ABSTRACTOBJECTIVETOSTUDYTHEEFFECTSOFINTEGRINANDENDOGENEOUSGANGLIOSIDESON21INVASIONANDMIGRATIONOFSKNSHNEUROBLASTOMANBCELLSANDTOEXPLORETHERELATIONSHIPOFENDOGENEOUSGANGLIOSIDESANDINTEGRININTHEINVASIONAND21MIGRATIONOFTHESKNSHCELLSMETHODSNBSKNSHCELLLINEWASCULTUREDINTHEMODIFIEDEAGLESMEDIUMWITHORWITHOUTTHEPRESENCEOF10MDTHREO1PHENYL2DECAOLAMINO3MORPHINOLINE1PROPANOL,DPDMP,ANINHIBITOROFGLUCOSYLCERAMIDESYNTHASEINCLINEDTESTANDPOLYCARBONATEFILTERSINCORPORATEDINMODIFIEDTRANSWELLCHAMBERSWEREUSEDTOINVESTIGATEEFFECTSOFMONOCLONALANTIBODIESTOINTEGRIN,INTEGRINANDREPLETIONOF21GD2,THEMAJORENDOGENEOUSGANGLIOSIDESONTHEMIGRATIONANDINVASIONOFTHESKNSHCELLSRESPECTIVELYTHECELLSWERESTAINEDWITHGIMSADYEANDCOUNTEDUNDER200MULTIPLEDMICROSCOPE,CALCULATEDTHEBLOCKINGRATIOSOFINVASIONANDMIGRATIONRESULTSTHEMIGRATIONOFTHESKNSHCELLSWASSIGNIFICANTLYBLOCKEDBYANTIOR2ANTIMONOCLONALANTIBODIESCOMPAREDWITHTHECONTROLCELLSWITHOUTTHE1MONOCLONALANTIBODIES987,THENUMBERSOFCELLSWERE5111AND549RESPECTIVELYP001THEBLOCKINGRATIOOFMIGRATIONWAS480AND449RESPECTIVELYMEANWHILE,THEINVASIONOFTHESKNSHCELLSWASREMARKABLYBLOCKEDBYANTI254ORANTI194MONOCLONALANTIBODIESCOMPAREDWITHTHE21CONTROL425ASWELLP001THEBLOCKINGRATIOOFINVASION405AND548RESPECTIVELYAFTERDEPLETIONOFTHECELLGANGLIOSIDESBYDPDMP,BOTHTHEMIGRATION5512ANDINVASION348OFTHECELLSDECREASEDSIGNIFICANTLYCOMPAREDTOTHECONTROL10912,525P001GANGLIOSIDEGD2WASABLETORECOVERTHECAPABILITIESOFTHEMIGRATION10110ANDINVASION454OFTHESKNSHCELLSEXPOSEDTODPDMP,BUT,THESECAPABILITIESWEREBLOCKEDBYANTIANDANTI21IICONCLUSIONSOURRESULTSSUGGESTEDTHATBOTHINTEGRINANDENDOGENOUS21GANGLIOSIDESOFNEUROBLASTOMACELLPROMOTEINTHEINVASIONANDMIGRATIONOFNEUROBLASTOMACELLSINVITROENDOGENOUSTUMORGLSMAYPLAYANIMPORTANTROLEINTHEMETASTASISOFNEUROBLASTOMABYREGULATINGFUNCTIONOFINTEGRIN21KEYWORDSNEUROBLASTOMAINTEGRINGANGLIOSIDESINVASIONMIGRATION21III目錄中文摘要英文摘要目錄1前言111NB的發(fā)病特點(diǎn)及臨床治療現(xiàn)狀112整合素與腫瘤的發(fā)生發(fā)展213GLS與腫瘤發(fā)生發(fā)展314課題的研究意義42材料與方法521實(shí)驗(yàn)材料MATERIALS522實(shí)驗(yàn)方法METHODS73實(shí)驗(yàn)結(jié)果RESULTS1331整合素對(duì)SKNSH細(xì)胞遷移侵襲的影響132132GLS對(duì)SKNSH細(xì)胞遷移侵襲的影響1533GLS與整合素在SKNSH細(xì)胞遷移侵襲中的關(guān)系17214討論DISCUSSIONS215結(jié)論26參考文獻(xiàn)REFERENCES28附錄32英文縮略詞表39在學(xué)期間發(fā)表論文清單40致謝41IV暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文1前言11NB的發(fā)病特點(diǎn)及治療現(xiàn)狀神經(jīng)母細(xì)胞瘤NEUROBLASTOMA,NB是兒童最常見(jiàn)的顱外神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤,年發(fā)病率大約1/10萬(wàn),其發(fā)病率僅次于白血病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。約80神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者5歲以下發(fā)病,高峰年齡35歲,部分病例有家族史,提示可能與遺傳因素有關(guān)。NB起源于神經(jīng)胚胎細(xì)胞,可發(fā)生于中樞或周圍神經(jīng),以周圍神經(jīng)多見(jiàn),發(fā)生部位主要見(jiàn)于腎上腺髓質(zhì)或腹部交感神經(jīng)節(jié)。NB有以下幾個(gè)臨床特點(diǎn)1臨床表現(xiàn)呈多樣性,給早期臨床診斷帶來(lái)一定的困難,往往容易誤診2腫瘤極易早期發(fā)生轉(zhuǎn)移,約70兒童患者在就診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移,錯(cuò)過(guò)早發(fā)現(xiàn),早治療的時(shí)機(jī)3病情進(jìn)展迅速,療效不佳,且易復(fù)發(fā)。