2015屆本科生畢業(yè)論文（設(shè)計）題目缺氧對維甲酸誘導基因I介導的抗病毒免疫應(yīng)答的調(diào)控及機制研究學院系生命科學學院專業(yè)年級生物技術(shù)113班完成日期2015年6月目錄摘要1ABSTRACT2第一章緒論311研究意義312免疫應(yīng)答簡介3121機體免疫應(yīng)答3122抗病毒免疫信號通路4123重要的細胞因子413缺氧免疫調(diào)控研究現(xiàn)狀8第二章材料與方法821材料822主要試劑823主要設(shè)備和軟件924方法9241小鼠腹腔巨噬細胞的分離9242RNA提取9243逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)10244實時定量PCR10245免疫印跡法11246過表達質(zhì)粒的構(gòu)建12247酶聯(lián)免疫吸附測定法13247流式細胞術(shù)13248過表達質(zhì)粒的構(gòu)建1325技術(shù)路線15251體外缺氧抗病毒免疫應(yīng)答研究15252體內(nèi)缺氧抗病毒免疫研究15253缺氧抗病毒免疫調(diào)控機制研究15第三章結(jié)果與討論1631結(jié)果16311缺氧促進流感病毒誘導的細胞因子風暴,增加小鼠死亡率16312缺氧促進巨噬細胞對病毒的免疫應(yīng)答16313缺氧通過PD1依賴的機制調(diào)控RIGI的表達1732討論19參考文獻21致謝23缺氧對維甲酸誘導基因I介導的抗病毒免疫應(yīng)答的調(diào)控及機制研究摘要維甲酸誘導基因（RETINOICACIDINDUCIBLEGENE,RIG）位于細胞質(zhì)內(nèi)，識別病毒雙鏈RNA的解旋酶，是抗病毒信號通路的胞內(nèi)主要受體蛋白，屬于RIG樣受體（RIGLIKERECEPTORS,RLRS）家族成員。近年來，大量研究證實缺氧是調(diào)控機體炎癥反應(yīng)的一個重要因素。雖然沒有研究報道缺氧和RIGI信號之間是否存在關(guān)聯(lián)，但體外細胞培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn)缺氧顯著抑制流感病毒感染和擴增效率。本實驗研究缺氧對維甲酸誘導基因I介導的抗病毒免疫應(yīng)答的調(diào)控及機制。在缺氧條件下利用HINI感染小鼠發(fā)現(xiàn)缺氧促進流感病毒誘導的細胞因子，增加小鼠死亡率。體外H1N1流感病毒刺激，QPCR和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)缺氧促進巨噬細胞對病毒的固有免疫應(yīng)答。分別利用RNA干擾技術(shù)和分子克隆技術(shù)，檢測PD1下調(diào)和過表達狀態(tài)下細胞因子的表達變化,發(fā)現(xiàn)細胞因子的表達與PD1呈負相關(guān)。H1N1刺激轉(zhuǎn)染PD1SIRNA的RAW2647，WESTERNBLOT檢測不同時間點相關(guān)蛋白水平發(fā)現(xiàn)，相比于常氧對照組，低氧培養(yǎng)的巨噬細胞刺激后表達更低水平PSHP2和更高水平的RIG蛋白。實驗結(jié)果表明缺氧可以促進病毒感染后巨噬細胞的固有免疫應(yīng)答并通過PD1依賴的機制調(diào)控RIG的表達。關(guān)鍵字缺氧維甲酸誘導基因；免疫應(yīng)答；程序性死亡受體1THEROLEOFHYPOXIAINREGULATINGRIGMEDIATEDANTIVIRALRESPONSEAUTHORHUANLELITUTORYANGLIUCOLLEGEOFLIFESCIENCESNORTHWESTARIGIMMUNERESPONSEPD1第一章緒論11研究意義病原微生物感染是人類健康最大的威脅，而固有免疫是機體抵抗病原微生物感染的第一道防線。流感病毒屬于正黏液病毒科單股負鏈RNA病毒，可感染所有年齡人群，易發(fā)生變異從而造成疫情的大面積爆發(fā)1。自上世紀以來，有記錄的流感大流行就有7次，僅2009年甲型H1N1流感疫情就造成全球29萬患者死亡，對人類的生存和健康構(gòu)成重大威脅2,3。近年來我國流感疫情爆發(fā)頻繁，除季節(jié)性流感外，多地還出現(xiàn)甲型H1N1、H5N1、H7N9、H10N8人感染病例。其中2013年3月在我國首次發(fā)現(xiàn)新亞型H7N9禽流感病毒，不僅可以感染人類，且致病力強，患者病情發(fā)展迅速，?？焖龠M展為急性呼吸窘迫綜合癥、嚴重低血氧癥、感染性休克，甚至多器官功能衰竭，病死率很高4,5。當前研究發(fā)現(xiàn)，除了病毒感染直接造成的組織細胞損傷外，機體固有免疫系統(tǒng)，巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞等，對病毒過度應(yīng)答，造成體內(nèi)多種炎癥因子的大量聚集，即“細胞因子風暴”（CYTOKINESTORM所造成組織損傷、多器官衰竭是流感病毒感染患者高病死率的重要病理機制之一68。深入研究機體內(nèi)“細胞因子風暴”形成和調(diào)控機制有重大的臨床意義。12免疫應(yīng)答簡介121機體免疫應(yīng)答免疫應(yīng)答是指機體受抗原刺激后，體內(nèi)抗原特異性淋巴細胞識別抗原，發(fā)生活化、增殖、分化或無能、凋亡，進而表現(xiàn)出一定生物學效應(yīng)的全過程。淋巴細胞對抗原的特異性識別能力受遺傳基因控制，并在個體發(fā)育過程中形成。免疫應(yīng)答最基本的意義是識別“自己”與“非己”從而清除“非己”的抗原性物質(zhì)，保護機體免受異己抗原的侵襲?！懊庖邞?yīng)答IMMUNEREACTION”主要指免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細胞與抗原特異性結(jié)合所發(fā)生的反應(yīng)。免疫應(yīng)答的類型主要取決于抗原的質(zhì)和量，以及機體的免疫狀態(tài)和反應(yīng)性。正常情況下，機體對抗原產(chǎn)生生理性免疫應(yīng)答（免疫保護）對“非己”抗原產(chǎn)生正應(yīng)答，以抵御外源性抗原的侵害；對自身抗原產(chǎn)生負應(yīng)答（即免疫耐受），以保護自身組織不受免疫攻擊而被損傷。