(yī)學獎。針對這一典型突變體， 應用上述技術，分別測定 變體 的 高分辨率全基因組核小體圖譜，再和野生型的核小體圖譜進行基因組學上的比較，探索二者 之間的核小體重排和染色質(zhì)結構變化，進一步揭示這些基因的突變?nèi)绾瓮ㄟ^影響核小體重排來調(diào)控其靶基因的轉(zhuǎn)錄表達，從而造成發(fā)育異常。此項研究在探索核小體重排和染色質(zhì)結構變化在胚胎正常和缺陷發(fā)育中的作用機制具有重大意義。 總體研究方案圖示如下： 發(fā)育時間點 2 野生型果蠅胚胎 果蠅 變體 發(fā)育時間點 1 野生型果蠅胚胎 預測核小體 構建核小體圖譜 比較基因組學 鑒定核小體重排 闡述影響胚胎發(fā)育的機理 預測核小體 構建核小體圖譜 預測核小體 構建核小體圖譜 比較基因組學 鑒定核小體重排 闡述造成胚胎發(fā)育異常的機理 甲醛固定 裂解細胞 分離染色質(zhì) 核酶消化得到單核小體 染色質(zhì)免 疫沉淀收集核小體 膠純化 增 測序 甲醛固定 裂解細胞 分離染色質(zhì) 核酶消化得到單核小體 染色質(zhì)免疫沉淀收集核小體 膠純化 增 測序 甲醛固定 裂解細胞 分離染色質(zhì) 核酶消化得到單核小體 染色質(zhì)免疫沉淀收集核小體 膠純化 增 測序 本部分工作采用高通量測序技術研究單核小體動態(tài)分布對果蠅發(fā)育過程的影響和作用機制，具有很高的創(chuàng)新性和可行性。 在此部分研究中，我們首次在果蠅的不同發(fā)育階段探索核小體重排和染色質(zhì)高級結構對發(fā)育的影響。這是一個全新的研究思路 。此外， 關于果蠅高分辨率全基因組 核小體 圖譜，目前國際上只有一篇報道，是由課題負責人于 2008 年發(fā)表在 志上，用的是 小體變體。 在此基礎上，本課題用野生型核小體為研究對象，因此可行性很強，在國際上也有很大的優(yōu)勢。 這一部分課題的研究組成員，在果蠅發(fā)育、突變體培養(yǎng)、高通量測序技術應用和數(shù)據(jù)分析上都分別有多年的工作經(jīng)驗、扎實的知識與技術積累，并取得很大的學術成果，在高影響因子的雜志上發(fā)表文章。因此，本課題組的研究成員完全能夠?qū)嵤┱n題研究方案和實現(xiàn)預期目標。 課題二體細胞重 編程過程中核小體重排 和染色質(zhì)重塑 本課題的關鍵科學問題包括：核移植和 胞形成等體細胞重編程過程中，核小體的分布和染色質(zhì)結構發(fā)生了怎樣的變化？組蛋白修飾和信號轉(zhuǎn)導是如何影響體細胞重編程中的核小體重排和染色質(zhì)重塑的？最終組蛋白修飾、核小體重排和染色質(zhì)重塑在體細胞重編程中有什么作用，作用機制是什么？針對這些問題，我們設計了如下研究方案： 胞誘導技術的建立。在已有基礎上，集中力量優(yōu)化 3胞系 胞誘導技術。 建立和完善可誘導 胞體系，得到完全由可誘導 胞來源的小鼠，從而分離到均一的含可誘導病毒載體的體 細胞。 利用 術，全基因組范圍內(nèi)研究 胞形成中特異性修飾的組蛋白定位、核小體定位和染色質(zhì)結構的變化。 利用生物信息學手段，分析這些高通量數(shù)據(jù)，預測在 胞形成中調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、組蛋白修飾變化、核小體定位和染色質(zhì)重塑等可能的關鍵分子（組蛋白修飾酶、染色質(zhì)重塑酶等）。 利用基因操作干預這些關鍵分子，研究它們在 胞形成中是否起作用。選擇顯著影響 胞形成的分子進行后續(xù)研究。 利用 術，逐個 響 胞形成的關鍵分子，用 蛋白修飾、核小體定位和染色質(zhì)重塑的調(diào)節(jié)作用。 利用已經(jīng)報道可以調(diào)節(jié)這些關鍵分子活性的小分子化合物，進一步確證基因操作的結果。 利用生物信息學分析研究在 胞形成中這些關鍵分子可能形成的信號轉(zhuǎn)導通路。 