目前針對(duì)NB治療多采用手術(shù)聯(lián)合大劑量細(xì)胞毒性藥物化療以及放療綜合治療方案,而且放療、化療等治療手段存在不同程度的副作用但無(wú)論采用何種治療療效均不理想,統(tǒng)計(jì)顯示神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒5年生存率尚不足10。NB細(xì)胞發(fā)病早期轉(zhuǎn)移及治療后微小病灶轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)亦一直是困擾醫(yī)務(wù)工作者的一大難題。因此有必要深入探究影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移的因素及其作用機(jī)制,應(yīng)用針對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制中某一特異位點(diǎn)的藥物,有效地阻斷腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程,從而改善NB患兒預(yù)后,提高其長(zhǎng)期生存率。許多研究提示腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是個(gè)多種因素、多個(gè)步驟、多階段的瀑布過(guò)程,是癌細(xì)胞侵犯和破壞周圍正常組織,進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng),遷移到特定組織器官并發(fā)展為繼發(fā)性癌灶的過(guò)程。腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的第一步就是腫瘤細(xì)胞間粘附因子的缺失所致個(gè)體細(xì)胞從原發(fā)腫瘤脫落游離,第二步細(xì)胞本身產(chǎn)生多種分解酶,可分解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜,腫瘤細(xì)胞侵入循環(huán)系統(tǒng),第三步是循環(huán)腫瘤細(xì)胞與脈管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞的粘附,這些13都是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。事實(shí)上腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程無(wú)不包含粘附和解離兩方面,細(xì)胞的粘附、脫粘附和遷移、侵襲是轉(zhuǎn)移的必要過(guò)程。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程如下圖所示1暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文細(xì)胞侵襲遷移過(guò)程示意圖細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附是通過(guò)受體來(lái)實(shí)現(xiàn)的,其中以整合素受體占主要比例。整合素作為細(xì)胞表面受體扮演細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的角色,將接受的信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)外傳遞。由于各種腫瘤細(xì)胞表面整合素種類不同,而各類整合素在腫瘤生長(zhǎng)的各個(gè)階段受外界調(diào)節(jié)因素不同,表達(dá)種類和表達(dá)水平也不同,使腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附處于一種動(dòng)態(tài)的可調(diào)節(jié)的狀態(tài),這對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有相輔相成的作用。諸多研究表明,不正常表達(dá)的整合素在腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要的作用。12整合素與腫瘤的發(fā)生發(fā)展整合素是一類細(xì)胞膜表面糖蛋白受體家族分子,是由和亞基通過(guò)非共價(jià)鍵連接構(gòu)成的二聚體分子。目前發(fā)現(xiàn)脊椎動(dòng)物受體家族包括至少17個(gè)亞單位和9個(gè)亞單位,共同4組成超過(guò)25種不同的整合素,其功能為介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)EXTRACELLULARMATRIX,ECM之間的相互粘附,雙向傳導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外與細(xì)胞外基質(zhì)之間分子信號(hào),在多種病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用,如淋巴細(xì)胞向炎癥部位的聚集及腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)等5調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、粘附、遷移、侵襲及調(diào)亡等過(guò)程,在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。整合素的不正常表達(dá)影響腫瘤惡性轉(zhuǎn)化、粘附和轉(zhuǎn)移。惡性轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞往往表現(xiàn)在整合素表達(dá)質(zhì)和量的改變,這種改變影響由整合素介導(dǎo)的信號(hào)途徑所涉及的調(diào)節(jié)功能,2暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文從而改變腫瘤細(xì)胞與相應(yīng)底物的粘附反應(yīng),特異信號(hào)的傳遞或誘導(dǎo)基因表達(dá),直接或間接6調(diào)控腫瘤細(xì)胞分化、增殖、凋亡、粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移。腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,有些整合素的出現(xiàn)提示細(xì)胞為惡性化增殖,并調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的過(guò)程。星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞相比,前者除和的表達(dá)水平提高,還有新表達(dá)的、和315V37,表現(xiàn)出對(duì)ECM分子親和力增強(qiáng),研究證明這種結(jié)合是通過(guò)整合素介導(dǎo)的。相反,51有些整合素被稱之為腫瘤抑制整合素,這些整合素在維持正常的細(xì)胞表型中發(fā)揮作用。用人整合素的轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢CHO細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)可抑制細(xì)胞與基質(zhì)的固定,降低細(xì)胞的51增殖,表明整合素在CHO細(xì)胞中的過(guò)量表達(dá)可抑制該類細(xì)胞在裸鼠中的成瘤性,而表518達(dá)水平下降的CHO細(xì)胞成瘤性增加,可見(jiàn),腫瘤細(xì)胞整合素改變可能直接或間接影響腫瘤細(xì)胞行為。整合素是細(xì)胞與I型膠原蛋白作用的功能性受體,亞基通過(guò)I區(qū)鏈接位點(diǎn)特異性識(shí)212別氨基酸序列ASPGLYGLUALADGEA選擇與膠原蛋白相結(jié)合,該序列不被其它整合素910和非整合素膠原蛋白受體所識(shí)別,表明該整合素有高度特異的作用目標(biāo)機(jī)制,亞基1可能通過(guò)其細(xì)胞內(nèi)片段與細(xì)胞骨架連接,參與細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)。整合素在多種不同腫21瘤化的細(xì)胞株中表達(dá)發(fā)生改變整合素在胰腺癌細(xì)胞中過(guò)度表達(dá),抗整合素抗體可21211阻止其與I型膠原蛋白的粘附能力黑色素細(xì)胞瘤中整合素的表達(dá)遠(yuǎn)高于原位性黑色2112素瘤,并且這種表達(dá)與黑色素瘤的轉(zhuǎn)移性增強(qiáng)呈正相關(guān)。這些證據(jù)提示整合素與腫21瘤的進(jìn)展有關(guān)。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是一個(gè)粘附、去粘附,遷移、侵襲的連續(xù)過(guò)程,細(xì)胞粘附13能力的改變是細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)之一,整合素亦在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中表達(dá)。以21往實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示整合素在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SKNSH細(xì)胞株中高表達(dá),并在SKNSH2114細(xì)胞與膠原蛋白的粘附中發(fā)揮重要作用因此有必要進(jìn)一步探討整合素與SKNSH21細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)系。131神經(jīng)節(jié)苷脂GANGLIOSIDES,GLS與腫瘤的發(fā)生發(fā)展研究表明腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力與以下因素密切相關(guān)1細(xì)胞表面糖蛋白復(fù)合物2細(xì)胞膜神經(jīng)節(jié)苷脂含量3細(xì)胞表面抗原表達(dá)4細(xì)胞表面酶活性5細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能15力。我們選擇性探討神經(jīng)節(jié)苷脂對(duì)SKNSH細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。神經(jīng)節(jié)苷脂GANGLIOSIDES,GLS為存在于細(xì)胞膜表面含唾液酸的酸性鞘糖脂,該分子嵌于細(xì)胞膜的外層,主要見(jiàn)于外胚層起源的組織黑色素細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞、星形細(xì)胞及肺等。位于細(xì)胞表面的GLS在正常情況下含量甚微,參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育,神經(jīng)生長(zhǎng)與修復(fù)等生理過(guò)程研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化時(shí),可能激活了包括GLS糖基轉(zhuǎn)化酶在內(nèi)的許多酶3暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文類,導(dǎo)致其表達(dá)的構(gòu)型和含量發(fā)生改變,并脫落進(jìn)入腫瘤微環(huán)境,直接或間接與靶細(xì)胞相互作用,在細(xì)胞分化、粘附、癌基因轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、以及細(xì)胞凋亡等方面均起作用,參與腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)展,是腫瘤細(xì)胞粘附過(guò)程中的候選調(diào)節(jié)分子。