異常情況下，機體對抗原刺激產(chǎn)生病理性免疫應(yīng)答（免疫損傷）對“非己”抗原產(chǎn)生過高應(yīng)答導致超敏反應(yīng)，或過低應(yīng)答導致免疫功能低下或缺失，從而引發(fā)嚴重感染或腫瘤；機體弱隊自身抗原產(chǎn)生正應(yīng)答，則導致自身免疫病。適應(yīng)性免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)是免疫細胞。免疫細胞在中樞免疫器官經(jīng)歷陽性選擇和陰性選擇，獲得MHC限制性識別能力，并清除自身反應(yīng)性淋巴細胞克隆或使其失能，成熟的淋巴細胞則遷移至外周免疫器官。外周免疫器官（主要是淋巴結(jié)和脾臟）是發(fā)生免疫應(yīng)答的主要場所。在外周免疫器官內(nèi)，免疫細胞（主要是抗原提呈細胞和淋巴細胞）間發(fā)生極為復雜的相互作用并彼此協(xié)作。免疫應(yīng)答的過程十分復雜，對其基本規(guī)律已有一定了解，但某些具體環(huán)節(jié)尚未完全清楚。免疫應(yīng)答是在遺傳調(diào)控下，有多重免疫細胞和免疫分子的參與而發(fā)生。一般將免疫應(yīng)答過程劃分成為緊密相關(guān)切不可分割的若干階段。1感應(yīng)（識別）階段抗原被APC攝取、加工、處理；T細胞/B細胞通過TCR/BCR特異性識別抗原肽。2增殖和分化階段T/B細胞特異性識別抗原，產(chǎn)生其激活的第一信號；T/B細胞與APC表面多種黏附分子相互作用，提供T細胞激活的第二信號（即共刺激信號）。另外，激活的APC與T細胞所產(chǎn)生的多種淋巴因子被視為第三信號，它們通過自分泌和旁分泌作用，參與淋巴細胞增殖和分化，最終形成效應(yīng)性T細胞或漿細胞。3效應(yīng)階段免疫效應(yīng)細胞和效應(yīng)分子（細胞因子和抗體）共同發(fā)揮作用，清除非己抗原或誘導免疫耐受，從而維持機體正常生理狀態(tài)，或引發(fā)免疫相關(guān)性疾病。4恢復階段由于病原體被清除，活化增值的淋巴細胞克隆通過被動性死亡及活化誘導的細胞死亡機制而發(fā)生凋亡，免疫系統(tǒng)恢復平衡，同時，由于體內(nèi)已形成長壽命的抗原特異性記憶淋巴細胞，一旦相同抗原再次入侵，記憶淋巴細胞可迅速產(chǎn)生比初次應(yīng)答更為有效的應(yīng)答。根據(jù)參與免疫應(yīng)答和介導免疫效應(yīng)的組分及細胞種類的不同，適應(yīng)性免疫應(yīng)答可分為T細胞介導的細胞免疫和B細胞介導的體液免疫。122抗病毒免疫信號通路機體的天然免疫系統(tǒng)在抵抗病毒感染方面發(fā)揮著重要作用。病毒感染宿主細胞后，宿主細胞可以通過模式識別受體PATTERNRECOGNITIONRECEPTORS，PRR偵測病原相關(guān)分子模式PATHOGENASSOCIATEDMOLECULARPATTERNS，PAMP的存在，從而激活宿主的天然免疫反應(yīng)，誘導干擾素IFN、促炎癥細胞因子等一系列抗病毒因子的產(chǎn)生。TOLL樣受體TOLLLIKERECEPTOR，TLR家族是一類重要的PRR，在RNA病毒的識別過程中發(fā)揮重要作用，如TLR3識別DSRNA；TLR7和TLR8識別SSRNA等。但由于TLR家族成員均為跨膜蛋白，只能識別細胞外或內(nèi)體中的RNA病毒，對于細胞質(zhì)中的RNA病毒，TLR則無法做出反應(yīng)。RIGI樣受體RIGILIKERECEPTOR，RLR是一類新發(fā)現(xiàn)的PRR，能夠識別細胞質(zhì)中的病毒RNA，誘導干擾素和促炎癥細胞因子的產(chǎn)生，對抗病毒天然免疫的建立起著至關(guān)重要的作用。當前研究發(fā)現(xiàn)流感病毒可被多種模式識別受體（PATTERNRECOGNITIONRECEPTORS,PPRS）識別，激發(fā)機體固有免疫應(yīng)9，包括RLRSRIGILIKERECEPTORS家族的維甲酸誘導基因IRETINOICACIDINDUCIBLEGENEI,RIGI、TLRSTOLLLIKERECEPTORS家族的TOLL樣受體3和7（TLR3和TLR7）以及NLRSNODLIKERECEPTORS家族的NLRP310,11。哺乳動物體內(nèi)還有其它一些固有抗病毒分子INTRINSICANTIVIRALFACTORS，其中IFIFM和IFIT家族分子可通過阻止流感病毒進入胞內(nèi)、抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄和翻譯等機制發(fā)揮抗流感病毒的作用12。123重要的細胞因子1231干擾素干擾素是由多種細胞產(chǎn)生的具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的可溶性糖蛋白。干擾素在整體上不是均一的分子，可根據(jù)產(chǎn)生細胞分為3種類型白細胞產(chǎn)生的為型；成纖維細胞產(chǎn)生的為型；T細胞產(chǎn)生的為型。根據(jù)干擾素的產(chǎn)生細胞、受體和活性等綜合因素將其分為2種類型型和型。型干擾素又稱為抗病毒干擾素，其生物活性以抗病毒為主。型干擾素有3種形式IFN、IFN和IFN。IFN主要由白細胞產(chǎn)生，含有至少14種不同基因編碼的蛋白質(zhì)，各成分之間氨基酸順序的同源性約為90，成熟的IFN的分子量約1820KD。IFN是單一基因的產(chǎn)物，主要由成纖維細胞和白細胞以外的其他細胞產(chǎn)生；分子量20KD，與IFN的同源性在氨基酸水平上僅為30，在核苷酸水平上約45。IFN的基因有6個，但其中只有1個是有功能的；IFN與IFN的基因相近，而且其主要產(chǎn)生細胞也為白細胞。IFN、和的受體為同一種分子，其基因位于第21號染色體上，表達在幾乎所有類型的有核細胞表面，因此其作用范圍十分廣泛。多數(shù)型干擾素對酸穩(wěn)定，在PH20時不被破壞。型干擾素又稱免疫干擾素或IFN，主工由T細胞產(chǎn)生；主要活性是參與免疫調(diào)節(jié)，是體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子。