利用基因操作干預這些可能信號通路中的關鍵分子，研究這些分子對組蛋白修飾酶特異性、核小體定位、染色質(zhì)重塑等的作用。 利用基因操作和小分子化合物驗證這些關鍵分子和網(wǎng)絡在 胞形成中的作用。最終全面闡述組蛋白修飾、核小體定位和染色質(zhì)重塑在 胞形成中的作用和機 制。 本研究的技術路線可以概括為如下圖所示： 近期的研究顯示，組蛋白甲基化酶的抑制劑和去乙?；傅囊种苿┒寄艽蠓岣?胞的形成效率。這顯示組蛋白修飾在細胞重編程中具有 極其 重要的作用。但組蛋白修飾在 胞形成中的功能和機制尚不清楚。我們認為，組蛋白修飾的一個重要作用就是改變基因組范圍內(nèi)核小體的定位和染色質(zhì)結構，從而特異性調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和表達，因此 本研究緊緊圍繞組蛋白修飾、核小體定位和染色質(zhì)重塑展開，這樣的研究具有創(chuàng)新性。 同時，我們對組蛋白修飾、核小體定位和染色質(zhì)重塑 的研究還關注到調(diào)節(jié)這些過程的信號分子、相關酶起作用的靶分子和這些酶間的相互作用，相信這樣的研究可以較為全面地揭示組蛋白修飾等在 定能夠得到原創(chuàng)性的成績。此外，充分利用信號轉(zhuǎn)導通路研究較為清楚的特點，利用信號通路的激動劑和抑制劑研究組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑特異性的機制及其對 胞形成的作用，也很有創(chuàng)新，相體細胞重編程中基因轉(zhuǎn)錄、組蛋白特異修飾、核小體定位和染色質(zhì)結構變化的高通量數(shù)據(jù)獲取 生物信息學分析數(shù)據(jù)，預測在這些修飾變化中起關鍵作用的因子、特定組蛋白修飾酶、染色質(zhì)重塑酶及信號分子 用基因敲除技術研究特定組蛋白修飾酶、染色質(zhì)重塑酶 及信號分子等在這些修飾變化中的作用及機制 鑒定信號通路調(diào)節(jié)劑、組蛋白修飾酶抑制劑等小分子化合物，進一步確定上述作用和分子機制 分析信號通路調(diào)節(jié)劑、組蛋白修飾酶抑制劑等小分子化合物對核小體重排和染色質(zhì)重塑的影響，研究核小體重排和染色質(zhì)重塑等在體細胞重編程中的作用及機制 信 不僅有助于 胞形成機制的闡明，而且有助于 胞誘導技術的進一步發(fā)展和完善。 胞的成功正是基于科學家們對研究胚胎干細胞和體細胞核移植研究的基礎上產(chǎn)生的。 而體細胞核移植可以將分化的體細胞恢復到最原始的全能性狀態(tài)，但是其間發(fā)生的機制卻至今不清楚，從而造成克隆胚胎發(fā)育低下的狀態(tài)遲遲沒有改善。我們的研究已經(jīng)證明體細胞克隆胚胎發(fā)育過程中組蛋白修飾與正常胚胎存在顯著的差異，而這些差異可能造成染色質(zhì)重組，核小體組裝的缺陷，從而造成克隆胚胎的發(fā)育異常，我們的研究將有助于我們進一步通過改變相應基因的表達來提高克隆胚胎的發(fā)育。 本研究涉及的主要技術有體細胞核移植技術，胚胎干細胞培養(yǎng)技術、 胞誘導技術、 胞鑒定技術、信號轉(zhuǎn)導、基因干預技術、蛋白組學、 因轉(zhuǎn)錄分析和生物信息學分析等技術。關鍵技術為新興的 胞誘導和鑒定技術，以及表觀遺傳組學分析技術等，經(jīng)過一年多的摸索，目前我們已經(jīng)較好地掌握了這些系列技術。項目中涉及的其它方法和技術也都是我們研究團隊的特長和優(yōu)勢技術，在以往的研究中也都已經(jīng)應用過。因此，我們的研究不存在技術上的障礙，研究方案是可行的。同時，本課題的承擔單位具有高效的管理系統(tǒng)、專業(yè)的技術支 持 系統(tǒng)、優(yōu)秀的研究生生源等，足以保證我們項目的順利進行。 