項目名稱： 胸腺與免疫細胞發(fā)育的分子調(diào)控 首席科學(xué)家： 趙勇 中國科學(xué)院動物研究所 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部門： 中國科學(xué)院 一、研究內(nèi)容 本項目將緊緊抓住“免疫器官及細胞發(fā)育分化”主題，重點圍繞上述三個基 本科學(xué)問題，應(yīng)用各種遺傳修飾的模式動物（斑馬魚、小鼠、果蠅等）及發(fā)育生 物學(xué)、進化基因組學(xué)、分子細胞生物學(xué)等理論和技術(shù)手段，分以下 4 個課題深入 開展研究：課題 1 主要應(yīng)用斑馬魚、小鼠模型，研究胸腺（胸腺上皮細胞及胸腺 細胞）發(fā)育及衰老的關(guān)鍵分子機制，闡明胸 腺上皮細胞與胸腺細胞相互作用的調(diào) 控規(guī)律；課題 2 首先應(yīng)用斑馬魚報告系統(tǒng)獲得對造血干細胞發(fā)生、維持和向淋巴 系發(fā)育的重要分子，然后應(yīng)用小鼠模型，深入研究其對干細胞向淋巴細胞發(fā)育調(diào) 控的分子機制；課題 3 主要應(yīng)用果蠅、小鼠及體外免疫細胞誘導(dǎo)體系，研究免疫 細胞向各亞群定向發(fā)育分化的調(diào)控機制；課題 4 主要應(yīng)用進化 /比較基因組學(xué)方 法來研究與發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵分子，并利用課題 1供的技術(shù)平臺 與體系，進行驗證和深入研究。 本項目 4個課題各有側(cè)重，進行深入研究，又相 互關(guān)聯(lián)與促進；作為一個研究整體，來闡 明胸腺及造血干細胞向成熟免疫細胞發(fā) 育的調(diào)控規(guī)律及發(fā)生機制。 二、預(yù)期目標(biāo) 應(yīng)用多種遺傳修飾和基因突變模式動物（斑馬魚、小鼠、果蠅等）及進化基 因組學(xué)、免疫學(xué)、分子細胞生物學(xué)、生化等方面技術(shù)手段，重點研究免疫器官胸 腺及免疫細胞發(fā)育、分化和衰老過程中的重要調(diào)控因子及調(diào)控機理。通過本項目 的實驗研究，解析免疫系統(tǒng)（特別是胸腺及其相關(guān)細胞）發(fā)育、分化與功能發(fā)揮 的關(guān)鍵分子調(diào)控線路，揭示免疫系統(tǒng)發(fā)育、分化與功能異常與人類健康的關(guān)系。 獲得一批免疫系統(tǒng)進化、發(fā)育、功能相關(guān)重要基因和相關(guān)蛋白質(zhì)，闡明一些關(guān)鍵 分子 的功能，為開發(fā)擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型免疫制劑、免疫相關(guān)疾病診斷與防 治提供重要理論依據(jù)。在理論上有自己獨到的創(chuàng)新性見解，在技術(shù)上建立一系列 研究免疫發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)理論的現(xiàn)代生物技術(shù)平臺和先進技術(shù)體系。形成一支具 有國際影響和競爭力的研究團隊，培養(yǎng)一批從事相關(guān)科學(xué)研究的中青年學(xué)術(shù)帶頭 人與后備力量。 五年預(yù)期目標(biāo) : 本項目將建立多種遺傳修飾的斑馬魚和小鼠、移植動物模型、體外免疫細胞 發(fā)育分化誘導(dǎo)系統(tǒng)、果蠅天然免疫應(yīng)答遺傳篩選系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)進化發(fā)育生物學(xué) 數(shù)據(jù)庫等技術(shù)平臺，形成一個先進而完整的免疫發(fā)育生物學(xué)研究 體系。