許多研究表明GLS作用于腫瘤形成和進(jìn)展,在腫瘤發(fā)生、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管形成、腫瘤免1617疫等諸多方面起著重要的作用腫瘤患者血清中GLS含量增多,并且與腫瘤的惡性程度18成正相關(guān),研究報(bào)道肝癌、卵巢癌、NB細(xì)胞瘤患者血清中雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GD濃度2明顯增高,且與還而疾病無(wú)進(jìn)展生存率呈負(fù)相關(guān)。這些研究表明神經(jīng)節(jié)苷在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此,有必要進(jìn)一步研究GLS在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中所起的作用。132GLS對(duì)整合素的調(diào)節(jié)研究提示神經(jīng)節(jié)苷脂對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的促進(jìn)作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)整合素功能而實(shí)現(xiàn)的。BARLETTA等的研究表明鼠肝癌細(xì)胞中神經(jīng)節(jié)苷脂對(duì)整合素介導(dǎo)的粘附有調(diào)節(jié)作用,用19藥理方法清除細(xì)胞GLS后細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力下降。神經(jīng)節(jié)苷脂調(diào)節(jié)整合素受20體的功能在控制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的粘附和侵襲方面發(fā)揮重要的作用。研究表明,神經(jīng)母21細(xì)胞瘤SKNSH細(xì)胞株含有高濃度的GLS,并促進(jìn)NB細(xì)胞粘附與膠原蛋白,其作用途徑12可能與整合素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。因此本研究欲進(jìn)一步研究GLS是否通過(guò)調(diào)節(jié)整合21素介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的作用,實(shí)現(xiàn)其影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移和侵襲21的功能。14本課題研究的意義整合素介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的粘附,侵襲和轉(zhuǎn)移,在腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用,同時(shí)神經(jīng)節(jié)苷脂可能通過(guò)調(diào)節(jié)整合素的表達(dá)及其功能實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié),因此,探究GLS和整合素在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲的關(guān)系和作用機(jī)制,以及二者之間是否21存在相互的作用關(guān)系,可為建立神經(jīng)母細(xì)胞瘤的生物治療方案提供理論支持。4暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文2材料與方法211實(shí)驗(yàn)材料1主要試劑培養(yǎng)基MEMGIBCO公司胎牛血清FBSHYCLONE公司丙酮酸鈉SIGMA公司胰蛋白酶TRYPSINSIGMA公司二甲亞砜DMSOSIGMA公司人工重構(gòu)基底膜材料MATRIGELSIGMA公司型膠原COLLAGENSIGMA公司葡萄糖苷神經(jīng)酰氨合成酶抑制劑DPDMPSIGMA公司胎牛血清白蛋白BSASIGMA公司抗人整合素單克隆抗體,ANTIAK7ABDSEROTEC公司22,神經(jīng)節(jié)苷脂GDBDPHARMINGEN公司2抗人整合素單克隆抗體,ANTI,4B7RNEOMARKERS公司112細(xì)胞株人腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤SKNSH細(xì)胞株ATCC號(hào)HTB11購(gòu)自上海細(xì)胞生物研究所3各種溶液的配制磷酸緩沖液PBSPH72NACL80GKHPO02G24NAHPO12HO29G242KCL02G三蒸水定容至100ML,高溫高壓滅菌,室溫保存細(xì)胞消化液稱取05G胰酶終濃度為025溶解于200ML滅菌的PBS溶液中,輕晃混勻后,于室溫靜置3H或者4過(guò)夜充分溶解后,過(guò)濾除菌分裝于小青瓶中,置20貯存。使用前室溫溶解后可預(yù)熱置37。5暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文NAHCO溶液稱取075G終濃度為075溶解于100ML三蒸水中,高壓高3溫滅菌后分裝于小青瓶中,配制細(xì)胞培養(yǎng)液時(shí)調(diào)PH用,常溫保存。細(xì)胞培養(yǎng)液取胎牛血清10ML,無(wú)菌1MMOL/ML丙酮酸鈉溶液1ML,青霉素鏈4霉素混合液05ML終濃度分別為5X10U/L,50MG/L,加入無(wú)菌MEM87ML溶液,輕晃搖勻,加無(wú)菌075碳酸氫鈉調(diào)節(jié)PH,置4貯存。細(xì)胞處理液取1MMOL/LDPDMP溶液10UL終濃度為10UMOL/L,胎牛血清10ML,無(wú)菌1MMOL/ML丙酮酸鈉溶液1ML,青霉素鏈霉素混合液05ML終濃度分別為45X10U/L,50MG/L,加入無(wú)菌87MLMEM溶液中,輕晃搖勻,加無(wú)菌075碳酸氫鈉調(diào)節(jié)PH,置4貯存。無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液取無(wú)菌1MMOL/ML丙酮酸鈉溶液1ML,青霉素鏈霉素混合液405ML終濃度分別為5X10U/L,50MG/L,加入無(wú)菌MEM溶液,輕晃搖勻,加無(wú)菌075碳酸氫鈉調(diào)節(jié)PH,置4貯存。姬姆薩濃縮染液將姬姆薩染粉38G放入純甘油250ML中,置60水浴2小時(shí),溶解后用60預(yù)熱的甲醇250M1混勻,于室溫、棕色瓶?jī)?nèi)保存,室溫長(zhǎng)期保存。