課題三 胚胎干細胞中組蛋白修飾、 基化和核小體定位的互動機制 以 族成員 模型，闡明組蛋白修飾識別蛋白在對胚胎干細胞的 基化、組蛋白修飾、核小體重排和染色質(zhì)重塑的調(diào)控作用和機制，以及研究組蛋白修飾和 基化之間的互動及其在基因組水平上對核小體定位和染色質(zhì)重塑的影響。圍繞這一總體目標，我們的總體研究方案可分為三個部分： 1）利用生化、分子與 結構 生物學方法 （ 比較分析 別 基化和 基化的能力，確定其相關結構域，并通過晶體結構解析其結合 根據(jù)上述結果構建 失 基化或基化或兩者的點突變體。進而利用這些突變體分析 基化和 揭示它們在調(diào)控組蛋白修飾、 基化方面和 核小體定位 的作用和分子機制 。 2）構建 件性敲除（ 鼠并獲得 和 胞株。 件性敲除小鼠將為今后研究 分析 胚胎發(fā)育后階段，特別是與 基化異常相關疾病的研究創(chuàng)造有利條件。 3）以野生型 和 胞株為模型，制備單核小體染色質(zhì)。運用 各類組蛋白修飾特異抗體，通過染色質(zhì)免疫共沉淀結合高通量 序的方法（ 并借助生物信息學分析手段，分析確定 胚胎干細胞全基因組中的定位，進一步比較 基化、組蛋白修飾、核小體之間在基因組層次上的位置分布關系， 揭示二者在 組蛋白修飾、 核小體重排和染色質(zhì)重塑中 的重要作用 。 總體的研究方案圖示如下： 族成員 白是本部分的研究模型蛋白。目前的研究主要集中于 對 功能知之甚少。 僅能識別 且還能識別 基化，是目前所知的唯一能同時識別甲基化組蛋甲基化組蛋白與甲基化 別蛋白 基因組 位分析 構建 除小鼠模型 和 胚胎干細胞或 胚胎成纖維細胞 與正常干細胞相比較 分 析 小體之間在基因組層次上的位置分布關系 解析二者對 基化和 基化的識別 對組蛋白修飾、 基化的作用 影響核小體重排、染色質(zhì)重塑的分子機制 結構功能分析 鑒定二者對基化 / 基化的識別能力 比較野生型與突變體中，二者對組蛋白修飾和核小體定位的差異 白和甲基化 蛋白因子。 最近研究表明， 招募 基化酶 新復制的 中起著至關重要的作用。但 維持 基化中的 作用及分子機制還未得到證明，有待進一步的研究。 本課題通過小鼠基因敲除技術，從“組”學層次上研究 調(diào)控胚胎干細胞表觀遺傳譜式中的作用，在課題設計和思路上具有很強的創(chuàng)新性。 我們實驗室通過生化方法鑒定出來的。因此本課題可行性很強，在國內(nèi)外上都有很大的優(yōu)勢。 另外，本課題的承擔單位具有雄厚的硬件基礎、杰出的科研人員、優(yōu)秀的研究生生員，為本課題的順利實施提供了保障。 課題四 表觀遺傳組綜合分析系統(tǒng)的構建和應用 本課題主要開發(fā)高通量表觀遺傳組學數(shù)據(jù)的分析方法，建立數(shù)據(jù)中心 、數(shù)據(jù)分析平臺，解讀表觀遺傳在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用。為達到這些目標，我們相應地設計了如下研究方案： 1. 表觀遺傳組的動態(tài)變化 (1) 針對 三 種重要的模式生物（酵母、果蠅和人），收集在不同細胞分化階段或細胞在不同外界刺激條件下的全基因組高通量核小體定位和組蛋白修飾的測序數(shù)據(jù)，并收集在相應條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)； (2) 將離散的高通量核小體定位測序數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為在基因組上連續(xù)的組蛋白密度分布信號，以隱馬爾可夫模型（ 核心算法，開發(fā)生物信息學工具，高通量鑒定特異性的組蛋白密度變化區(qū)域； (3) 開發(fā)生物信息學工具， 以抽樣法 鑒定不同的測序深 度造成的統(tǒng)計偏差并進行小樣本矯正，從而高通量鑒定細胞狀態(tài)特異性的核小體位置變化； (4) 