IFN與型干擾素幾乎在所有方向均有不同IFN只有一種活性形式的蛋白質(zhì)，由一條分子量為18KD的多肽鏈進行不同程度的糖基化修飾而成；IFN的基因只有一個，位于人類第12號染色體上；IFN的受體與型干擾素的受體無關(guān)，其基因位于第6號染色體上，但也同樣表達在多數(shù)有核細胞表面；IFN對酸不穩(wěn)定，在PH20時極易破壞，利用此特性可以很容易地將其與型干擾素區(qū)分開來。正常情況下組織或血清中不含干擾素，只有在某些特定因素的作用下才能誘使細胞產(chǎn)生干擾素。型干擾素的主要誘生劑是病毒及人工合成的雙鏈RNA，此外某些細菌和原蟲感染及某些細胞因子也能誘導型干擾素的產(chǎn)生。IFN和的表達細胞非常局限，以白細胞為主；但IFN則可由幾乎所有的有核細胞產(chǎn)生。IFN由CD8T細胞和某些CD4T細胞（特別是TH1細胞）產(chǎn)生，NK細胞亦可合成少量的IFN；這些細胞只有在免疫應(yīng)答中受到抗原或絲裂原活化后才能分泌IFN。干擾素的生物活性有較嚴格的種屬特異性，即某一種屬細胞產(chǎn)生的干擾素，只能作用于相同種屬的細胞。型干擾素的抗病毒作用較強，而型干擾素則具有較強的抑制腫瘤細胞增殖和免疫調(diào)節(jié)作用。目前，國內(nèi)外均已利用基因工程技術(shù)批量生產(chǎn)重組人IFN、IFN、IFN，并投入抗病毒和腫瘤治療的臨床研究?？共《咀饔眯透蓴_素具有廣譜的抗病毒活性，對多種病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用；但這種效應(yīng)不是直接的，而是通過對宿主細胞的作用引起的13。對干擾素敏感的細胞表面存在于干擾素受體，核內(nèi)有“抗病毒蛋白”基因，受干擾素作用后該基因活化，產(chǎn)生的抗病毒蛋白可阻止病毒MRNA翻譯，并促進病毒MRNA降解。干擾素能提高細胞表面MHC類分子的表達水平，受到病毒感染的細胞表面MHC類分子的增加有助于向TC細胞遞呈抗原，引起靶細胞的溶解。干擾素可增強NK細胞對病毒感染的殺傷能力?？鼓[瘤作用型干擾素能抑制細胞的DNA合成，減慢細胞的有絲分裂速度；這種抑制作用有明顯的選擇性，對腫瘤細胞的作用比對正常細胞的作用強5001000倍。另外，型干擾素也可通過增強機體免疫機制、加強免疫監(jiān)督功能來實現(xiàn)其抗腫瘤效應(yīng)。干擾素的免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)在對宿主免疫細胞活性的影響，如對巨噬細胞、T細胞、B細胞和NK細胞等均有一定作用14。（1）對巨噬細胞的作用IFN可使巨噬細胞表面MHC類分子的表達增加，增強其抗原遞呈能力；此外還能增強巨噬細胞表面表達FC受體，促進巨噬細胞吞噬免疫復合物、抗體包被的病原體和腫瘤細胞。（2）對淋巴細胞的作用干擾素對淋巴細胞的作用較為復雜，可受劑量和時間等因素的影響而產(chǎn)生不同的效應(yīng)。在抗原致敏之前使用大劑量干擾素或?qū)⒏蓴_素與抗原同時投入會產(chǎn)生明顯的免疫抑制作用；而低劑量干擾素或在抗原致敏之后加入干擾素則能產(chǎn)生免疫增強的效果。在適宜的條件下，IFN對B細胞和CD8T細胞的分化有促進作用，但不能促進其增殖。IFN能增強TH1細胞的活性，增強細胞免疫功能；但對TH2細胞的增殖有抑制作用，因此抑制體液免疫功能。IFN不僅抑制TH2細胞產(chǎn)生IL4，而且抑制IL4對B細胞的作用，特別是抑制B細胞生成IGE。（3）對其它細胞的作用IFN對其他細胞也有廣泛影響刺激中性粒細胞，增強其吞噬能力；活化NK細胞，增強其細胞毒作用；使某些正常不表達MHC類分子的細胞（如血管內(nèi)皮細胞、某些上皮細胞和結(jié)締組織細胞）表達MHC類分子，發(fā)揮抗原遞呈作用；使靜脈內(nèi)皮細胞對中性粒細胞的粘附能力更強，且可分化為高內(nèi)皮靜脈，吸引循環(huán)的淋巴細胞。1232白細胞介素6IL6產(chǎn)生IL6的細胞主要有單核/巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、角質(zhì)細胞、T細胞（主要是TH2）和B細胞等。可能由于由于其糖基化和磷酸化不同，單核細胞至少表達5種不同分子量的IL6。IL64缺少第四個外顯子，可與IL6RA鏈結(jié)合為復合物，但不能傳遞信號從而競爭性抑制IL6的生物活性。IL6由配體結(jié)合的鏈（CD126）和信號傳遞鏈（GP130，CD130）組成，后者無配體結(jié)合能力，但參與組成IL6高親和力結(jié)合位點，且是LIFR、OSMR、CNTFR、IL11R和CT1R的公用信號傳遞鏈。IL6R廣泛表達于活化B細胞、靜止T細胞、NK細胞骨髓瘤細胞肝細胞髓樣白血病細胞等表面。SIL6R能與IL6形成復合物，進一步結(jié)合GP130，發(fā)揮IL6的生物學作用15。IL6是多功能炎性細胞因子，是炎性介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成份，在炎癥反應(yīng)中起重要作用。作為抗炎癥細胞因子或遠期細胞因子可平衡前炎癥細胞因子或早期細胞因子的損傷效應(yīng)，起到一定的保護作用。IL6可以通過抑制巨噬細胞產(chǎn)生IL1和腫瘤壞死因子而在細菌內(nèi)毒素誘導的實驗性肺損傷中起細胞保護和抗炎作用。由于具有致炎和抗炎的雙向功能，它的作用與組織中的含量有關(guān)，正常水平對機體有利，產(chǎn)生過多會引起一系列炎性損害。體內(nèi)IL6的水平上升，可以導致多種疾病如類風濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎的腎小球增殖，克羅恩病CD和CASTLEMAN氏病等。有研究表明16，在炎癥、感染和患有某些腫瘤等情況下，血清中IL6的含量會有不同程度上升，因此IL6水平可作為判別病情嚴重程度的靈敏指標并可藉此判斷患者的預(yù)后。1233腫瘤壞死因子人TNF有兩種分子形式，一種稱為TNF，另一種稱為TNF。TNF由細菌脂多糖活化的單核巨噬細胞產(chǎn)生，可引起腫瘤組織出血壞死，也稱惡病質(zhì)素（CACHECTIN）；TNF由抗原或絲裂原刺激的淋巴細胞產(chǎn)生，具有腫瘤殺傷及免疫調(diào)節(jié)功能，又稱淋巴毒素（LYMPHOTOXIN，LT）。盡管兩型TNF有不同的細胞來源，DNA水平上也僅有28的核苷酸序列同源，但兩者結(jié)合于相同的膜受體，并且具有非常相似的生物學功能。