揭示胸腺 發(fā)育與衰老、造血干細胞形成及其向免疫前體細胞發(fā)育分化、免疫細胞定向發(fā)育 分化的幾個重要分子調(diào)控路線，獲得一批重要的免疫發(fā)育相關(guān)的新基因 /蛋白質(zhì) 及細胞亞型，并對其功能和調(diào)節(jié)機理進行系統(tǒng)研究，形成重要學(xué)術(shù)假說。力爭在 理論上有突破，在技術(shù)上有創(chuàng)新。 具體指標(biāo)如下： 1 建立一個先進的免疫發(fā)育生物學(xué)研究體系與技術(shù)平臺，包括多種用于研究 免疫系統(tǒng)發(fā)育的遺傳修飾和基因突變的果蠅、斑馬魚和小鼠，實驗方法，技 術(shù)手段等。 2 闡明調(diào)控胸腺上皮細胞干細胞向胸腺上皮細胞發(fā)育分化及胸腺上皮細胞與 胸腺細胞 發(fā)育分化中相互作用的 2重要路線。 3 篩選一批參與胸腺和造血干細胞發(fā)育、分化、衰老與功能調(diào)控的重要基因， 并對其中 5關(guān)鍵基因進行調(diào)控機理研究，為發(fā)展新的免疫藥物靶分子和 防治免疫相關(guān)疾病提供新思路。 4 解析免疫細胞不同亞群發(fā)育分化的 1主要分子通路，為有效調(diào)控免疫 應(yīng)答提供重要依據(jù)。 5 在國際主流學(xué)術(shù)雜志上發(fā)表論文 80 90 篇，其中 0 的論文 12； 申請國家 /國外發(fā)明專利 5。 6 培養(yǎng)博士后 15，博士、碩士研究生 120 名左右。 三、研究方案 1）學(xué)術(shù)思路： 免疫系統(tǒng)發(fā)育與免疫應(yīng)答是一個極為復(fù)雜的生命過程之一。根據(jù)目前國際發(fā) 展趨勢和國內(nèi)現(xiàn)有研究基礎(chǔ)，本項目的總體思路是：應(yīng)用發(fā)育生物學(xué)、進化基因 組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)以及其他最新的理論與技術(shù)，憑借各種模式動物 等研究手段與平臺，以重要免疫器官胸腺及免疫細胞發(fā)育為核心，主要深入探討 胸腺上皮細胞干細胞向胸腺上皮細胞發(fā)育分化的重要調(diào)控通路，胸腺上皮細胞與 胸腺細胞發(fā)育中相互作用主要機理。同時，圍繞胸腺這一免疫器官，我們將進行 淋巴細胞前體細胞及免疫細胞亞群發(fā)育調(diào)控的實驗研究，從 而系統(tǒng)理解免疫細胞 發(fā)育的整個過程。總之，本項目將在基因進化和功能研究的基礎(chǔ)上，通過研究基 因及蛋白質(zhì)在分子、細胞和整體水平上的相互作用，揭示正常與異常免疫系統(tǒng)發(fā) 育過程的調(diào)控機理。具體課題設(shè)置見下圖（圖 1）。 造血干細胞免疫細胞亞群發(fā)育相關(guān)的重要基因 / 蛋白質(zhì)回答科學(xué)問題：胸腺與免疫細胞發(fā)育的重要分子調(diào)控機制？意義：為免疫相關(guān)疾病的防治提供重要理論與技術(shù)基礎(chǔ)。課題 1 ：胸腺（上皮細胞及胸腺細胞）發(fā)育及衰老的分子機制課題 2 ：造血干細胞發(fā)生、維持和向淋系發(fā)育的分子機制課題 3 ：免疫細胞亞群定向發(fā)育分化的調(diào)控機制課題 4 ：應(yīng)用進化 / 比較基因組學(xué)方法研究免疫系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵分子胸腺（上皮細胞、胸腺細胞）胸腺與免疫細胞造血干細胞免疫細胞亞群發(fā)育相關(guān)的重要基因 蛋白質(zhì)回答科學(xué)問題：胸腺與免疫細胞發(fā)育的重要分子調(diào)控機制？意義：為免疫相關(guān)疾病的防治提供重要理論與技術(shù)基礎(chǔ)。