10 227生物肥料的基礎(chǔ)上，對(duì)其中的根瘤菌肥料部分進(jìn)行修改主要修改內(nèi)容如下:增加定義、抽樣和判定規(guī)則部分;增加菌種部分，包括菌種有效性、菌體特性特征、菌落形態(tài);刪除成品無(wú)害化指標(biāo)。因?yàn)楦鼍柿弦话阋圆萏繛檩d體，而且每公頃每年僅用7507 500 存在重金屬的危害。草炭經(jīng)高溫滅菌后，大腸菌群和蛔蟲(chóng)卵不再存活。本標(biāo)準(zhǔn)自實(shí)施之日起，同時(shí)代替 227標(biāo)準(zhǔn)的附錄標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:農(nóng)業(yè)部微生物肥料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:寧國(guó)贊、劉惠琴、馬曉彤、葛誠(chéng)、李俊。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)根瘤菌肥料10術(shù)要求、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則、標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸及貯存。本標(biāo)準(zhǔn)適用于以共生固氮性能優(yōu)良的根瘤菌菌株為生產(chǎn)用菌經(jīng)液體發(fā)酵生產(chǎn)而成的根瘤菌液體肥料，菌液以持水性能良好的載體為吸附劑制成的根瘤菌固體肥料;也適用于以根瘤菌為主的含有能促進(jìn)結(jié)瘤、固氮作用的芽胞桿菌、假單胞菌或其他有益的促生細(xì)菌制成的復(fù)合根瘤菌肥料。2引用標(biāo)準(zhǔn)下列標(biāo)準(zhǔn)所包含的條文，通過(guò)在本標(biāo)準(zhǔn)中引用而構(gòu)成為本標(biāo)準(zhǔn)的條文。本標(biāo)準(zhǔn)出版時(shí)，所示版本均為有效。所有標(biāo)準(zhǔn)都會(huì)被修訂，使用本標(biāo)準(zhǔn)的各方應(yīng)探討使用下列標(biāo)準(zhǔn)最新版本的可能性。 654311豆科作物結(jié)瘤、固氮的接種劑。人少量能促進(jìn)結(jié)瘤、固氮作用的芽胞桿菌、假單胞細(xì)菌或其他有益的促生微生物的根瘤菌肥料，稱為復(fù)合根瘤菌肥料。加人的促生微生物必須是對(duì)人畜及植物無(wú)害的菌種。4產(chǎn)品分類4門(mén)按形態(tài)不同，分為液體根瘤菌肥料和固體根瘤菌肥料。42以寄主種類的不同，分為菜豆根瘤菌肥料、大豆根瘤菌肥料、花生根瘤菌肥料、三葉草根瘤菌肥料、豌楷根瘤菌肥料、百脈根根瘤菌肥料、紫云英根瘤菌肥料和沙打旺根瘤菌肥料等5技術(shù)要求5門(mén)菌種5嘴門(mén)菌種的有效性用于生產(chǎn)根瘤菌肥料的菌種系屬于根瘤菌屬(慢生根瘤菌屬(固氮根瘤菌()、中慢生根瘤菌(等各屬中的不同的根瘤菌種，這些菌種必須是經(jīng)過(guò)鑒定的菌株，或有二年多點(diǎn)田向試驗(yàn)獲得顯著增產(chǎn)的菌株該菌種必須在菌肥生產(chǎn)前一年內(nèi)經(jīng)無(wú)氮營(yíng)蕎液盆栽接種試驗(yàn)鑒定，結(jié)瘤固氮性能優(yōu)良，接種植株干重比對(duì)照顯著增加。10芽胞，革蘭氏染色陰性。緣整齊、稍突起，在含有剛果紅的甘露醇一酵母培養(yǎng)基平板上呈乳白色或無(wú)色半透明。表1)表1液體根瘤菌肥料技術(shù)指標(biāo)項(xiàng)目指標(biāo)備注外觀、氣味 乳白色或灰白色均勻混濁液體或稍有沉淀。