使用時(shí)取姬姆薩溶液50M1,加PH65磷酸鹽緩沖液到500ML,混勻。此液為姬姆薩應(yīng)用液,可直接作涂片染色用。PH65磷酸鹽緩沖液磷酸二氫鉀15G,磷酸氫二鈉10G、加蒸餾水到5000ML。最后糾正PH65,配姬姆薩稀釋液時(shí)用。4主要儀器設(shè)備SWCJ2F型雙面超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備公司CO培養(yǎng)箱FORMA公司2倒置相差顯微鏡LEICADMIL公司多功能冷凍離心機(jī)THERMO公司高壓滅菌鍋上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠6暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文分析電子天平上海申安醫(yī)療器械廠225CM細(xì)胞培養(yǎng)瓶CORNING公司12孔細(xì)胞培養(yǎng)板BDPHARMINGEN公司TRANSWELLINSERT侵襲小室BDPHARMINGEN公司22實(shí)驗(yàn)方法221細(xì)胞培養(yǎng)的工作準(zhǔn)備在組織細(xì)胞培養(yǎng)中,體外細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)都非常敏感,這些物質(zhì)會(huì)影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng),包括微生物產(chǎn)品附帶雜物、上次細(xì)胞殘留物、非營(yíng)養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)等。需要清洗消毒的培養(yǎng)用品有玻璃器皿、橡膠塞及塑料制品。各種物品可按下方法處理玻璃器皿浸泡刷洗洗潔精烘干泡酸24H流水、單蒸水、雙蒸水分別沖洗烘干高溫濕熱滅菌,121,30MIN。橡膠,瓶塞等流水、單蒸水、雙蒸水分別沖烘干雙蒸水煮沸30MIN,烘干高溫濕熱滅菌,115,15MIN。212SKNSH細(xì)胞株細(xì)胞的復(fù)蘇及培養(yǎng)按照以下步驟操作1將細(xì)胞凍存管從80冰箱中取出,迅速放入預(yù)備好的37水浴箱中,并不停地震蕩,使其在12分鐘內(nèi)迅速完成復(fù)溫2以75酒精擦拭凍存管外部,移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)3將細(xì)胞凍存液移入離心管,加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液為凍存液的4倍體積,輕輕搖勻41000RPM離心3MIN,棄上清液5用細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕懸浮細(xì)胞,并計(jì)數(shù)細(xì)胞26將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入生長(zhǎng)面積為25CM的培養(yǎng)瓶中,加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液其中含104胎牛血清,1丙酮酸鈉,青霉素5X10U/L,鏈霉素50MG/L,075碳酸氫鈉7細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入37、5CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng),第二天換液繼續(xù)培養(yǎng)28觀察細(xì)胞狀態(tài)并及時(shí)換液,23天換液一次。212細(xì)胞的傳代1當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中貼壁融合達(dá)80左右時(shí),將細(xì)胞培養(yǎng)瓶從CO培養(yǎng)箱中取出,在超2凈工作臺(tái)中倒掉培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液7暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文2無(wú)菌磷酸鹽緩沖液PBS沖洗兩次以除去殘留的培養(yǎng)液和血清3向培養(yǎng)瓶中加入15ML025胰酶溶液,輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶,使消化液覆蓋所有細(xì)胞的表面4將培養(yǎng)瓶放置在顯微鏡下觀察,當(dāng)細(xì)胞胞質(zhì)回縮,細(xì)胞間隙增大時(shí),立即加入4ML細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化5用彎頭吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液,輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞,使細(xì)胞脫壁后形成均勻的細(xì)胞懸液26將細(xì)胞平均分別接種至3個(gè)生長(zhǎng)面積為25CM培養(yǎng)瓶中,37、5CO培養(yǎng)箱中培2養(yǎng)。7一般情況,傳代后的SKNSH細(xì)胞在2小時(shí)左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上,67天可在瓶?jī)?nèi)形成單層,需要再次進(jìn)行傳代。213細(xì)胞凍存把生長(zhǎng)良好的SKNSH細(xì)胞凍存起來(lái)可以保存其活性,留待下次使用。當(dāng)細(xì)胞冷凍到零度以下,可以產(chǎn)生以下變化細(xì)胞器脫水,細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高,并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢凍存,可使細(xì)胞逐步脫水,細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶反之結(jié)晶就大,而大的結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。