人TNF和的基因均位于第6號染色體。成熟TNF的分子量約17KD，而TNF略呈異質(zhì)性，為2025KD。TNF受體存在于幾乎所有的有核細胞表面，目前已發(fā)現(xiàn)兩種TNF受體（TNFR和TNFR）17。TNFR的親和力比較強，TNFR的親和力相對弱一些。兩者與TNF結(jié)合后產(chǎn)生的效應(yīng)有所不同，TNFR主要增強細胞毒細胞的活性和促進成纖維細胞生長，擊TNFR主要是增進T細胞增殖。最初對TNF功能的認識僅限于對腫瘤的特異性殺傷作用，后來發(fā)現(xiàn)TNF也具有免疫調(diào)節(jié)作用，而且參與某些炎癥反應(yīng)的過程。TNF的生物活性與IL1十分相似，只是TNF的毒性較大，更易引起血管阻塞，抗腫瘤作用更強。低濃度的TNF主要在局部發(fā)揮作用，高濃度的TNF可以進入血流，引起全身性反應(yīng)。近來的研究表明人和小鼠TNF和的基因都與MHC基因緊密連鎖，暗示其可能參與免疫調(diào)節(jié)基因的表達調(diào)控。抗腫瘤及抑瘤作用TNF對多種腫瘤細胞均有殺傷或抑制作用，敏感性因腫瘤細胞類型而異。TNF抗瘤機制尚不完全清楚，可能包括18通過TNF受體介導的直接效應(yīng)；誘導組織內(nèi)凝血活性，導致病理性凝血，阻斷進入瘤區(qū)的血流；誘導腫瘤局部的炎癥反應(yīng)及血管改變；介導多種細胞的殺瘤性效應(yīng)，如自然細胞毒細胞（NC）、殺瘤性單核巨噬細胞等?？共《咀饔肨NF呈劑量依賴性地抑制病毒介導的細胞病變的發(fā)展，對RNA病毒和DNA病毒均有抑制作用。TNF的抗病毒活性與抗瘤活性一樣沒有明顯的種屬特異性，抗病毒的機制19不是通過誘導干擾素的間接作用，與TNF的細胞毒性也無直接關(guān)系。除誘導未感染細胞有抗病毒能力之外，TNF也可選擇性殺傷病毒感染的細胞?，F(xiàn)還證實，多種病毒、POLYC等也可刺激TNF的產(chǎn)生。免疫調(diào)節(jié)作用TNF能夠增強T細胞產(chǎn)生以IL2為主的淋巴因子，提高IL2R的表達水平，從而促進T細胞的增殖；還能促進B細胞增殖、分化和產(chǎn)生抗體。此外，TNF能誘導單核巨噬細胞系統(tǒng)的前體細胞分化，增加其吞噬能力和氧化代謝水平，擴大單核巨噬細胞對腫瘤的ADCC效應(yīng)，提高巨噬細胞的抗原遞呈能力；TNF可增加某些細胞的MHC類分子的表達，協(xié)同IFN誘導MHC類分子的表達；近來還發(fā)現(xiàn)TNF可促進骨髓基質(zhì)細胞和巨噬細胞產(chǎn)生CSF，特別是GMCSF，可促使骨髓釋放中性粒細胞和巨噬細胞。誘發(fā)炎癥反應(yīng)TNF有中性粒細胞和單核細胞趨化作用，并使之活化和脫顆粒，釋放炎癥介質(zhì)19。TNF作用于血管內(nèi)皮細胞，一方面提高粘附分子的表達水平，促進對中性粒細胞的粘附作用；一方面誘使血管內(nèi)細胞產(chǎn)生其它炎癥介質(zhì)，如PG、IL6和IL8等，與白細胞產(chǎn)生的介質(zhì)共同引起局部的炎癥反應(yīng)；活化的血管內(nèi)皮細胞還可釋放凝血第三因子，啟動凝血過程，引起小血管阻塞，造成局部組織（如腫瘤組織）血液供給中斷和出血壞死，這是TNF得以被發(fā)現(xiàn)的主要特征。細菌內(nèi)毒素休克時發(fā)生的彌漫性血管凝血（DIC）即是由于大量的TNF產(chǎn)生和釋放人血所致。此外，TNF還可誘導肝細胞合成急性期反應(yīng)蛋白，是IL1之外又一個急性期反應(yīng)的強力誘導劑。1234PD1受體蛋白早在1992年，ISHIDA等人20首次分離出PD1基因并命名。PD1是一個55KDA的型跨膜表面受體蛋白，胞外區(qū)為免疫球蛋白樣IGV區(qū)。PD1分子最顯著的特征是胞漿區(qū)的尾部含有兩個酪氨酸殘基，N末端酪氨酸殘基參與構(gòu)成一個免疫受體酪氨酸抑制基序（IMMUNORECEPTORTYROSINEBASEDINHIBITORYMOTIF,ITIM）,C末端酪氨酸殘基則參與構(gòu)成一個免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序（IMMUNORECEPTORTYROSINEBASEDSWITCHMOTIF,ITSM），其中后者在PD1介導的負性調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用。與CD28家族其他受體不同的是，其他成員胞外部分都是二硫鍵連接的同源二聚體，而PD1是單體結(jié)構(gòu)；此外，PD1胞外部分的CDR3沒有XXPPP（F/Y）序列（X代表任意氨基酸），而這個序列對于CD28家族其他成員的配體結(jié)合功能是關(guān)鍵性的21,22。小鼠PD1由其1號染色體PDCD1基因編碼，人類PDCD1基因定位于2Q37323。人和小鼠PD1的核苷酸序列具有70的同源性，都編碼一個288個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，并且在氨基酸水平上有60的同源性。TSUDA等24發(fā)現(xiàn)呼吸道上皮細胞可持續(xù)性表達PDL1和PDL2，病毒感染后，病毒DSRNA和聚肌苷酸胞苷酸類似物能刺激其表達水平的上調(diào)。IFN、IL13和T細胞培養(yǎng)上清也有同樣作用，提示呼吸道上皮細胞中的PDL1和PDL2在呼吸道病毒感染的免疫反應(yīng)中有一定的作用。PD1PDL途徑調(diào)節(jié)著有效對抗外來侵襲以及自身免疫反應(yīng)之間的平衡。如研究人員在PD1缺陷小鼠中觀察到它們能夠迅速清除感染機體的腺病毒，但與此同時也發(fā)生了較野生型小鼠更為嚴重的肝損傷25。JUN等26構(gòu)建小鼠單純皰疹性角膜炎模型，應(yīng)用PDL1單抗后，單純皰疹病毒1特異性的CD4T細胞數(shù)量增加，分泌IFN增加，小鼠角膜炎病情加重。這些研究說明了在病毒感染過程中，PD1PDL途徑可以抑制病原特異性T細胞對機體自身的殺傷作用。13缺氧免疫調(diào)控研究現(xiàn)狀流感病毒侵犯呼吸道上皮細胞，尤其是H5N1和H7N9等亞型更可直接侵犯下呼吸道和肺泡上皮細胞，導致重癥肺炎，嚴重影響肺部通氣功能，造成組織缺氧和低血氧癥。