結合在相應條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，初步探討細胞狀態(tài)特異性的組蛋白密度變化及核小體位置移動與基因的表達調(diào)控之間的關系； (5) 針對組蛋白共價修飾的高通量 據(jù)，特別是與基因表達抑制相關的組蛋白修飾（如 ），以隱馬爾可夫模型為核心算法，開發(fā)生物信息學工具從基因組層次上鑒定細胞狀態(tài)特異性的組蛋白差異修飾； (6) 針對與基因表達激活相關的組蛋白共價修飾（如 ,對于 核小體解析度的 據(jù)，以貝葉斯反演 （ 為核心算法，構建生物信息學模型定量化鑒定組蛋白修飾程度，并在此基礎上定量鑒定特異性的組蛋白差異修飾； (7) 結合在相應條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，初步探討細胞狀態(tài)特異性的組蛋白差異修飾與基因的表達調(diào)控之間的關系。 2. 表觀遺傳組分析平臺 (1) 在果蠅 胞系中準備四組標準測試樣品，包括 基因組 核 小體 品、 品和基因組對照樣品； (2) 將四組樣品分別用三種高通量測序儀 行深度測序； (3) 基于上述實驗數(shù)據(jù)，進行生物信息學分析，包括： 1)評估測序深度對檢測靈敏度的影響， 2)評估不同測序儀對數(shù)據(jù)質(zhì)量的影響， 3)監(jiān)測不同信號峰檢測軟件的性能， 4)建立 據(jù)質(zhì)量控制標準； (4) 將四組樣品分別在 基因組高密度芯片上雜交； (5) 基于已完成的評估 據(jù)質(zhì)量的 驗結果，以及上述實驗數(shù)據(jù)，進行生物信息學分析，評估 兩種技術平臺對表觀遺傳數(shù)據(jù)檢測靈敏度的影響； (6) 基于上述 結果，整合我們針對不同技術平臺發(fā)展出來的信號峰檢測方法，包括 據(jù)）、 小體測序數(shù)據(jù)）、 據(jù)）和 色 據(jù)），并加入數(shù)據(jù)質(zhì)量控制標準，建立自動化流程來盡量消除不同表觀遺傳組學數(shù)據(jù)間因?qū)嶒炘O計和技術差別造成的影響； (7) 針對基于 表觀遺傳組學數(shù)據(jù)，建立和整合高通量數(shù)據(jù)分析方法，包括： 1)我們上述提到的數(shù)據(jù)預處理自動化流程（包括信號峰檢測軟件和數(shù)據(jù)質(zhì)量控制標準）， 2)在研究內(nèi)容 1 中發(fā)展出的一系列高通量鑒定特異性的核小體定位變化和染色質(zhì)差異修飾的方法， 3)我們發(fā)展出來的下游分析方法，包括 能注釋）、 測富集的列 基序（ ）等； (8) 在上述分析工具整合的基礎上，依托 計 算服務器機群，運用軟件工程技術，加入用戶管理及數(shù)據(jù)可視化功能，建立表觀遺傳組學數(shù)據(jù)分析平臺。 3. 表觀遺傳組數(shù)據(jù)中心 (1) 在豐富培養(yǎng)皿中分別培養(yǎng)野生型酵母（ 因敲除酵母，分別獲得指數(shù)期正常培養(yǎng)條件、熱休克條件（熱休克 15 分鐘）、半乳糖條件（加入 2%半乳糖）下的 酵母樣品； (2) 針對每種酵母樣品，用 降解核小體間連接 后利用術，在核小體解析度上測量單核小體及如下幾種組蛋白修飾，包括 3； (3) 運用生物信息學方法，分析上述得到的相互關聯(lián)的一系列表觀遺傳高通量數(shù)據(jù)，深入研究核小體重排和多種組蛋白修飾之間的相互影響； (4) 針對 三 種重要的模式生物（酵母、果蠅和人），收集和整合全基因組核小體定位和組蛋白修飾的公共數(shù)據(jù)和本項目產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，通過研究內(nèi)容 2中發(fā)展出的自動化流程來對數(shù)據(jù)進行預處理，包括統(tǒng)一數(shù)據(jù)檢測的質(zhì)量，并去除沒有通過數(shù)據(jù)質(zhì)量控制標準的數(shù)據(jù)，建立表觀遺傳組學數(shù)據(jù)中心。 