故本實(shí)驗(yàn)采取以下慢凍程序1配制含10二甲亞砜DMSO,20胎牛血清,70MEM培養(yǎng)液的細(xì)胞凍存液,4下保存、備用2按照常規(guī)方法消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,制備成單細(xì)胞懸液3將細(xì)胞懸液用吸管移至離心管中,以1000RPM離心3MIN4棄去上清,加入凍存液,輕輕吹打沉淀細(xì)胞,使細(xì)胞均勻重懸65顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度11010個(gè)/ML的懸液6按每管1518ML的量,分裝于凍存管中,擰緊蓋,做好標(biāo)記7先將凍存管4冰箱中放置1030MIN,再將凍存管移至20冰箱中放置2小時(shí)8將凍存管放置入80冰箱中保存。214細(xì)胞觀察SKNSH細(xì)胞經(jīng)上述方法培養(yǎng)生長(zhǎng)良好,可用于下一步實(shí)驗(yàn),傳代后24小時(shí)進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),于倒置顯微鏡下觀察,呈菊花團(tuán)樣生長(zhǎng),狀如梭形或多角形,細(xì)胞與細(xì)胞間相互連接,大小均勻。8暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文215細(xì)胞的處理41配制含10UMOL/LDPDMP,10胎牛血清,1丙酮酸鈉,青霉素5X10U/L,鏈霉素50MG/L,075碳酸氫鈉的細(xì)胞處理培養(yǎng)液2將長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按常規(guī)消化后重懸重懸于4ML培養(yǎng)液中,吹打成均勻的細(xì)胞懸液3顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),按14的比例分別接種到4個(gè)培養(yǎng)瓶中,試驗(yàn)組細(xì)胞加入細(xì)胞處理培養(yǎng)液4每23天換處理細(xì)胞培養(yǎng)液一次。216細(xì)胞遷移試驗(yàn)1包被膠原用02乙酸將型膠原COLLAGEN配制為25UG/ML溶液,每孔200UL2包被TRANSWELL小室或細(xì)胞培養(yǎng)瓶側(cè)壁510UG/CM,室溫放置24H風(fēng)干后放入4冰箱中保存,備用2水化膠原基底膜加入細(xì)胞一小時(shí)前用無(wú)菌PBS溶液沖洗一次,用無(wú)血清的細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗一次3制備單細(xì)胞懸液按照常規(guī)方法消化對(duì)照組和處理組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,制備成單細(xì)胞懸液將細(xì)胞懸液用吸管移至離心管中,以1000RPM3MIN離心棄去上清,加入無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液,輕輕吹打沉淀細(xì)胞,使細(xì)胞均勻重懸6顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù),使細(xì)胞配成110個(gè)/ML的懸液5接種細(xì)胞A細(xì)胞傾斜遷移試驗(yàn)參照STROBEL等所用方法將SKNSH細(xì)胞加入包被有鼠尾I型膠原蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)瓶以80的角度傾斜放置培養(yǎng)箱過(guò)夜,讓細(xì)胞附著在培養(yǎng)瓶的下半部表面第二天早晨,用橡皮細(xì)胞刮匙輕輕刮除已遷移出底部的細(xì)胞,洗滌培養(yǎng)瓶除去未貼壁的細(xì)胞,照片記錄細(xì)胞的位置0H將培養(yǎng)瓶以15的角度傾斜,再放入培養(yǎng)箱24小時(shí)后重新洗滌培養(yǎng)瓶除去未貼壁的細(xì)胞,然后照相記錄細(xì)胞的位置24H。BTRANSWELL小室法參照KANTOR等所用方法將TRANSWELL小室放入12孔培養(yǎng)板,從側(cè)孔向下室內(nèi)加入600UL細(xì)胞培養(yǎng)液,向小室中加入9暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文400UL單細(xì)胞懸液,若加整合素抗體抗體終濃度均為10MG/L則37封閉45MIN,若加GD,終濃度為10UMOL/L。26放入37,5CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時(shí)27固定及染色吸取小室內(nèi)細(xì)胞液觀察是否有未轉(zhuǎn)移細(xì)胞用移液器移走TRANSWELL小室內(nèi)和小室下層腔室內(nèi)的液體用磷酸鹽緩沖液沖洗PBSTRANSWELL濾膜2次用棉簽拭去小室內(nèi)的膠原和細(xì)胞用PBS溶液沖洗小室兩次將小室底面朝下放在一個(gè)潔凈的12孔板上,用95的乙醇固定30MIN,用PBS溶液沖洗兩次,后用10GIEMSA染色510MIN,用PBS溶液沖洗兩次用刀片小心沿小室邊緣將膜切下,把膜下表面向上放在干凈的玻片上,滴2滴中性樹膠,再將潔凈蓋玻片傾斜放下,以免出現(xiàn)起氣泡200倍顯微鏡光鏡下,在一固定位點(diǎn)的膜水平線及其垂直直徑線上定點(diǎn)取6個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞即染成紫紅色的點(diǎn)計(jì)數(shù)。