因此在流感病毒感染的情況下，體內(nèi)的固有免疫細胞，尤其是肺泡和呼吸道浸潤的固有免疫細胞是在低氧分壓（HYPOXIA,缺氧）的環(huán)境中識別病毒RNA并產(chǎn)生應(yīng)答27。早在1936年，MAGILL等就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在體外細胞培養(yǎng)體系中，缺氧顯著抑制流感病毒感染和擴增效率；1952年KALTER等也發(fā)現(xiàn)缺氧抑制流感病毒在小鼠體內(nèi)的復制,提示缺氧可以提高機體的抗病毒能力，但是迄今其具體機制尚未探明28，更重要的是，臨床上重癥呼吸道病毒感染患者常并發(fā)低氧血癥和“細胞因子風暴”，但它們之間是否存在關(guān)聯(lián)尚未可知。綜上所述，研究缺氧是否上調(diào)固有免疫細胞對病毒的應(yīng)答及其可能的分子機制對于解析重癥呼吸道病毒感染患者體內(nèi)伴發(fā)的細胞因子風暴的形成機制，及有效的治療方案的建立具有重要意義。第二章材料與方法21材料實驗動物C57BL/6J小鼠，68周齡，浙江大學醫(yī)學院動物實驗中心飼養(yǎng)。實驗用細胞系小鼠巨噬細胞系RAW2647實驗室常規(guī)保存。分子克隆實驗相關(guān)試劑大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5A實驗室常規(guī)保存。瓊脂糖DNA回收試劑盒購自AXYGEN。質(zhì)粒小量提取純化試劑盒購自AXYGEN。細胞總RNA抽提試劑TRIZOL購自LIFETECHNOLOGIES。TAQDNA聚合酶，LIGATIONHIGH高效DNA連接酶購自TOYOBO。PRIMERSTAR聚合酶和本實驗用限制性內(nèi)切酶購自TAKARA。本實驗用引物為上海生物工程有限公司合成。PCDNA31BHA質(zhì)粒、LUCNFB、LUCIRF3質(zhì)粒、TA克隆質(zhì)粒實驗室常規(guī)保存。22主要試劑1PBS緩沖液PHOSPHATEBUFFEREDSALINE,PBS1L79GNACL,02GKCL,024GKH2PO4，18GK2HPO4。HCL調(diào)溶液PH值至7274。2DMEM高糖培養(yǎng)基，RPMI1640，胎牛血清、巰基乙醇（2MERCAPTOETHANOL）、胰酶購自GIBCO公司。3TLR2激動劑肽聚糖PGN、TLR3激動剤POLYIC、TLR4激動劑LPS購買自INVIVOGEN公司。4干擾SIRNA以及空白對照購買自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。5轉(zhuǎn)染用試劑JETPEI、JETSIENDO、INTERFERIN購買自PLUSTRANSFECTION公司。6RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，實時熒光定量PCR檢測試劑盒SYBRPREMIXEXTAQTMPERFECTREALTIME購買自TAKARA。7小鼠IL6、TNFA、IFN的ELISA試劑盒購買于EBIOSCIENCE公司。23主要設(shè)備和軟件采用PRIMERPREMIER50引物設(shè)計。APPLIEDBIOSYSTEMS7500REALTIMEPCR系統(tǒng)。數(shù)據(jù)分析軟件為GRAPHPADPRISM5。BIORADPCR儀。THERMO常溫離心機、冷凍離心機。TS1型搖床。THERMOST40R型離心機。OLYMPUSCKX31型顯微鏡。BIORAD電泳儀。THERMONANODROP2000光譜儀。BIORAD凝膠成像系統(tǒng)。BIORADMODEL680酶標儀。ROWSONPSH200生化培養(yǎng)箱。海爾細胞超凈工作臺。AIRTECH細菌臺。SANYOCO2恒溫細胞培養(yǎng)箱。BDFACSCALIBUR流式細胞儀24方法241小鼠腹腔巨噬細胞的分離1將3的脫水硫羥乙酸培養(yǎng)基2ML/只，酒精消毒后，在后肢附近處，用1ML注射器注入小鼠腹腔，注射3天后收集腹腔細胞。2將小鼠用頸推脫臼法處死，后75酒精浸泡3分鐘。3將小鼠表面酒精用鑷子捋干后放入培養(yǎng)皿中，腹面向上。4用鑷子提起小鼠下腹部皮膚，剪開一小口，用鑷子撕開皮膚，完全暴露腹膜。用20ML注射器輕刺入腹腔內(nèi)，注入10ML無血清培養(yǎng)基，針尖朝上，注意避開腸和脂肪，后回抽，朝不同方向反復吹打抽吸腹腔三次，后吸出腹腔液。5將收集的腹腔液放入離心管，于1000RPM離心5分鐘。6用含有10FBS的RPMI1640重懸。觀察若存在紅細胞，用紅細胞裂解液裂解紅細胞。7將細胞懸液置入培養(yǎng)板，于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時后，棄去上清。再用預(yù)熱好的培養(yǎng)基洗一次。培養(yǎng)皿留下的貼壁細胞為新鮮分離的小鼠腹腔原代巨噬細胞。242RNA提取1將RAW2647用培養(yǎng)基吹打后收集到EP管中，300G離心5分鐘，倒掉上清，加1MLPBS后300G離心5分鐘。倒掉上清，后加入1MLTRIZOL,2加入200L的氯仿，劇烈震蕩渦旋使其充分混勻；3室溫下靜置10分鐘。4在低溫高速離心機中4，12000G，離心15分鐘；5離心后液體分為三層，吸取上層液體400L于RNAFREE的EP管中，加入400L異丙醇。上下顛倒六至七次混勻。6室溫放置20分鐘后4，12000G，離心15分鐘。小心地棄去上清。7加入1ML75乙醇（DEPC水配制），4，12000G，離心5分鐘，小心地棄去上清。8再加入1ML無水乙醇于4，12000G，離心5分鐘。小心的棄去上清。室溫下干燥使乙醇完全揮發(fā)后，將RNA溶解于適量的DEPC水。9RNA濃度和純度測定（NANODROP2000）,后保存于80待用。243逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將上步驟提取的RNA放65，5MIN，打開二級結(jié)構(gòu)后冰冷2MIN以上行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄體系如下5PRIMESCRIPTBUFFER2ULPRIMESCRIPTRTENZYMEMIXI05ULOLIGODTPRIMER1LDNTP10MM1LRNA1000NGDEPCH2O補全至10L3715小時后，9810分鐘，放負20度保存，用于實時熒光定量PCR分析。