4. 表觀遺傳在調(diào)控網(wǎng)絡中的作用 (1) 針對 三 種重要的模式生物（酵母、果蠅和人），收集和整理轉(zhuǎn)錄因子高通量 共數(shù)據(jù)，在各個模式生物中建立基因調(diào)控網(wǎng)絡，并整合基因組學、比較基因組學和細胞信號轉(zhuǎn)導通路網(wǎng)絡數(shù)據(jù)； (2) 基于本項目產(chǎn)生及收集的所有表觀遺傳組學數(shù)據(jù)，收集在相應條件下的模式生物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)； (3) 基于研究內(nèi)容 3 中產(chǎn)生的一系列相互關聯(lián)的酵母高通量表觀遺傳數(shù)據(jù)，結合酵母中由上百種轉(zhuǎn)錄因子 共數(shù)據(jù)建立的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡，以貝葉斯網(wǎng)絡 （ 為核心算法，建立生物信息學模型，在酵母中基本闡明核小體重排、組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，以及三者在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡中的協(xié)同功能； (4) 將上述分析方法應用于其它三種更為復雜的模式生物，結合轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡，深入分析我們課題得到的所有數(shù)據(jù)和知識，特別是系統(tǒng)地分析本項目中果蠅、體細胞重編程、以及干細胞分化中的數(shù)據(jù)，從基因組層次上，較為全面地研究在不同細胞分化階段，核小體重排和組 蛋白修飾在真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡中的重要作用。 總體的研究方案圖示如下： 近期的高通量數(shù)據(jù)顯示核小體重排和組蛋白修飾與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控緊密相關，但是目前對其功能的研究仍很初步，而且從基因組層次上分析和整合高通量數(shù)據(jù)已經(jīng)成為表觀遺傳組學研究的瓶頸。本課題集中在研究、開發(fā)和整合高通量表觀遺傳組學數(shù)據(jù)分析方法，建立集數(shù)據(jù)中心和數(shù)據(jù)分析平臺于一體的表觀遺傳組綜合分析系統(tǒng)。同時，我們認為核小體重排及組蛋白修飾并非孤立地調(diào)控基因的表達，而是需要與轉(zhuǎn)錄因子相互影響，共同起作用。因此，基于表 觀遺傳組綜合分析系統(tǒng)，本課題重點研究核小體重排、組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，以及三者在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡中的協(xié)同功能。通過構建生物信息學模型從基因組層次上進行系統(tǒng)的研究，可以較為全面地揭示表觀遺傳在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡中的重要作用。 本課題成果可以推動整個表觀遺傳組學領域的研究，具有重大價值和創(chuàng)新性。 本課題是在已有工作基礎上的進一步深化和擴展，研究內(nèi)容都是基于我們在針對高通量表觀遺傳組學數(shù)據(jù)已有的工作基礎上所提出的重要問題。 