217細(xì)胞侵襲試驗(yàn)參照ALBINI等所用方法1包被基底膜將106MG/ML的MATRIGEL原液稀釋20倍為05MG/ML的MATRIGEL溶液,每孔120UL60UG包被TRANSWELL小室,該步驟在冰上操作后,放入37溫箱中2小時(shí)后備用2水化基底膜吸除多余的培養(yǎng)液,加入細(xì)胞一小時(shí)前用無(wú)菌PBS溶液沖洗一次,用無(wú)血清的細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗一次3制備SKNSH細(xì)胞懸液取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)其細(xì)胞,用025胰蛋白酶消化,用無(wú)血清細(xì)胞6培養(yǎng)液配制成110個(gè)/ML的懸液4接種細(xì)胞將TRANSWELL小室放入12孔培養(yǎng)板中,從小室的側(cè)孔用以液器小心往小室下層腔室內(nèi)加入600UL細(xì)胞培養(yǎng)液,在TRANSWELL小室內(nèi)加入400UL的細(xì)胞懸液,若加整合素抗體抗體均為濃度10MG/L則37封閉45MIN,若加GD,終濃度為10UMOL/L。25培養(yǎng)細(xì)胞把12孔培養(yǎng)板移入37、5CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)16小時(shí)26固定及染色按照以下步驟操作用移液器移走TRANSWELL小室內(nèi)和小室下層腔室內(nèi)的液體用磷酸鹽緩沖液沖洗PBSTRANSWELL濾膜2次用棉簽拭去小室內(nèi)的膠原和細(xì)胞用PBS溶液沖洗小室兩次,10暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文將小室底面朝上放在放在一個(gè)潔凈的12孔板上,用95的乙醇固定30MIN,用PBS溶液沖洗兩次,后用10GIEMSA染色510MIN,用PBS溶液沖洗兩次用刀片小心沿小室邊緣將膜切下,把膜下表面向上放在干凈的玻片上,滴2滴中性樹膠,再將潔凈蓋玻片傾斜放下,以免出現(xiàn)起氣泡200倍顯微鏡光鏡下,在一固定位點(diǎn)的膜水平線及其垂直直徑線上定點(diǎn)取6個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞即染成紫紅色的點(diǎn)計(jì)數(shù)。218統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差XS表示,利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包處理。各組間計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析,差異顯著時(shí)用STUDENTNEWMANKEULS法進(jìn)行兩兩比較,顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)取雙側(cè)P005。219體外細(xì)胞遷移能力的測(cè)定通過(guò)細(xì)胞傾斜實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞遷移能力在不同的實(shí)驗(yàn)條件下與對(duì)照組相比較,觀察實(shí)驗(yàn)條件變化后細(xì)胞遷移能力的變化,從質(zhì)的角度初步作出定性的判斷。然后進(jìn)一步通過(guò)TRANSWELL小室實(shí)驗(yàn)從量的角度對(duì)細(xì)胞遷移能力的變化給出明確的數(shù)量比較。體外TRANSWELL小室細(xì)胞培養(yǎng)模型是綜合判斷腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力,分析腫瘤細(xì)胞粘附、降解和穿透轉(zhuǎn)移能力及相互間聯(lián)系的最有效且較經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法,已廣泛應(yīng)用于腫瘤體外侵襲轉(zhuǎn)移能力的檢測(cè)。TRANSWELL小室內(nèi)不鋪MATRIGEL基膜,觀察穿膜細(xì)胞數(shù)能檢測(cè)腫瘤體外移行能力。計(jì)數(shù)穿過(guò)微孔移至濾膜下層的細(xì)胞數(shù)個(gè),并計(jì)算細(xì)胞遷移平均值和細(xì)胞遷移抑制率。2110體外細(xì)胞侵襲能力的測(cè)定通過(guò)TRANSWELL小室實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞在不同實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞侵襲能力的變化,TRANSWELL小室內(nèi)鋪MATRIGEL基膜,MATRIGEL為模擬人體細(xì)胞外基質(zhì)合成人工基質(zhì),觀察穿過(guò)該膜細(xì)胞數(shù)能檢測(cè)腫瘤體外侵襲能力。計(jì)數(shù)穿過(guò)微孔移至濾膜下層的細(xì)胞數(shù)個(gè),并計(jì)算細(xì)胞侵襲平均值和細(xì)胞侵襲抑制率。2111實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為1對(duì)照組、2含ANTI組、3含ANTI組、4DPDMP處理細(xì)胞組、521DPDMP處理后加GD組、GD終濃度10UMOL/L6DPDMP處理后加ANTI組、ANTI2222終濃度10MG/L7DPDMP處理后加ANTI組、ANTI終濃度10MG/L8DPDMP處11理后加ANTI、GD組、9、DPDMP處理后加ANTI、GD組。2212通過(guò)實(shí)驗(yàn)組1、2、3組之間數(shù)據(jù)分析,可推理判斷整合素在SKNSH神經(jīng)母細(xì)胞2111暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文瘤細(xì)胞中的作用通過(guò)實(shí)驗(yàn)組1、4、5組之間數(shù)據(jù)分析,可推理判斷GLS對(duì)SKNSH神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移侵襲的影響通過(guò)實(shí)驗(yàn)組1、6、7、8、9組之間數(shù)據(jù)分析,推理判斷GLS與整合素對(duì)SKNSH神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移侵襲的影響機(jī)制之間是否存在關(guān)聯(lián)。212112細(xì)胞株的選擇1研究不同NB細(xì)胞株的GLS含量采用3種不同的NB細(xì)胞株KA2,LAN1和SKNSH購(gòu)于上海細(xì)胞生物研究所進(jìn)行對(duì)比研究。