244實時定量PCR上步驟合成的CDNA可做熒光定量PCR的反應(yīng)模板，分別用相應(yīng)的熒光定量PCR引物，進行定量PCR擴增。定量PCR體系為10LSYBRMIX5LCDNA模板100NG上下游引物05LDDH2O補全至10L小鼠ACTIN熒光定量引物上游CTGTCGAGTCGCGTCCACC下游CGCAGCGATATCGTCATCCA小鼠IFN熒光定量引物上游ACCTACAGGGCGGACTTCAA下游GTCTCATTCCACCCAGTGCT小鼠IL6熒光定量引物上游CACTTCACAAGTCGGAGGCT下游CTGCAAGTGCATCATCGTTGT小鼠TNF熒光定量引物上游GATCGGTCCCCAAAGGGATG下游TTTGCTACGACGTGGGCTAC后采用兩步法PCR擴增標準程序。步驟1預(yù)變性9530秒步驟2PCR反應(yīng)955秒6030秒步驟3解離245免疫印跡法1蛋白樣品制備1倒掉培養(yǎng)液，并將殘余培養(yǎng)液流到皿底然后再用移液器將其吸走每孔細胞加2MLPBS。平放輕輕搖動1MIN洗滌細胞，然后棄去洗液。2每孔細胞加含PMSF的裂解液500L，于冰上裂解10MIN。3裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于孔板的一側(cè)，然后用槍將細胞碎片和裂解液移至15ML離心管中整個操作盡量在冰上進行，于4下14000G離心15MIN。4將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入50LBUFFER。70水浴鍋加熱十分鐘，置于30保存。2SDSPAGE電泳1清洗玻璃板，配制濃縮膠與分離膠，配方為10分離膠（兩塊）5濃縮膠（兩塊）DDH2O4ML30聚丙烯酰胺33MLPH88TRISHCL25ML10SDS100LTEMED4LDDH2O34ML30聚丙烯酰胺083MLPH86TRISHCL063ML10SDS50LTEMED5ML2按上面的配方配10分離膠和5的濃縮膠，搖勻灌膠。3加異丙醇壓平，待分離膠凝固倒去膠上層異丙醇并用吸水紙吸干，倒入濃縮膠，插入梳子。4待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。5將一步收的蛋白樣品上樣檢測，每孔10L，MARKER每孔加1L。90V至溴酚蘭剛跑出，終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜。3轉(zhuǎn)膜1依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10MIN。PVDF膜用純甲醇浸泡飽和35S。2裝配轉(zhuǎn)移三明治海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕去氣泡。膠放于負極面（黑色面）。3將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對黑色面），加轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，300MA,90MIN。檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。4免疫反應(yīng)1將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液（含5脫脂奶粉的TBST），室溫40CIRCLE下?lián)u床上搖動封閉1H。2用TBST在室溫下?lián)u床上洗三次，每次5MIN。3將一抗用抗體稀釋液稀釋至適當濃度；室溫下孵育2H或者4孵育過夜，用TBST洗三次，每次5MIN。4同上方法準備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1H后，用TBST在室溫下?lián)u床上洗兩次，每次10MIN；再用TBS洗兩次，每次10MIN。5化學發(fā)光法檢測1根據(jù)膜的大小，按每10CM2膜混合1ML溶液A和1ML溶液B，混勻，配制成發(fā)光檢測工作液。2膜的蛋白面朝上，置于潔凈保鮮膜上。將配制的發(fā)光檢測液轉(zhuǎn)移到蛋白膜上，使其均勻覆蓋，室溫孵育12分鐘。3暗室中曝光，根據(jù)其曝光強度，縮短或延長曝光時間，保存圖片。246過表達質(zhì)粒的構(gòu)建PCR反應(yīng)體系為50ULKODPLUSNEO10PCRBUFFERFORKODPLUSNEO5L2MMDNTPS5L25MMMGSO43LSENSEPRIMER10UM1LANTISENSEPRIMER10UM1LCDNA模板200NGKODPLUSNEOENZYME1LDDH2O補齊至50L反應(yīng)條件為95,3MIN98,10S退火溫度6130S35CYCLE68150S68,5MIN將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，后選擇2KB條帶進行膠回收，按說明書中操作步驟進行。后雙酶切37過夜。雙酶切體系（20L）XHOI2LBAMHI2LTANGOBUFFER2L質(zhì)粒2L膠回收產(chǎn)物2LH2O補齊至20L將酶切過夜后的質(zhì)粒和基因片段進行凝膠電泳，選擇7KB和2KB的條帶做膠回收。將膠回收產(chǎn)物進行連接反應(yīng)。反應(yīng)體系BUFFER2LLIGASE1L載體基因片段摩爾質(zhì)量比14（質(zhì)粒100NG）水補齊至20L在PCR儀上連接221H連接結(jié)束后，進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化取DH5一支，瞬離后，將連接產(chǎn)物全部加入，冰浴30MIN。后熱激4290S，放冰上12MIN后，加入無抗性LB200L，3740MIN后，與無菌操作臺中涂板，過夜。過夜后取出培養(yǎng)板（帶有氨芐抗性），挑選單個菌落，加入4ML帶有氨芐抗性的LB培養(yǎng)基，搖菌37過夜。按照小質(zhì)量質(zhì)粒提取試劑盒說明進行質(zhì)粒提取，測濃度和純度260NM/280NM比值。