安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文分類號(hào)UDCR75863R3945密級(jí)編號(hào)學(xué)位論文中國(guó)漢族人銀屑病外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)3個(gè)新的易感位點(diǎn)THREENEWPSORIASISSUSCEPTIBILITYLOCIWEREIDENTIFIEDBYEXOMESEQUENCINGINHANCHINESEPOPULATION博士研究生盛宇俊指導(dǎo)教師姓名張學(xué)軍教授安徽醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所楊森教授安徽醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別提交論文日期博士2013年12月專業(yè)名稱論文答辯日期皮膚病與性病學(xué)2013年12月學(xué)位授予單位和日期安徽醫(yī)科大學(xué)答辯委員會(huì)主席教授評(píng)閱人教授2013年12月安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文論文題目中國(guó)漢族人銀屑病外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)3個(gè)新的易感位點(diǎn)THREENEWPSORIASISSUSCEPTIBILITYLOCIWEREIDENTIFIEDBYEXOMESEQUENCINGINHANCHINESEPOPULATION作者姓名指導(dǎo)教師學(xué)科專業(yè)研究方向工作時(shí)間盛宇俊張學(xué)軍教授楊森教授皮膚病與性病學(xué)遺傳性皮膚病2011年03月至2013年10月資助本課題的基金項(xiàng)目973計(jì)劃前期研究專項(xiàng)（2011CB512103）973計(jì)劃前期研究專項(xiàng)（2012CB722404）國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81072461）國(guó)家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81222022）安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名日期學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本人完全了解安徽醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文并向國(guó)家主管部門或其指定機(jī)構(gòu)送交論文的電子版和紙質(zhì)版，有權(quán)允許論文進(jìn)入學(xué)校圖書館被查閱，有權(quán)將學(xué)位論文的內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，有權(quán)將學(xué)位論文的標(biāo)題和摘要匯編出版。愿意將本人的學(xué)位論文提交中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)、中國(guó)優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)和中國(guó)學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)中全文發(fā)表，并可以以電子、網(wǎng)絡(luò)及其他數(shù)字媒體形式公開出版，并同意編入CNKI中國(guó)知識(shí)資源總庫(kù)，在中國(guó)博碩士學(xué)位論文評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫(kù)中使用和在互聯(lián)網(wǎng)上傳播。保密的學(xué)位論文在解密后適用本規(guī)定。學(xué)位論文作者簽名日期導(dǎo)師簽名日期安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文目錄英文縮略詞表1中文摘要4英文摘要7正文111引言1111研究背景1112本課題的研究設(shè)計(jì)方案172實(shí)驗(yàn)材料與方法1921研究對(duì)象1922實(shí)驗(yàn)試劑1923研究?jī)x器2124電子數(shù)據(jù)庫(kù)和分析軟件2325DNA提取與標(biāo)化2726全基因組外顯子測(cè)序和靶向測(cè)序3127SEQUENOMMASSARRAY系統(tǒng)基因分型3928數(shù)據(jù)分析503結(jié)果5231全基因組外顯子測(cè)序階段5332靶向測(cè)序階段6333已知免疫疾病相關(guān)候選基因的非同義風(fēng)險(xiǎn)SNVS6634既往報(bào)道的易感基因非同義SNVS驗(yàn)證情況7435錯(cuò)義風(fēng)險(xiǎn)SNVS和既往GWAS報(bào)道的SNPS的條件回歸分析和單體型分析7636已知免疫疾病相關(guān)基因以外的非同義風(fēng)險(xiǎn)SNVS7837對(duì)罕見非同義變異的GENEBASED關(guān)聯(lián)分析7838全基因組外顯子測(cè)序和靶向測(cè)序?qū)Ψ蔷幋a區(qū)域易感基因發(fā)現(xiàn)情況8039基因分型驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