課題 ：胸腺（上皮細胞及胸腺細胞）發(fā)育及衰老的分子機制課題 ：造血干細胞發(fā)生、維持和向淋系發(fā)育的分子機制課題 ：免疫細胞亞群定向發(fā)育分化的調(diào)控機制課題 ：應(yīng)用進化 比較基因組學(xué)方法研究免疫系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵分子胸腺（上皮細胞、胸腺細胞）胸腺與免疫細胞圖 1. 胸腺與免疫細胞發(fā)育的分子調(diào)控研究課題設(shè)置 主要科研流程見下圖（圖 2）。 圖 2. 主要實驗流程框架 2）技術(shù)途徑： 本項目執(zhí)行將主要依據(jù)已建立和將要建立的模式動物、體外細胞和組織培養(yǎng) 模型，通 過下述方法或途徑分別在幾個層次上闡明免疫器官（胸腺）和免疫細胞 已知免疫系統(tǒng)發(fā)育重要基因 / 蛋白質(zhì)回答科學(xué)問題疾病發(fā)生、發(fā)展機制建立免疫系統(tǒng)發(fā)育研究平臺闡明 5 - 6 個免疫系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)重要基因調(diào)控線路干細胞 - - 胸腺 - - 免疫細胞 亞群發(fā)育（上皮細胞、胸腺細胞）未知免疫系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵分子遺傳修飾和突變果蠅、斑馬魚研究系統(tǒng)比較基因組學(xué)手段課題 1 - 3 課題 4 課題 1 - 4確定免疫系統(tǒng)發(fā)育重要基因干細胞 - - 胸腺 - - 免疫細胞 亞群發(fā)育（上皮細胞、胸腺細胞）課題 1 - 4遺傳修飾的小鼠等分子生物學(xué)手段生物化學(xué)手段比較基因組學(xué)體外誘導(dǎo)體系基本問題 ：免疫系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵因素與調(diào)控機制已知免疫系統(tǒng)發(fā)育重要基因 蛋白質(zhì)回答科學(xué)問題疾病發(fā)生、發(fā)展機制建立免疫系統(tǒng)發(fā)育研究平臺闡明 個免疫系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)重要基因調(diào)控線路干細胞 胸腺 免疫細胞 亞群發(fā)育（上皮細胞、胸腺細胞）未知免疫系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵分子遺傳修飾和突變果蠅、斑馬魚研究系統(tǒng)比較基因組學(xué)手段課題 課題 課題確定免疫系統(tǒng)發(fā)育重要基因干細胞 胸腺 免疫細胞 亞群發(fā)育（上皮細胞、胸腺細胞）課題遺傳修飾的小鼠等分子生物學(xué)手段生物化學(xué)手段比較基因組學(xué)體外誘導(dǎo)體系基本問題 ：免疫系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵因素與調(diào)控機制發(fā)生、分化成熟的分子機理。 用 位雜交、 擾和過表達、基因報告系統(tǒng)等技術(shù)，檢測基因在所研究細胞和組織中 的轉(zhuǎn)錄表達、定位及調(diào)控。 2. 蛋白質(zhì)水平的研究：利用雙向電泳、酵母雙雜交、免疫共沉淀以及快速定點 突變和結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及蛋白 用的分子機制。 3. 細胞與組織水平的研究：利用建立的各種細胞和組織培養(yǎng)體系和 流式細胞儀、 激光共聚焦顯微鏡、顯微注射等技術(shù)，深入研究基因 /蛋白質(zhì)的功能及調(diào)控網(wǎng) 絡(luò)。 4. 整體水平的研究：涉及的多種模式動物包括果蠅、斑馬魚、小鼠。