取1G質(zhì)粒提取物雙酶切2H，鑒定質(zhì)粒，體系同上。將四管細菌送公司（INVITROGEN）測序，質(zhì)粒于20保存。247酶聯(lián)免疫吸附測定法操作步驟1加樣分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕藴势范鳶IRNA干擾PD1可以部分模擬缺氧對H1N1刺激的巨噬細胞分泌IFN1、TNF和IL6的促進效應(yīng)。RAW2647細胞轉(zhuǎn)染PD1SIRNA48小時后，給H1N1病毒刺激，在相應(yīng)時間點收集細胞WESTERNBLOT檢測蛋白相關(guān)蛋白水平圖4C）。相比于干擾對照組，特異性干擾PD1組的巨噬細胞在H1N1病毒刺激下SHP2活化水平降低，并表達高水平的RIGI蛋白。巨噬細胞在H1N1病毒刺激表達低水平PSHP2和高水平的RIGI蛋白。圖3缺氧對PD1表達的影響。左圖為對照組，右圖為受病毒感染的巨噬細胞PD1在缺氧和常氧條件下的表達。FIG3THEEFFECTOFHYPOXIAONMACROPHAGELEFTPICTUREISTHECONTROLGROUPRIGHTPICTUREISTHEEXPRESSIONOFPD1INMACROPHAGEINFECTEDBYVIRUSUNDERHYPOXICANDNORMOXICCONDITIONS圖4缺氧通過PD1依賴的機制調(diào)控RIGI的表達圖4APD1過表達時巨噬細胞表達IFN、TNF、IL6的水平。圖4BPD1表達下調(diào)時巨噬細胞表達IFN、TNF、IL6的水平。圖4C左圖是干擾對照組，右圖為轉(zhuǎn)染PD1SIRNA巨噬細胞相關(guān)蛋白的表達水平。FIG4HYPOXIAREGULATESTHEEXPRESSIONOFRIGITHROUGHPD1DEPENDENTMECHANISMFIG4ATHEEXPRESSIONOFIFN、TNFANDIL6INMACROPHAGEWHENOVEREXPRESSPD1FIG4BTHEEXPRESSIONOFIFN、TNFANDIL6INMACROPHAGEWHENDOWNREGULATEPD1FIG4LEFTPICTUREISTHECONTROLGROUPOFINTERFERENCERIGHTPICTUREISTHEEXPRESSIONOFTHEPROTEINRELATEDINMACROPHAGETRANSFECTEDBYPD1SIRNA32討論機體免疫系統(tǒng)的中心任務(wù)是區(qū)分自我和非我，識別和消除侵襲的病原微生物，我們通過實驗發(fā)現(xiàn)缺氧顯著促進巨噬細胞對H1N1流感病毒的免疫應(yīng)答。RIG樣受體作為模式識別受體可以識別病毒DSRNA，激活下游信號級聯(lián)反應(yīng)。誘導進而激活特定的細胞因子和趨化因子的表達，RIG屬于解旋酶家族，其N段含有兩個串聯(lián)的級聯(lián)激活和招募結(jié)構(gòu)域CASPASEACTIVATIONANDRECRUITMENTDOMAINS,CARDS。這些結(jié)構(gòu)域的相互作用促進了RIG結(jié)合到下游同樣含有CARD結(jié)構(gòu)域的重要的接頭分子MAVS（MITOCHONDRIALANTIVIRALSIGNALINGPROTEIN）,引起MAVS的活化，進而將信號轉(zhuǎn)導給下游的TRAF3（TUMORNECROSISFACTORTNFRASSOCIATEDFACTOR3）、TBK1激酶和IKK1復合體，進而磷酸化活化IRF3/729，活化的IRF3/7轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，并誘導型干擾素的產(chǎn)生，而活化的MAVS還可以通過TRAF2/6或者FADD（FASASSOCIATEDDEATHDOMAIN）、RIP1（RECEPTORINTERACTINGPROTEIN1）、TRADD（TANKBINDINGKINASE1）CASPASE8/10通路將信號轉(zhuǎn)到給IKK復合物，最后導致NFB和IKB復合物的磷酸化，磷酸化的IKB從NFB上脫落并降解，活化的NFB入核促進促炎癥因子和炎性趨化因子的產(chǎn)生30，從而抑制病毒的復制和傳播，同樣RIGI通路也可被泛素化負調(diào)控，E3泛素酶可以將K48泛素鏈結(jié)合到RIGI，促進其被蛋白酶體降解31，泛素化修飾可以作用于信號通路中的各種分子來抑制RLR信號通路的轉(zhuǎn)導。PD1PDL1途徑對外來抗原進行免疫應(yīng)答表現(xiàn)為負性免疫調(diào)節(jié)功能32，PD1可募集酪氨酸磷酸酶和增加SHP2的磷酸化，SHP2的活化可以促進RIG蛋白的泛素化和降解，起到免疫負向調(diào)控作用。本實驗通過腹腔注射H1N1流感病毒構(gòu)建小鼠感染暴發(fā)模型，并給予氯化鈷注射（誘導缺氧信號）和高壓氧療（糾正缺氧）處理，及相應(yīng)對照組（H1N1氯化鈷實驗組、H1N1氧療實驗組，和H1N1PBS實驗組、PBS氯化鈷對照組、PBS氧療對照組、PBSPBS對照組）。我們發(fā)現(xiàn)相比于H1N1PBS實驗組，H1N1氯化鈷實驗組小鼠生存率顯著降低，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)H1N1氯化鈷實驗組小鼠血清I型干擾素和炎癥因子TNF和IL6水平明顯高于H1N1PBS實驗組；而H1N1氧療實驗組小鼠生存率顯著高于H1N1PBS實驗組，其血清IFN1、TNF和IL6水平也低于H1N1氯化鈷實驗組和H1N1PBS實驗組。該結(jié)果提示組織缺氧和低血氧癥可能是重癥呼吸道病毒感染宿主體內(nèi)細胞因子風暴產(chǎn)生的重要病理基礎(chǔ)之一。鑒于巨噬細胞在抗病毒免疫應(yīng)答中的重要作用，我們首先檢測缺氧影響其抗病毒免疫應(yīng)答反應(yīng)能力。我們發(fā)現(xiàn)在低氧環(huán)境中，巨噬細胞對H1N1病毒刺激的應(yīng)答顯著增加，產(chǎn)生的IFN1、TNF和IL6水平顯著高于常氧（21O2）培養(yǎng)H1N1刺激組。該結(jié)果與小鼠體內(nèi)實驗結(jié)果是一致的。