果83安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文4討論865結(jié)論97參考文獻(xiàn)98附錄109個(gè)人簡(jiǎn)歷109個(gè)人技能109在讀期間獲獎(jiǎng)勵(lì)情況109參與基金項(xiàng)目109參加學(xué)術(shù)會(huì)議109在讀期間發(fā)表文章110致謝114課題綜述115銀屑病易感基因研究進(jìn)展115參考文獻(xiàn)134安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文英文縮略詞表英文縮寫CARD14CDCD27CDSCHBCHD4CIDHSDNAEDTAERAP1FIGFUT2GDNAGJB2GWASHAPMAPHGPHLAHWEIIBDIFIH1IKZF3IL英文全名CASPASERECRUITMENTDOMAINFAMILY,MEMBER14CROHNSDISEASECD27MOLECULECODINGSEQUENCECHINESEHANINBEIJINGCHROMODOMAINHELICASEDNABINDINGPROTEIN4CONFIDENCEINTERVALDEOXYRIBONUCLEASEIHYPERSENSITIVESITESDEOXYRIBONUCLEICACIDETHYLENEDIAMINETETRAACETATEENDOPLASMICRETICULUMAMINOPEPTIDASE1FIGUREFUCOSYLTRANSFERASE2GENOMICDNAGAPJUNCTIONPROTEIN,BETA2GENOMEWIDEASSOCIATIONSTUDYHUMANHAPLOTYPEMAPHUMANGENOMEPROJECTHUMANLEUKOCYTEANTIGENHARDYWEINBERGEQUILIBRIUMCODINGINDELINFLAMMATORYBOWELDISEASEINTERFERONINDUCEDWITHHELICASECDOMAIN1IKAROSFAMILYZINCFINGER3INTERLEUKIN1中文全名半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域家族成員14克羅恩病CD27分子編碼序列中國(guó)北京漢族人染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白4可信區(qū)間脫氧核糖核酸酶1超敏感位點(diǎn)脫氧核糖核酸乙二胺四乙酸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨肽酶1圖巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶2基因組DNA縫隙連接蛋白2全基因組關(guān)聯(lián)分析研究人類單體型圖人類基因組計(jì)劃人類白細(xì)胞抗原遺傳平衡編碼區(qū)插入/缺失炎癥性腸病干擾素誘導(dǎo)與解旋酶C結(jié)構(gòu)域1IKAROS家族鋅指蛋白3白介素安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文LAG3LCE3DLDLODMAFMHCNCBINFKB1NFBNGSNNLYMPHOCYTEACTIVATIONGENE3LATECORNIFIEDENVELOPE3DLINKAGEDISEQUILIBRIUMLOGODDSMINORALLELEFREQUENCYMAJORHISTOCOMPATIBILITYCOMPLEXNATIONALCENTERFORBIOTECHNOLOGYINFORMATIONNUCLEARFACTOROFKAPPALIGHTPOLYPEPTIDEGENEENHANCERINBCELLS1NUCLEARFACTORBINDINGNEXTGENERATIONSEQUENCINGNORMALSKINFROMCONTROLS淋巴細(xì)胞活化基因3晚期角質(zhì)化包膜3D連鎖不平衡優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)最小等位基因頻率主要組織相容性復(fù)合體美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心B細(xì)胞輕鏈多肽基因增強(qiáng)核因子1核轉(zhuǎn)錄因子B二代測(cè)序?qū)φ盏恼ＦつwNOD2NUCLEOTIDEBINDINGCONTAINING2OLIGOMERIZATIONDOMAIN寡聚核苷酸結(jié)合域2NSODOMIMORPCAPCRPNPPQCQQPLOTRARNARNF114RPMNONSYSNONYMOUSOPTICALDELNSITYONLINEMENDELIANINHERITANCEINMANODDSRATIOPRINCIPALCOMPONENTSANALYSISPOLYMERASECHAINREACTIONUNINVOLVEDSKINFROMCASESINVOLVEDSKINFROMCASESQUALITYCONTROLQUANTILEQUANTILEPLOTSRHEUMATOIDARTHRITISRIBONUCLEICACIDRINGFINGERPROTEIN114REVOLUTIONSPERMINUTE2非同義光密度人類在線孟德爾遺傳優(yōu)勢(shì)比主成份分析聚合酶鏈反應(yīng)患者的未受累皮膚患者的受累皮膚質(zhì)量控制QQ圖風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎核糖核酸環(huán)指蛋白114每分鐘轉(zhuǎn