無(wú)酸臭氣味根瘤菌活菌個(gè)數(shù),108/(502 用耐酸菌株生產(chǎn)的菌液，2寄主結(jié)瘤最低稀釋度10此項(xiàng)僅在監(jiān)督部門(mén)或仲裁檢驗(yàn)雙方認(rèn)為有必要時(shí)才檢測(cè)有效期，月3 固體根瘤菌肥料(見(jiàn)表2)表2固體根瘤菌肥料技術(shù)指標(biāo)項(xiàng)目指標(biāo)備注外觀、氣味 粉末狀、松散、濕潤(rùn)無(wú)霉塊，無(wú)酸臭味，無(wú)霉味水分含量，%2501/g2. 0雜菌率，腸(02吸附劑顆粒細(xì)度大粒種子(大豆、花生、豌豆等)用的菌肥，通過(guò)孔徑。粒種子(三葉草、首楷、紫云英)用的菌肥通過(guò)孔徑0. 15 主結(jié)瘤最低稀釋度10 s 此項(xiàng)僅在監(jiān)督部門(mén)或仲裁檢驗(yàn)雙方認(rèn)為有必要時(shí)才檢測(cè)有效期，月)6 此項(xiàng)僅在監(jiān)督部門(mén)或仲裁檢驗(yàn)雙方認(rèn)為有必要時(shí)才檢測(cè)6抽樣按每一發(fā)酵罐菌液制成的產(chǎn)品為一批，按批抽樣檢驗(yàn)。抽樣過(guò)程要嚴(yán)格避免雜菌污染。6塑料瓶)、金屬勺、剪刀、封口機(jī)(或封口膠帶)、牛皮紙封樣袋、標(biāo)簽、抽樣封條和膠水。10“:.:”形分層設(shè)點(diǎn)抽取，抽樣以件為單位，小包裝產(chǎn)品以一包裝箱為一件。大包裝(3050 品以一袋(或一桶)為一件。抽樣件數(shù)由樣品基數(shù)的大小確定。1部抽樣。11，抽樣10件;201取20件。樣品基數(shù)大于400件，按超過(guò)部分的2%增加抽樣件數(shù)?？偧?shù)不超過(guò)40件。每件小包裝產(chǎn)品抽取一小袋，在無(wú)菌條件下每袋取樣200 g。將所有樣品混勻，按四分法縮到2 000 g，分裝4袋，然后封口。每2袋為一份裝人牛皮紙封樣袋。最后貼上抽樣標(biāo)簽和抽樣封條(液體根瘤菌肥小包裝產(chǎn)品抽樣參照此法進(jìn)行)。所抽樣品一份留存被抽樣單位，一份交檢測(cè)中心檢測(cè)。菌落計(jì)數(shù)器;恒溫培養(yǎng)箱;恒溫干燥箱;恒溫?fù)u床;滅菌鍋;無(wú)菌室或超凈工作臺(tái);酸度計(jì);溫室或植物光照培養(yǎng)箱:植物葉面光照強(qiáng)度大于8 000 度控制范圍20 ;試管:015 150 180 養(yǎng)皿:直徑9 角瓶:500 菌吸管:1,2,5,10 璃刮刀;濾紙;酒精燈;標(biāo)準(zhǔn)篩:孔徑0. 18 15 號(hào)羊毛畫(huà)筆;無(wú)菌水;無(wú)離子水。紅;碘液;95%酒精。,H06) 5 ,H,O) 5 59磷酸氫二鉀(3 0. 5 7H,O) 0. 2 10 O l .1 a,2H,0)溶液1 H,O)溶液1 1;0,)1溶液1 ,)1 果紅(S, l%溶液2. 5 20 00 ml,霉菌數(shù))磷酸二氫鉀(7H,O) 0. 5 ,H,O,H,O) 10. 0 ) 0.5 加拉紅酒精(無(wú)水)溶液3.3 00 H, 0. 22 155 7H,O) 50 7H,O) 0. 25 5 0. 25 , a,2H,O )。,O,，) 30 30 0 00 7,行感官檢驗(yàn)。在白色搪瓷盤(pán)中，將液體根瘤菌肥料搖勻。三次測(cè)定結(jié)果的平均數(shù)。固體根瘤菌肥料的50 人菌肥25 g，無(wú)離子水25 三次測(cè)定結(jié)果的平均數(shù)。10份20. 00 g,精確到0. 01 g，放人已稱恒重的鋁盒中。置h,移至卻后稱重。根據(jù)烘干前后質(zhì)量差按式(1)計(jì)算含水量。取三個(gè)樣品測(cè)定數(shù)的平均值。