本課題的主開發(fā)生物信息學工具，從基因組層次上高效分析組蛋白密度變化、核小體位置變化以及組蛋白差異修飾 整合表觀遺傳組數(shù)據(jù)分析工具 軟件工程和數(shù)據(jù)可視化技術 深度測序表觀遺傳標準測試樣 品 ，闡明實驗設計對表觀遺傳組數(shù)據(jù)質(zhì)量的影響 系統(tǒng)地研究酵母中核小體重排和組蛋白修飾的 基因轉(zhuǎn)錄 調(diào)控作用 結合文獻挖掘技術，收集表觀遺傳 學知識庫 表觀遺傳組數(shù)據(jù)分析平臺 表觀遺傳組數(shù)據(jù)中心 表觀遺傳組綜合分析系統(tǒng) 構建生物信息學模型，從基因組層次上闡明核小體重排和組蛋白修飾在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡中的重要作用 建立自動化流程，收集和整合 表觀遺傳組學數(shù)據(jù) 要研究人員在分析和整合高通量數(shù)據(jù)方面在國際上具有領先的地位，已經(jīng)掌握研究 方案和技術途徑中所涉及的方法和技術， 包括：生物信息學技術、 子生物學技術、數(shù)據(jù)庫技術、軟件工程技術、數(shù)據(jù)可視化技術等。同時，承擔單位具有高效的管理系統(tǒng)、專業(yè)的技術支 持 系統(tǒng)、優(yōu)秀的研究生生源。因此，本研究方案是完全可行的。 各課題間相互關系 本項目設置四個課題，從胚胎發(fā)育、體細胞核移植和 胞形成、干細胞分化和表觀遺傳組學四個方向研究核小體重排和染色質(zhì)重塑。這四個課題各有側重，同時互為補充，從不同角度，多學科結合在一起，全面深入地闡述核小體重排和染色質(zhì)重塑及組蛋白修飾在胚胎發(fā)育、 體細胞重編程和干細胞分化及在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的重要功能和作用機制。 課題一、果蠅 胚胎 發(fā)育中的核小體重排和染色質(zhì)高級結構的變化 研究目標 ：構建果蠅重要發(fā)育階段及重要基因突變體的高分辨率全基因組核小體圖譜，探索不同發(fā)育階段和突變體中核小體重排及染色質(zhì)結構的變化，闡明核小體重排和染色質(zhì)結構變化的內(nèi)在規(guī)律，以及與胚胎發(fā)育間的關聯(lián)，影響胚胎發(fā)育與造成胚胎發(fā)育缺陷的分子作用機理。同時，建立一套穩(wěn)定的可應用于不同物種的繪制高分辨率核小體圖譜的 方法 。 研究內(nèi)容 ：在果蠅發(fā)育中兩個典型的時間點，分離出染色質(zhì)，通過染色質(zhì)免疫沉淀 耦聯(lián)測序的技術，構建高分辨率核小體圖譜。通過比較基因組學的手段，揭示在不同發(fā)育階段核小體重排和染色質(zhì)結構的變化，鑒定作為指引核小體定位基礎的保守 列及其特征。同時闡述組蛋白修飾對核小體重排和染色質(zhì)重塑的作用機制 。此外，利用類似的方法，構建果蠅 變體的高分辨率核小體圖譜，分析靶基因的核小體重排和染色質(zhì)結構的變化，并闡明它們對胚胎發(fā)育缺陷的作用機制。再利用基因剔除實驗 或 擾技術 分析證實這些靶基因在胚胎發(fā)育過程的分子作用。 經(jīng)費比例 ： 27% 承擔單位 ： 同濟大學 課題負責人 ： 江賜忠 課題二、 體細胞重編程過程中核小體重排和染色質(zhì)重塑 研究目標 ： 闡明 胞誘導過程中組蛋白修飾特異性變化、核小體重排、染色質(zhì)重塑和基因轉(zhuǎn)錄特異性激活或抑制間的相互作用、因果關系和調(diào)節(jié)機制，找出在這一細胞重編程過程中起關鍵作用的未知因子及其分子機理。通過體細胞核移植的研究以及卵母細胞定量質(zhì)譜分析闡明核移植重編程與 編程的機制是否相同，卵母細胞中可能的重編程因子是否可以為 胞誘導所利用進一步提高 導效率。 