3種細(xì)胞株均培養(yǎng)成功對(duì)這3種細(xì)胞株GANGLIOSIDES進(jìn)行分離提取,3種細(xì)胞株高效薄層層析HPTLC分析顯示,主要成分相近,為GD或GMMONOSIALOGANGLIOSIDES,232223GM這一結(jié)果與以往國(guó)外的報(bào)道一致。2對(duì)3種NB細(xì)胞對(duì)膠原蛋白COLLAGEN,COL粘附能力進(jìn)行比較研究三種不同細(xì)胞株對(duì)膠原蛋白粘附能力的比較研究結(jié)果表明SKNSH和LAN1細(xì)胞株均顯示對(duì)膠原蛋白有相對(duì)較強(qiáng)的粘附能力A570值SKNSH、LAN1和KA2細(xì)胞株分別為045002、0510035和0500022結(jié)果顯示細(xì)胞株LAN1和SKNSH細(xì)胞株顯示出較強(qiáng)的粘附作用,KA2細(xì)胞株相對(duì)較弱。3腫瘤細(xì)胞對(duì)ECM蛋白METRIGEL侵入能力的影響從GLS含量和對(duì)膠原蛋白粘附能力的研究表明LAN1和SKNSH細(xì)胞株占有明顯的優(yōu)勢(shì),故對(duì)這兩種細(xì)胞株對(duì)ECM蛋白METRIGEL侵入能力作進(jìn)一步的比較。為確定這兩種細(xì)胞株侵入能力,我們使用MATRIGEL包備的含8微米孔的PET膜作為實(shí)驗(yàn)?zāi)＞?。觀察一定時(shí)間內(nèi)細(xì)胞通過(guò)該膜的數(shù)量。其方式是采用顯微鏡計(jì)數(shù)附著于膜下的細(xì)胞數(shù)。初步結(jié)果顯示LAN1和SKNSH細(xì)胞株侵入的細(xì)胞數(shù)平均分別為82和86個(gè)細(xì)胞。兩者的侵入能力相近,SKNSH細(xì)胞株相對(duì)侵入能力較強(qiáng)。4SKNSH細(xì)胞神經(jīng)節(jié)苷脂成分分析對(duì)三種神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行比較,SKNSH細(xì)胞株顯示出較強(qiáng)的粘附作用和侵襲能力,我們選擇對(duì)SKNSH細(xì)胞神經(jīng)節(jié)苷脂進(jìn)行分離純化然后對(duì)其成分進(jìn)行分析,結(jié)果表明該細(xì)胞神經(jīng)節(jié)苷脂的主要成分為GD。25SKNSH細(xì)胞整合素表達(dá)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)SKNSH細(xì)胞整合素表達(dá)情2121況,結(jié)果顯示該細(xì)胞整合素CD49B和CD29均有高水平的表達(dá),表達(dá)率分別為97921和999。清除GLS細(xì)胞整合素CD49B和CD29表達(dá)率分別為939和995。216綜上所述SKNSH細(xì)胞株符合本課題所需要的實(shí)驗(yàn)要求,故選擇SKNSH細(xì)胞株作為最后的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。12暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文3結(jié)果31整合素對(duì)SKNSH細(xì)胞遷移和侵襲的影響211細(xì)胞傾斜遷移實(shí)驗(yàn)初步觀察到傾斜實(shí)驗(yàn)24小時(shí)后,整合素圖B2、圖C221單克隆抗體均能明顯抑制SKNSH細(xì)胞通過(guò)膠原基底膜的遷移能力圖3。A1無(wú)抗體B1ANTIC1ANTI0HRA2無(wú)抗體B2ANTIC2ANTI24HR2121圖1整合素對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移的影響212TRANSWELL小室法結(jié)果細(xì)胞遷移能力的測(cè)定結(jié)果表1。表1SKNSH細(xì)胞在ANTI和ANTI阻斷下細(xì)胞遷移能力的測(cè)定結(jié)果21樣本圖片細(xì)胞遷移計(jì)數(shù)分組123456789101112131415161718XS1959899921099511610784989994988797100961029872704759483643363468505264555844554751511036164485058506970375844593953545256555491對(duì)照組2含ANTI組3ANTI組P00121從以上表1結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組2、3穿過(guò)微孔移至濾膜下層的細(xì)胞數(shù)明顯少于實(shí)驗(yàn)組1對(duì)照組,各組細(xì)胞遷移細(xì)胞均數(shù)從高到低的順序?yàn)?32,2、3組的細(xì)胞遷移抑制率分別為480和449,多因素方差分析示2和3組之間細(xì)胞遷移均數(shù)無(wú)顯著性差異P005,1和2、3組之間相比,體外細(xì)胞遷移均數(shù)之間具有顯著性的差異P001,F164。13暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文120細(xì)100胞遷80移60數(shù)40個(gè)200123ERRORBARS9500CI圖2SKNSH細(xì)胞在整合素抗體阻斷前后遷移能力的測(cè)定A、對(duì)照組細(xì)胞遷移圖姬姆薩染色200倍211對(duì)照組2ANTI組、3ANTI組P00121B、含ANTI抗體組細(xì)胞遷移圖C、含ANTI抗體組細(xì)胞遷移圖213體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)細(xì)胞侵襲能力的測(cè)定結(jié)果表3。表2SKNSH細(xì)胞在ANTI和ANTI阻斷下細(xì)胞侵襲能力的測(cè)定結(jié)果21樣本圖片細(xì)胞侵襲計(jì)數(shù)分組123456789101112131415161718XS14147384442393747384440514446394336314252202429181916222427272833262332322125254320202524211418162322