通過基因 誘變、轉(zhuǎn)基因動物、基因敲除及轉(zhuǎn)基因干細胞移植等技術(shù)建立實驗?zāi)Ｐ?，觀察靶基因的功能。 5. 免疫分子的進化生物學(xué)研究：該研究主要用于篩選人類及相關(guān)模式動物的胸 腺及免疫細胞發(fā)育分化相關(guān)的基因和基因家族，研究其進化起源和功能分化的歷史和動力學(xué)過程。 3) 創(chuàng)新點與特色： 立題新穎、前沿 ： 項目十分重視基礎(chǔ)理論中的源頭創(chuàng)新，對具有應(yīng)用潛能的研究 將有自主 知識產(chǎn)權(quán)；以發(fā)育生物學(xué)的獨特視角，研究免疫系統(tǒng)特別是胸腺相關(guān)細 胞發(fā)育的重要調(diào)控分子基礎(chǔ)，闡明免疫系統(tǒng)發(fā)育分化的重要機制及相關(guān)疾病的發(fā) 病機理，處于當(dāng)代生命科學(xué)研究前沿，具體研究內(nèi)容國內(nèi)外均未見詳細的報道。 實驗?zāi)Ｐ图把芯渴侄蜗冗M： 選用的多種研究動物模型，包括條件性或細胞特異性 基因敲除和基因報告技術(shù)如（ ）基 因缺失小鼠， 基因斑馬魚等，著重在體內(nèi)研 究重要調(diào)控基因在胸腺發(fā)育、胸 腺上皮細胞和淋巴細胞互作中的分子機理。應(yīng)用 進化基因組學(xué)及生物信息學(xué)預(yù)測及分析相關(guān)重要基因及蛋白功能域。實驗技術(shù)及 分析手段有特色。 學(xué)科交叉與優(yōu)勢團隊 ： 研究團隊由不同研究特色和學(xué)科研究人員（發(fā)育、免疫、 進化等）組成，學(xué)科之間交叉明顯。同一位研究骨干可參與 2 個或多個課題研究 內(nèi)容，各研究組之間將進行密切科研合作，共享實驗技術(shù)平臺和實驗?zāi)Ｐ?，將團 隊優(yōu)勢挖掘出來，此為本項目的組織特色。 4）可行性分析： 本研究團隊集結(jié)了國內(nèi)在“分子 組織 層次以及免疫學(xué)、 細胞分子生物學(xué)及發(fā)育生物學(xué)等相 關(guān)領(lǐng)域中具有較好積累和特色實力的研究人 員。參與本項目的學(xué)術(shù)骨干在 J , J J 國際主流學(xué)術(shù)雜志上發(fā)表00 余篇。參與本項目的科學(xué)家一直活躍在本領(lǐng)域的科研前沿及積累了大量前期工作的基礎(chǔ)（請見工作基礎(chǔ)部分）。我們相信，通過學(xué)科交叉、優(yōu)勢互補、平臺共享、協(xié)力攻關(guān)，在以下幾方面取得重大進展是可行的。 1）通過 基因斑馬魚報告系統(tǒng)及實驗室已建立的其它研究體系，在 發(fā)現(xiàn)重要調(diào)控胸腺上皮細胞干細胞和其發(fā)育的基因及理解其發(fā)育機制方面取得突破的可能性大。 2）利用業(yè)已建立的髓質(zhì)區(qū) T 細胞發(fā)育研究體系， 探索 胸腺上皮細胞功能 的影響，并揭示 陷導(dǎo)致胸腺細胞發(fā)育異常的機理和病理生理意義。工作基礎(chǔ)堅實、推論合理、研究方案切實可行 ,取得突破的可能性大。 3）項目所需關(guān)鍵造血干細胞及淋巴細胞轉(zhuǎn)基因斑馬魚報告系（ FP、制備并獲得一些初步結(jié)果。因此，在確定造血干細胞發(fā)生及向淋巴細胞系發(fā)育中重要調(diào)控基因方面取得重大突破的可能性大。 4）通過酵母雙雜交和 術(shù)，已發(fā)現(xiàn)一些參與免疫細胞活化的重要因子，因 此在探討天然免疫細胞成熟及功能分化方面取得突破性進展的可能性大。 5）運用進化基因組學(xué)分子手段發(fā)現(xiàn)新基因功能，以結(jié)構(gòu)和功能進化為導(dǎo)向確立 免疫系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵蛋白 /多肽的功能表位方面取得重要進展的可能性大，獲得免疫發(fā)育相關(guān)藥物先導(dǎo)的可能性大。 