研究內(nèi)容 ：研究在體細胞核移植和 胞形成等體細胞重編程中組蛋白修飾特異性改變、核小 體重排和染色質(zhì)重塑，揭示它們在調(diào)節(jié)體細胞重編程中的互動網(wǎng)絡和機制。研究體細胞重編程中關鍵分子和信號通路的激活劑和抑制劑對組蛋白修飾特異性和染色質(zhì)重塑相關分子的調(diào)節(jié)作用及機制，以及這些小分子化合物在 胞 形成中的作用及機制。 經(jīng)費比例 ： 25% 承擔單位 ： 北京生命科學研究所、同濟大學 課題負責人 ： 高紹榮 課題三、胚胎干細胞中組蛋白修飾、 基化和核小體定位的互動機制 研究目標 ：胚胎干細胞 中 基化和組蛋白修飾與核小體重排的關系；組蛋白修飾識別蛋白調(diào)控組蛋白修飾 和 影響核小體 重排的作用機制 ，組蛋 白修飾識別蛋白調(diào)控胚胎干細胞全能性和分化的分子機制。 并利用 除小鼠胚胎干細胞為模型，研究組蛋白修飾和 基化之間的互動及其在基因組水平上對核小體定位的影響。 研究內(nèi)容 ： 以小鼠胚胎干細胞為模型，通過對組蛋白修飾識別蛋白 研究，獲得二者的全基因組定位，闡明二者的定位與所在位點的組蛋白 基化和 基化的關系。并以此為模型分析 組蛋白修飾識別蛋白影響 基化、組蛋白修飾和核小體重排的機制，及三者之間的互動關系和具體每一個活動（ 胚胎干細胞特性的維持和分化的影響。 經(jīng)費比例 ： 23% 承擔單位 ： 華東師范大學、中國科學院生物物理研究所 課題負責人 ： 翁杰敏 課題四、 表觀遺傳組綜合分析系統(tǒng)的構建和應用 研究目標 ：構建表觀遺傳組綜合分析系統(tǒng)，建立高通量數(shù)據(jù)質(zhì)量控制標準，闡明 核小體重排、組蛋白修飾與轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，及三者在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡中的協(xié)同功能。 研究內(nèi)容 ： 在基因組層次上如何分析、整合及闡釋高通量數(shù)據(jù)已經(jīng)成為表觀遺傳組學研究的瓶頸 ， 本課題擬開發(fā)高通量鑒定組蛋白修飾差異和核小體定位變化的分析工具，并深入研究高 通量數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制，建立表觀遺傳組學分析平臺 ；同時收集和整合全基因組核小體圖譜和組蛋白修飾的公共數(shù)據(jù)和本項目中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)， 并整合基因組學、比較基因組學和細胞信號轉(zhuǎn)導通路數(shù)據(jù) ，建立表觀遺傳組學數(shù)據(jù)中心。以此為基礎，系統(tǒng)地分析項目中果蠅、體細胞重編程、以及干細胞分化中的數(shù)據(jù)，研究核小體重排、組蛋白修飾與轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，及三者在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡中的功能。 經(jīng)費比例 ： 25% 承擔單位 ： 同濟大學 課題負責人 ： 張勇 四、年度計劃 研究內(nèi)容 預期目標 第 一 年 收集果蠅 原腸形成期 的胚胎， 分離 、制備單 核小體 ，并測出其序列，定位到基因組，繪制出 高分辨率全基因組核小體圖譜 。 胞誘導 技術的建立， 為進一步研究 胞 形成機制打下基礎 ； 倍體小鼠的建立，將為不同組織來源 胞系的構建提供便利，而且這樣來源的組織細胞遺傳背景、外源因子插入的拷貝數(shù)等都具有可比性。 開展 別 基化的結構和功能研究，開展 除小鼠的打靶載體的構建和初期干細胞同源重組工作，制備和鑒定染色質(zhì)免疫共沉淀級 體，以便進行通過行 小鼠胚胎干細胞基因組中定位。 