)速安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文SAPSLESNPSNVSST1DTABTARBP1TI/TVTRSHRIMPALKALINEPHOSPHATASESYSTEMICLUPUSERYTHEMATOSUSSINGLENUCLEOTIDEPOLYMORPHISMSINGLENUCLEOTIDEVARIANTSSPLICEACCEPTORANDDONORSITETYPE1DIABETESTABLETARHIV1RNABINDINGPROTEIN1TRANSITION/TRANSVERSIONTARGETREGION蝦堿酶系統(tǒng)性紅斑狼瘡單核苷酸多態(tài)性單核苷酸變異剪切位點(diǎn)1型糖尿病表TAR（HIV1）RNA結(jié)合蛋白1轉(zhuǎn)換/顛換目標(biāo)區(qū)域TRAF3IP2TRAF3INTERACTINGPROTEIN2TRAF3交互蛋白2TYK2UCSCUTRZNF816ATYROSINEKINASE2UNIVERSITYOFCALIFORNIASANTACRUZUNTRANSLATIONREGIONZINCFINGERPROTEIN816A3酪氨酸激酶加州大學(xué)圣克魯茲分校非翻譯區(qū)鋅指蛋白816A安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文中國(guó)漢族人銀屑病外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)3個(gè)新的易感位點(diǎn)博士研究生盛宇俊研究生導(dǎo)師張學(xué)軍教授楊森教授中文摘要研究背景銀屑病是一種慢性的多因素的皮膚疾病，該病以界限清楚的紅色斑塊附著銀色的鱗片為特征。目前該病的病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚，炎癥介質(zhì)的異常產(chǎn)生在銀屑病發(fā)病中發(fā)揮重要作用。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為銀屑病的發(fā)生是遺傳與環(huán)境相互作用的結(jié)果，其中遺傳因素在銀屑病的發(fā)病中起到重要作用，并且該病是由多個(gè)易感基因共同參與的復(fù)雜性疾病。銀屑病的患病率在世界各地差異較大，與種族、地理位置、環(huán)境等因素有關(guān)?？傮w上，高加索人群的患病率約為23，而日本人的患病率較低且絕大多數(shù)銀屑病患者為散發(fā)。我國(guó)銀屑病的患病率約為0123，總患病人數(shù)接近1,000萬例，分布趨勢(shì)表現(xiàn)為男性患病率高于女性，北方高于南方，城市高于農(nóng)村。國(guó)內(nèi)1043例尋常型銀屑病患者及其家族成員的遺傳流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)一、二級(jí)親屬的發(fā)病率明顯高于一般人群，一、二級(jí)親屬的遺傳度分別為6704和4659，且隨親緣系數(shù)的增加呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。隨著遺傳學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展和研究方法的更新，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在銀屑病遺傳學(xué)領(lǐng)域研究方面作出了大量的工作，發(fā)現(xiàn)了一批有價(jià)值的疾病易感基因/區(qū)域?！岸ㄎ豢寺　焙汀岸ㄎ缓蜻x克隆”的方法是研究孟德爾遺傳模式疾病遺傳學(xué)基礎(chǔ)、發(fā)現(xiàn)疾病致病基因的主要方法。在上個(gè)世紀(jì)末，科學(xué)家們嘗試著把遺傳連鎖分析研究的方法應(yīng)用到銀屑病的易感基因研究中。目前，通過連鎖分析方法運(yùn)用定位克隆和全基因組掃描的方法共計(jì)在全基因組范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)了10個(gè)銀屑病易感位點(diǎn)1Q21、1P、3Q21、4Q、4Q31Q34、6P2133、16Q、17Q25、18P1123和19P13。隨著分型技術(shù)的迅速發(fā)展和分型成本的不斷降低、覆蓋整個(gè)人類基因組的高通量商業(yè)化SNP檢測(cè)芯片的出現(xiàn)和不斷更新，4（安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文全基因組關(guān)聯(lián)研究（GENOMEWIDEASSOCIATIONSTUDY，GWAS）得到發(fā)展。國(guó)內(nèi)外研究團(tuán)隊(duì)通過大規(guī)模GWAS發(fā)現(xiàn)了超過40個(gè)銀屑病易感基因或位點(diǎn)。然而，目前發(fā)現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)變異大多數(shù)可能僅是標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性（SNP），這些易感基因的功能性編碼變異，尤其是低頻和罕見的變異在GWAS研究中被忽略，因此沒有進(jìn)行系統(tǒng)性研究。目的本研究主要是評(píng)估功能性編碼變異在整個(gè)銀屑病遺傳度上的貢獻(xiàn)，并試圖發(fā)現(xiàn)銀屑病的其他關(guān)聯(lián)信號(hào)。