四、年度計劃 年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 1）建立 色熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚報告系統(tǒng)；應(yīng)用此系統(tǒng)初步篩選對胸腺發(fā)育起重要作用的部分基因。 2）應(yīng)用生物工程技術(shù)改造小鼠、移植動物模型及細胞分子生物學(xué)研究手段，研究候選基因（ 如 ）、 路、 胸腺上皮細胞干細胞及胸腺上皮細胞發(fā)育的作用及初步調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 3）通過基因芯片等分子生化技術(shù)，初步篩選胸腺上皮細胞中作用的下游基因 /靶基因譜。 4）初步確定 胸腺髓質(zhì)上皮細胞分化和功能的影響并確定其分子機制。 5）證實 端粒 關(guān)蛋白 胸腺及免疫細胞衰老過程中的作用及其與端粒動力學(xué)相關(guān)性。 6）建立胸腺上皮細胞及其干細胞分離、鑒定及定量分析的方法技術(shù)。 7）利用已有的不同基因缺陷小鼠（ 剔除小鼠）及疾病模型（感染、移植、肝炎等），初步研究 T 細胞亞群 (節(jié)性 T 細胞等 )分化的重要調(diào)節(jié)分子及其機制。 8) 培 育 出 -/ 的小鼠。 9)運用人的 庫，通過人的初步確定 胸腺髓質(zhì)上皮細胞分化和功 能的影響并確定其分子機制 。 初步篩選 胸腺上皮細胞中作用的下游基因 /靶基因譜。 證實 端粒 關(guān)蛋白 初步研究免疫細胞亞群 (特別是 節(jié)性 T 細胞等 )分化的重要調(diào)節(jié)分子。 確立三種模式動物免疫發(fā)育相關(guān)的候選基因，并完成相關(guān)的進化研究。 完成 錄因子 和野生型和三種不同血細胞突變體斑馬魚( 胎發(fā)育不同時期中的時空表達圖譜 。 在主流雜志上發(fā)表 論文至少6 篇。 年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 10） 參與果蠅天然免疫調(diào)控相關(guān)新基因的遺傳和生化篩選。 11) 完成 錄因子 和 胎發(fā)育不同時期中的時空表達圖譜 。 12) 構(gòu)建新 錄因子相應(yīng)的 達載體；設(shè)計并開展相關(guān)基因的反義寡聚核苷酸 驗。 13) 開展小規(guī)模的 學(xué)誘變，初步篩選一批影響胸腺和 T 細胞發(fā)生的突變體。 14) 進行相關(guān) 基因進化分析。確立三種模式動物免疫發(fā)育相關(guān)的候選基因，并完成相關(guān)的進化研究。建立和完善本課題相關(guān)的各種技術(shù)平臺。 第 二 年 1）進一步憑借 色熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚報告系篩選對胸腺發(fā)育發(fā)育起重要作用的部分基因。 2）應(yīng)用生物工程技術(shù)改造小鼠、移植動物模型及細胞分子生物學(xué)研究手段，較深入研究候選基因（如 ）、 路 等在胸腺上皮細胞干細胞及胸腺上皮細胞發(fā)育、衰老的作用及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 3）確定 胸腺髓質(zhì)上皮細胞分化和功能的影響并確定其分子機制。 獲得一批對造血、胸腺、免疫細胞發(fā)育有影響的基因 。 初步構(gòu)建較系統(tǒng)的造血干細胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模式圖。 