為了進一步研究缺氧調(diào)控巨噬細胞分泌I型干擾素和炎癥因子的機制，我們篩查了可能相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)分子，發(fā)現(xiàn)H1N1流感病毒刺激顯著上調(diào)巨噬細胞膜表面的免疫抑制性受體PD1的表達。但在低氧培養(yǎng)系統(tǒng)里，H1N1誘導的PD1表達顯著被抑制；更重要的是，在巨噬細胞上過表達PD1部分中和了缺氧對巨噬細胞抗病毒應(yīng)答反應(yīng)的促進作用。而SIRNA干擾PD1顯著增強巨噬細胞抗病毒反應(yīng)強度。SHP2的活化可以促進RIGI蛋白的泛素化和降解，而PD1與配體結(jié)合后，胞內(nèi)ITIM序列招募并活化SHP2，介導信號的下游傳導，缺氧通過下調(diào)PD1的表達，抑制SHP2活化，進而上調(diào)RNA病毒受體RIGI的表達。而對低氧處理的巨噬細胞檢測發(fā)現(xiàn)其SHP2磷酸化水平顯著下調(diào)，而RIGI表達水平增加。33結(jié)論體內(nèi)試驗和體外實驗表明，在缺氧條件下，H1N1流感病毒刺激，巨噬細胞對病毒的固有免疫應(yīng)答會顯著增強，產(chǎn)生的IFN1、TNF和IL6水平顯著高于常氧培養(yǎng)的巨噬細胞，并且缺氧抑制病毒感染介導的PD1的上調(diào)，和SHP2的活化，從而阻斷了對RIGI信號的負反饋機制，導致RIGI蛋白水平顯著增加（HYPOXIAHIFSPD1SHP2RIGI軸），誘發(fā)過度的抗病毒免疫應(yīng)答，造成干擾素和炎癥因子的體內(nèi)大量聚集，增加小鼠的死亡率。參考文獻1NISHIYAMAM,YOSHIDAY,SATOM,NISHIOKAM,KATOT,KANAIT,ISHIWATAT,WAKAMATSUH,NAKAGAWAS,KAWANAA,NONOYAMASCHARACTERISTICSOFPAEDIATRICPATIENTSWITH2009PANDEMICINFLUENZAAH1N1ANDSEVERE,OXYGENREQUIRINGPNEUMONIAINTHETOKYOREGION,1SEPTEMBER31OCTOBER2009EUROSURVEILL2010,152MORINETF,CASETTIL,FRANCOISJH,CAPRONC,PILLETSOXYGENTENSIONLEVELANDHUMANVIRALINFECTIONSVIROLOGY2013,44431363CHENE,WANGF,LVH,ZHANGY,DINGH,LIUS,CAIJ,XIEL,XUX,CHAIC,ETALTHEFIRSTAVIANINFLUENZAAH7N9VIRALINFECTIONINHUMANSINZHEJIANGPROVINCE,CHINAADEATHREPORTFRONTMED2013,73333444CHENY,LIANGW,YANGS,WUN,GAOH,SHENGJ,YAOH,WOJ,FANGQ,CUID,ETALHUMANINFECTIONSWITHTHEEMERGINGAVIANINFLUENZAAH7N9VIRUSFROMWETMARKETPOULTRYCLINICALANALYSISANDCHARACTERISATIONOFVIRALGENOMELANCET2013,381191619255VINCENTRN,MOOREJ,BEEKMANRH,BENSONL,BERGERSENL,HOLZERR,JAYARAMN,JENKINSK,RINGELR,ROMEJ,MARTINGRPROCEDURALCHARACTERISTICSANDADVERSEEVENTSINDIAGNOSTICANDINTERVENTIONALCATHETERISATIONSINPAEDIATRICANDADULTCHDINITIALREPORTFROMTHEIMPACTREGISTRYCARDIOLYOUNG2015196WENH,LEIY,EUNSY,TINGJPPLEXINA4SEMAPHORIN3ASIGNALINGISREQUIREDFORTOLLLIKERECEPTORANDSEPSISINDUCEDCYTOKINESTORMJEXPMED2010,207294329577TEIJAROJR,WALSHKB,RICES,ROSENH,OLDSTONEMBMAPPINGTHEINNATESIGNALINGCASCADEESSENTIALFORCYTOKINESTORMDURINGINFLUENZAVIRUSINFECTIONPROCNATLACADSCIUSA2014,111379938048WALSHKB,TEIJAROJR,WILKERPR,JATZEKA,FREMGENDM,DASSC,WATANABET,HATTAM,SHINYAK,SURESHM,ETALSUPPRESSIONOFCYTOKINESTORMWITHASPHINGOSINEANALOGPROVIDESPROTECTIONAGAINSTPATHOGENICINFLUENZAVIRUSPROCEEDINGSOFTHENATIONALACADEMYOFSCIENCESOFTHEUNITEDSTATESOFAMERICA2011,10812018120239JANEWAYCA,JRAPPROACHINGTHEASYMPTOTEEVOLUTIONANDREVOLUTIONINIMMUNOLOGYCOLDSPRINGHARBSYMPQUANTBIOL1989,54PT111310LOOYM,GALEM,JRIMMUNESIGNALINGBYRIGILIKERECEPTORSIMMUNITY2011,3468069211OSORIOF,REISESOUSACMYELOIDCTYPELECTINRECEPTORSINPATHOGENRECOGNITIONANDHOSTDEFENSEIMMUNITY2011,3465166412ELINAVE,STROWIGT,HENAOMEJIAJ,FLAVELLRAREGULATIONOFTHEANTIMICROBIALRESPONSEBYNLRPROTEINSIMMUNITY2011,3466567913DALODM,SALAZARMATHERTP,MALMGAARDL,LEWISC,ASSELINPATURELC,BRIEREF,TRINCHIERIG,BIRONCAINTERFERONALPHA/BETAANDINTE