平行樣品絕對(duì)偏差應(yīng)低于1%0含水量(%)二 m X 100。.，.，(1)陰0式巾!/I。一一烘干前樣品質(zhì)量，9;m烘千后樣品質(zhì)量，9。g)，置于標(biāo)準(zhǔn)篩中(直徑分別為0. 18 5 用水沖洗，用毛筆輕刷。至粉末不再通過(guò)為止。將篩余物置105溫度下烘干，稱重。篩余物百分含量按式2)計(jì)算:篩余物(%)=蜓蘭量宣盛魚(yú)亙分塑樣品質(zhì)量，-(2)6. 1制作根瘤菌培養(yǎng)基平板(馬丁培養(yǎng)基平板(2. 3)確到。01 g),裝人帶玻璃珠及100 檢樣品為液體，則取10 置搖床振蕩20 速200 r/體樣品稀釋至10從最后三個(gè)濃度懸液中各取0. 1 至直徑為9 個(gè)稀釋度重復(fù)三次。25溫度下培養(yǎng)3同樣方法將10-,稀釋度菌懸液。1 8h,別根瘤菌菌落與雜菌菌落。必要時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色(方法見(jiàn)附錄A)區(qū)分根瘤菌菌落和其他菌落。取菌落3。一3加的平板計(jì)數(shù)。算出三個(gè)重復(fù)的根瘤菌及雜菌菌落平均數(shù)。雜菌是指樣品所含有效活菌(包括根瘤菌及促生細(xì)菌)以外的其他種類微生物的總稱雜菌總數(shù)是馬丁培養(yǎng)基上出現(xiàn)的霉菌數(shù)與根瘤菌培養(yǎng)基上出現(xiàn)的雜菌數(shù)(霉菌除外)之和。根瘤菌數(shù)按式(3)計(jì)算，雜菌率按式(4)計(jì)算:.二菌落平均數(shù))=雜菌總數(shù)根瘤菌數(shù)+雜菌總數(shù)只100.。，.一(4)7. 2 7稀釋結(jié)瘤檢驗(yàn)寄主植物種子用0工%升汞溶液表面消毒后催芽，種芽長(zhǎng)1一2時(shí)用供試樣品的10-.10-稀釋度的懸液接種，植于試管瓊脂斜面上。設(shè)不接種的陰性對(duì)照和接種已知菌的陽(yáng)性對(duì)照。重復(fù)6次。植物培養(yǎng)溫度2025C，植物葉面光照強(qiáng)度大于8 000 天光照12 0空白對(duì)照結(jié)瘤，試驗(yàn)需要重做。以進(jìn)行判定。在10-稀釋度中70%按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)標(biāo)明的使用量對(duì)寄主進(jìn)行接種試驗(yàn)(活菌數(shù)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求或70%植株結(jié)瘤為有效期合格。102. 1或5. a)5. 2. 2)所規(guī)定的技術(shù)指標(biāo)的產(chǎn)品為合格產(chǎn)品;b)雜菌率不符合指標(biāo)，但液體樣品雜菌率不超過(guò)10 體樣品雜菌率不超過(guò)200o，在10他各項(xiàng)指標(biāo)符合，也可判為合格產(chǎn)品;c)在分、吸附劑顆粒細(xì)度、外觀和氣味等次要檢測(cè)項(xiàng)目中，有兩項(xiàng)不符合技術(shù)指標(biāo)，但活菌數(shù)及雜菌率符合指標(biāo)要求，也可判為合格產(chǎn)品。8a)根瘤菌活菌數(shù)不符合技術(shù)指標(biāo)，判為不合格產(chǎn)品;b)液體樣品雜菌率超過(guò)10%,固體樣品雜菌率超過(guò)200o，判為不合格品;c)在10d)小粒種子用的根瘤菌肥，吸附劑通過(guò)孔徑。. 15 0%，判為不合格產(chǎn)品。3含有芽胞桿菌或假單胞桿菌等促生細(xì)菌的根瘤菌肥料產(chǎn)品檢測(cè)時(shí)，芽胞桿菌和假單胞桿菌的判斷按產(chǎn)品企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)提供的依據(jù)進(jìn)行。