分析 端粒 關(guān)蛋白 獲得 相關(guān) 基因進化表位的基礎(chǔ)數(shù)據(jù) ，得到初步結(jié)論。 在主流雜志上發(fā)表論文至少年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 4）系統(tǒng)分析 端粒 關(guān)蛋白 胸腺及免疫細胞衰老過程中的生物作用及其與端粒動力學(xué)相關(guān)性。 5）進一步利用不同基因 缺陷小鼠，研究這些基因在 T 細胞亞群 (節(jié)性 T 細胞等 )分化的可能作用及其調(diào)控機制。 6） 對候選 基因進行初步的功能分析。 7） 利用 基因和雙基因剔除小鼠，初步探討 徑在免疫細胞發(fā)育中的作用以及它們的協(xié)同作用機制。 8) 開展功能缺失和過量表達實驗 ，確定 闡明其與其它相關(guān)主控基因的上位關(guān)系 。 9) 完成中小規(guī)模的 學(xué)誘變，確定一批影響胸腺和 T 細胞發(fā) 育 的重要 斑馬魚 突變體。 10) 預(yù)測重要相關(guān)蛋白的進化表位 ； 基因克隆，表達載體構(gòu)建和重組蛋白的生產(chǎn)方案的優(yōu)化。 11） 獲得進化表位的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)?？寺∠嚓P(guān)的基因并選擇不同的表達載體優(yōu)化表達和純化方法。 10 篇。 第 三 1）建立 1生物工程技術(shù)改造小鼠，確定1對胸腺上皮細胞 及胸 腺細胞 分化和功能具有重要影響的新功能基因。 2）較深入研究 幾個 候選基因在胸腺上皮細胞確定 1對胸腺髓質(zhì)上皮細胞發(fā)育和功能具有重要影響的新功能基因。 確定造血干細胞在斑馬魚胚年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 年 干細胞及胸腺上皮細胞發(fā)育的作用及調(diào)控分子網(wǎng)絡(luò)。 3） 完成利用不同基因基因缺陷小鼠，研究這些基因在 T 細胞亞群 (節(jié)性 T 細胞等 )分化的可能作用及其調(diào)控機制。 4 ） 檢測 -/雙基因敲除小鼠的細胞亞群，炎性因子的變化及組織病理變化。 5） 深入探討 條途徑在免疫細胞發(fā)育中的作用以及它們的協(xié)同作用機制 6） 主要利用敲除、干擾或過量表達 等方法初步分析目的 免疫細胞發(fā)育過程中的調(diào)控作用 。 7） 確定造血干細胞在斑馬魚胚胎時期的起源、發(fā)育分化和遷移路線。 8）完成構(gòu)建較系統(tǒng)的造血干細胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模式圖，并闡明 錄因子在血液發(fā)生、保持和淋系分化中的分子機制。 9）開展定位克隆影響造血干細胞、 T 淋巴細胞及胸腺發(fā)育的重要突變體 /基因。 10） 運用反向 法完成丙氨酸突變體重組表達載體的構(gòu)建， 確定相關(guān)蛋白的 重要 功能 位點 。 胎時期的 起源、發(fā)育分化和遷移路線。 完成構(gòu)建較系統(tǒng)的造血干細胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模式圖 。 明確 1對免疫細胞亞群發(fā)育有重要作用的調(diào)節(jié)通路。 明確 1對免疫細胞亞群發(fā)育有重要作用的分子表位特征及進化特點。 在主流雜志上發(fā)表論文至少15 篇。 年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 四 年 1）建立目的基因缺失小鼠，證實 1對胸腺發(fā)育具有重要影響的新功能基因。 2）較深入研究候選基因在胸腺上皮細胞干細胞及胸腺上皮細胞發(fā)育