針對高通量核小體測序數(shù)據(jù)，發(fā)展生物信息學分析手段 ； 在果蠅 胞系中準備 準測試樣品 ;針對組蛋白修飾高通量 據(jù)，建立生物信息學模型 。 獲得 果蠅 原腸形成期 胚胎的 高分辨率全基因組核小體圖譜 ；建立一套穩(wěn)定可行的適用于不同物種的 高分辨率全基因組核小體圖譜 繪制方法。 建立 誘導 胞 系統(tǒng) ；培育出可誘導 倍體互補小鼠 。 基本完成對 現(xiàn) 3別結構域的高表達和純化；初步完成 除小鼠的打靶載體的構建；鑒定出 1 的 體。 預計可以建立高通量鑒定組蛋白密度變化、核小體位置移動的方法；預計可以 獲得 核小體定位和組蛋白修飾的標準測試樣品 ； 預計可以高通量、定量化地鑒定特異性的組蛋白差異修飾 。 研究內(nèi)容 預期目標 第 二 年 收集果蠅 神經(jīng)分化形成期 的胚胎， 分離、制備單 核小體 ，并測出其序列，定位到基因組，繪制出 高分辨率全基因組核小體圖譜 ；比較 原腸形成期 與神經(jīng)分化形成期 胚胎中 核小體 定位的變化，研究 核小體 重排和染色質(zhì)結構的變化在胚胎發(fā)育中的作用機理 。 克隆胚胎內(nèi)細胞團 及 胞 的核小體定位的異同，揭示核小體重排和染色質(zhì)重塑在維護干細胞全能性和胞 誘導后多能性獲得中的作用及機制。 繼續(xù)研究 別 究其識別基化的生物學意義，與其識別 基化的功能關系；開展位研究；繼續(xù)進行 對核小體定位和組蛋白修飾的標準測試樣品分別在不同高通量測序平臺進行深度測序?qū)嶒?；建立自動化流程來消除不同表觀遺傳組學數(shù)據(jù)間因?qū)嶒炘O計和技術差別造成的影響；培養(yǎng)野生型 和 因敲除酵母，分別獲得指數(shù)期正常培養(yǎng)條件、熱休克條件、半乳糖條件下的酵母樣品 。 獲得 果蠅 神經(jīng)分化形成期 胚胎的 高分辨率全基因組核小體圖譜 ；揭示 核小體重排和染色質(zhì)結構 在不同發(fā)育時期 的變化 本質(zhì)規(guī)律，及 在胚胎發(fā)育中的作用機理 。 克隆胚胎內(nèi)細胞團 及 胞 的 全基因組核小體圖譜 ，分析鑒定在維護干細胞全能性和 胞 誘導后多能性獲得中所需的特定 核小體 定位和基因組區(qū)域。 基本闡明 別 本闡明其識別基化功能與識別 基化功能的關系，以及這兩者與細胞內(nèi)基化的建立與維持的關系；獲得 望獲得 除小鼠。 預計可以闡明 驗設計對表觀遺傳組學數(shù)據(jù)質(zhì)量的影響 ； 預 計可以消除因?qū)嶒炘O計和技術差別對表觀遺傳組學數(shù)據(jù)造成的影響；預計可以為進行核小體解析度的 備好每種條件下的酵母樣品。 研究內(nèi)容 預期目標 第 三 年 分別繪制野生型和 變體 果蠅的 高分辨率全基因組核小 體圖譜 ；比較二者的異同，發(fā)現(xiàn) 核小體 定位的變化； 探索核小體重排和染色質(zhì)結構變化在胚胎正常和缺陷發(fā)育中的作用機制 。 分析 組蛋白特異性修飾（主要是 甲基化以及 乙?；┰?胞形成中 的作用與機制，以及對 核小體重排和染色質(zhì)重塑的 調(diào)控功能。 解析 別 基化的分子結構，研究其識別 基化活性與細胞內(nèi) 基化，特別是異染色質(zhì)區(qū)域 基化的建立與維持的關系；繼續(xù)進行 小鼠胚胎干細胞全基因組的 位研究；研究 件性敲除小鼠的表型性狀，特別是在胚胎發(fā)育中的作用與機制；獲得 除小鼠胚胎干細胞，開展全基因組的核小體定位， 基化與組蛋白修飾的研究。 以標準測試品深度測序試驗為基礎，建立和整合高通量表觀遺傳組學數(shù)據(jù)分析方法， 依托高性能計算服務器， 并 整合 軟件工程和數(shù)據(jù)可視化技術 ， 建立表觀遺傳組學數(shù)據(jù)分析平臺 ；運用 術在 核小體解析度上測量