9包裝、標(biāo)識(shí)、包裝用塑料桶。固體肥料用不透明聚乙烯塑料袋包裝。箱質(zhì)量應(yīng)符合 6543要求。箱外用尼龍打包帶加固。)產(chǎn)品中附有產(chǎn)品合格證和使用說(shuō)明書(shū)，在使用說(shuō)明中標(biāo)明使用方法、用量及注意事項(xiàng)。)上印有產(chǎn)品名稱、商標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)、肥料登記證號(hào)、生產(chǎn)單位、廠址、生產(chǎn)日期、批號(hào)和凈重，并印有防曬、防潮、防凍等標(biāo)記，若有必要還要加印易碎、防倒置等標(biāo)記。內(nèi)包裝上有產(chǎn)品名稱、商標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)、肥料登記證號(hào)、有效菌含量、生產(chǎn)日期、有效期、產(chǎn)品性能、使用說(shuō)明書(shū)及生產(chǎn)單位、如:用大豆根瘤菌生產(chǎn)的肥料，其產(chǎn)品名稱為大豆根瘤菌肥料。119. Y 410準(zhǔn)的附錄)革蘭氏染色革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌與革蘭氏染色陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁，對(duì)結(jié)晶紫一碘復(fù)合物的滲透性不同，而形成染色陽(yáng)性或染色陰性反應(yīng)1結(jié)晶紫液(赫克爾液:結(jié)晶紫2500) 20 、乙液相混合，靜置48 染液較穩(wěn)定，在不透氣的暗色瓶中可儲(chǔ)存數(shù)月。2盧哥(碘液碘(l)片1 I) 2 3-5 餾水溶解碘化鉀，再投人碘片，待碘全溶后，加水稀釋。此染液穩(wěn)定，在不透氣的暗色瓶中可存數(shù)月。3脫色液(95%的乙醇)0番紅水溶液)取2. 5 于100 番紅酒精溶液20 人80 成。番紅水溶液。端注明日期、片號(hào)。在載片上的每個(gè)格內(nèi)滴一小滴無(wú)菌水或蒸餾水。用接種環(huán)挑取少許菌苔，于水滴邊緣輕輕涂幾自然風(fēng)干或微熱促其快干，干后在火焰上通過(guò)1固定涂片。蓋約1 水沖凈結(jié)晶紫液。滴加碘液沖去殘水。并覆蓋約1 片上水甩凈或用濾紙吸干。將片傾斜，并襯以白背景，流滴95%酒精液約20s。立即用水沖凈酒精。用番紅液染1更長(zhǎng))濾紙吸干表面水或風(fēng)干，備鏡檢。色為革蘭氏染色陰性，藍(lán)紫色為革蘭氏染色陽(yáng)性。染色成功與否，很大程度上取決于經(jīng)驗(yàn)。在沒(méi)有把握時(shí)，最好在同一載玻片L，涂片和脫色兩步最為重要。涂片切不可過(guò)于濃厚。對(duì)于易于乳化的細(xì)菌，將沾有菌苔的接種環(huán)在水滴邊緣輕輕涂一二下即可。鏡檢時(shí)，以分散開(kāi)的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)。過(guò)于密集的細(xì)菌，常常呈假陽(yáng)性。對(duì)純細(xì)菌的涂片，以95%乙醇脫色易于掌握。乙醇中含有更多的水分，則脫色力加強(qiáng)，易形成假陰性。要盡量減少載玻片上的殘水。只是甩凈或用乙醇沖去殘水，以脫色20 濾紙吸凈殘水，可用乙醇脫色近305。載玻片不燙手為宜。過(guò)熱會(huì)使染色反應(yīng)不正確實(shí)際上對(duì)斜面純細(xì)菌涂片，風(fēng)干后