中華人民共和國國家標準0132013013本標準代替 997嬰幼兒配方食品和乳粉 膽堿的測定。本標準與 997相比，主要變化如下：修改了標準的名稱；修改了用于酶反應的顯色劑成分；增加了第二法雷氏鹽分光光度法。0131食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定1 范圍本標準規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定方法。本標準適用于嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定。第一法 酶比色法2 原理試樣中的膽堿經(jīng)酸水解后變成游離態(tài)的膽堿，再經(jīng)酶氧化后與顯色劑反應生成有色物質(zhì)，其顏色的深淺在一定濃度范圍內(nèi)與膽堿含量成正比。3 試劑和材料注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為6682規(guī)定的三級水。羥甲基氨基甲烷(酚(鹽酸 (氧化鈉(堿氧化酶：置于存。氧化物酶：置于28保存。11。脂酶D：置于存。酸(1 )：量取85 鹽酸(3 )：量取125 ）：1 蒸餾水定容至1000溶液在4冰箱中可保存一個月。于酶反應的顯色劑：取100120活力單位的膽堿氧化酶、250280活力單位的過氧化物酶、75個100個活力單位的磷脂酶D、15 0 用時配制。氧化鈉溶液(500g/L)：稱取500于水并稀釋至1000 準品膽堿酒石酸氫鹽標準品（純度99%。堿氫氧化物標準貯備溶液（稱取在1022烘至恒重的膽堿酒石酸氫鹽523蒸餾水稀釋至刻度。冷藏于42冰箱中，保存不超過1周。堿氫氧化物標準工作溶液（250g/水稀釋至刻度。臨用時配制。4 平：溫水浴鍋：溫度可控制在702和372。4.3 光光度計。5 體試樣稱取5 g（合均勻的試樣，于100 入30 ）。體試樣稱取20 g（合均勻的試樣，于100 入10 ）。解將裝有試樣的容器放在70水浴中，加塞混勻，水解3 h（每隔30冷卻。入50 蒸餾水定容至刻度。濾過濾水解液（濾液應是澄清的，否則，液放在4的冰箱中可以保存3 d。準曲線的制作分別吸取2 蒸餾水稀釋至刻度。準備6支試管，一個試管用作試劑空白（A），另五支試管由1至5編號，分別用于標準溶液和標準溶液的四個稀釋度。按表1加入試劑。0133表1 制作標準曲線時的試劑添加量 單位為毫升試劑 管A 管1 管2 管3 管4 管5稀釋度1/（50g/ 稀釋度2/（100g/ 稀釋度3/（150g/ 稀釋度4/（200g/ 標準溶液/（250g/ 發(fā)色劑 勻，把試管置于37水浴中保溫反應15 試樣的測定將每個試樣準備2支試管（B，C），按表2加入試劑。表2 測定試樣時的試劑添加量 單位為毫升試劑 試管管發(fā)色劑 勻。把試管置于37水浴中保溫反應15 比色測定將試樣及標準系列溶液從水浴中取出，冷卻至室溫。在波長505蒸餾水作空白，測定吸光值。以膽堿標準溶液的濃度為橫坐標，以標準溶液的吸光值減去試劑空白的吸光值為縱坐標，制作標準曲線。6 吸光值的計算通常新鮮配制的試劑會產(chǎn)生輕微顏色，且由于水解作用濾液也不是無色的，為了除去這些干擾因素，應該從總吸光值中減去各自的空白值（管試樣凈吸光值計算如公式（1）所示： （1）式中：A 試樣凈吸光值；總吸光值（管C）；試劑吸光值（管A）；濾液吸光值（管B）。對于標準曲線，0。堿含量的計算在標準曲線上查出凈吸光值的位置，并記下相應的濃度c，以每100 ），單位為（00g），試樣中的膽堿氫氧化物含量按公式（2）計算：1000100 （2）式中：X試樣中的膽堿氫氧化物含量，單位為毫克每百克（00g）；c自標準曲線上查得的膽堿氫氧化物的濃度，微克每毫升（g/V水解液被稀釋的體積（通常為50單位為毫升（m 試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；1000換算系數(shù)。計算結(jié)果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留整數(shù)位。7 精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的8%。8 其他方法檢出限為1 00g，定量限為300g。第二法 雷氏鹽分光光度法9 原理試樣中的膽堿用氫氧化鋇弗羅里硅土層析凈化，與雷納克銨鹽溶液形成粉紅色的膽堿雷納克銨鹽，用丙酮溶解洗脫，于526 一定濃度范圍內(nèi)，膽堿雷納克銨鹽顏色的深淺與其含量成正比。10 試劑和材料注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為6682規(guī)定的三級水。羅里硅土：100目200目，650活化。醇（氯甲烷（氧化鋇H）28乙酸（酸甲酯（酮(納克銨鹽(和氫氧化鋇取6 放入超聲波中溶解后，加入10 勻。乙酸+10)：1體積冰乙酸與10體積甲醇混合。納克銨鹽溶液：入10 入超聲波中溶解后過濾，臨用時配制。準品膽堿酒石酸氫鹽(純度99%。準溶液配制膽堿酒石酸氫鹽標準溶液(1 g/L)：準確稱取在1022g，用蒸餾水定容至100藏于42冰箱中，保存不超過一周。11 平：流裝置：250溫水浴鍋：溫度可控制在792。析柱：長約10 徑1光光度計。12 樣制備稱取固體試樣10 g(稱取液體試樣20 g(磨口錐形瓶中，加入50 合均勻后接入回流裝置，于792的水浴鍋內(nèi)水解抽提4 h。每隔1 避免試樣結(jié)塊。水解抽提結(jié)束后，取出錐形瓶冷卻至室溫，過濾。濾渣用冰乙酸次，洗液一并收集于100甲醇定容至刻度，混勻。析柱制備用乳膠管連接層析柱與滴頭，用少量脫脂棉堵住層析柱底部，倒入約5 甲醇浸濕，備用。析分別吸取膽堿標準溶液0 .0 .0 溶液完全進入柱床后，依次用5 0加入5適量的冰乙酸洗去過量的雷納克銨鹽，直至層析柱上無雷納克銨鹽附著處呈現(xiàn)硅土原有的白色。用丙酮洗脫粉紅色的膽堿雷納克銨鹽，收集于10丙酮定容（在波長526膽堿酒石酸氫鹽含量為橫坐標（吸光值為縱坐標繪制標準曲線。0136吸取10層析柱中，其余操作按照 標準曲線上查得103 分析結(jié)果的表述試樣中的膽堿以膽堿氫氧化物計，以毫克每百克（00g）表示，按公式（3）計算： x （3）式中：X試樣中膽堿氫氧化物的含量，單位為毫克每百克（00g）；m試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；V層析時吸取試樣水解液的體積，單位為毫升（從標準曲線上查得膽堿酒石酸氫鹽的含量，單位為毫克