方法我們?cè)趦蓚€(gè)獨(dú)立中國(guó)漢族人群（包括21,309例樣本）中對(duì)功能性編碼變異進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序分析研究。首先，我們對(duì)781例患者和676例對(duì)照樣本的全基因組外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因非同義單核苷酸變異（SNVS）分析，并在9,946例患者和9,906例對(duì)照的1,326個(gè)候選基因的靶向測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證分析。對(duì)于非編碼區(qū)域SNVS，我們進(jìn)行深入的數(shù)據(jù)分析并在大規(guī)模測(cè)序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上對(duì)22個(gè)提示SNVS在另外一個(gè)獨(dú)立中國(guó)漢族人群（4,480例患者和6,521例對(duì)照）中進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以發(fā)現(xiàn)銀屑病的其他關(guān)聯(lián)信號(hào)。結(jié)果對(duì)于非同義SNVS，我們發(fā)現(xiàn)6個(gè)常見和低頻SNVS在兩個(gè)獨(dú)立的測(cè)序樣本（全基因組外顯子測(cè)序和靶向測(cè)序）中關(guān)聯(lián)性一致，并在聯(lián)合分析中達(dá)到全基因組顯著水平，包括IL23R基因上的CHR167421184（CG530A）（PEXOMETARGET1941011，OR072）、GJB2基因上的RS72474224（CG324A）（PEXOMETARGET7461011，OR134）、LCE3D基因上的RS512208（CC185A）（PEXOMETARGET2921023，OR124）、ERAP1基因上的RS27044（CC2535G）PEXOMETARGET2161014，OR086）和RS26653（CG727C）PEXOMETARGET5271012，OR087）以及ZNF816A基因上的RS12459008（CT590A）（PEXOMETARGET225109，OR088）。在FUT2基因上，我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)常見錯(cuò)義變異RS1047781（CA418T）（PEXOMETARGET278106，OR110）和兩個(gè)罕見錯(cuò)義變異（CHR1953898296/CC271T和CHR1953898541/CC516G）（PEXOMETARGET551105，OR361和PEXOMETARGET292103,OR692）具有提示相關(guān)性。對(duì)于非編碼SNVS，我們驗(yàn)證了既往報(bào)道的4個(gè)銀屑病易感基因，包括IL12B（RS2288831，PEXOMETARGET2301020，OR083）、IFIH1（RS13431841，PEXOMETARGET2961009，5安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文OR083）、ERAP1（RS27043，PEXOMETARGET6501012，OR087）和RNF114（RS4647954，PCOMBINED2411007，OR109），并發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新的易感位點(diǎn)達(dá)到全基因組顯著水平，包括NFKB1（RS1020760，PEXOMETARGET2191008，OR112；RS1609798，PEXOMETARGET9871008，OR112），12P133（RS758739，PCOMBINED4081008，OR091；RS2243750，PCOMBINED4381008，OR091）和17Q12（RS10852936，PCOMBINED1961008，OR110；RS12936231，PCOMBINED5021008，OR110）。此外，我們還發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)位點(diǎn)具有提示意義，分別是3P2131（RS1863837，PCOMBINED3911007，OR090）和17Q25（RS3744017，PCOMBINED5831007，OR112）。結(jié)論本研究結(jié)果提示編碼區(qū)變異，至少是低頻或者罕見非同變異對(duì)銀屑病的整體遺傳度貢獻(xiàn)非常有限，此外，本研究增加了銀屑病確定的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)數(shù)量。關(guān)鍵詞銀屑病/單核苷酸變異/外顯子測(cè)序/易感基因/遺傳學(xué)6安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文THREENEWPSORIASISSUSCEPTIBILITYLOCIWEREIDENTIFIEDBYEXOMESEQUENCINGINHANCHINESEPOPULATIONDRCANDIDATEYUJUNSHENGADVISORSPROFESSORXUEJUNZHANGHOWEVER,MOSTOFTHEIDENTIFIEDRISKVARIANTSAREEXPECTEDTOBETAGGINGSNPS,ANDTHEFUNCTIONALCODINGVARIANTSOFTHESESUSCEPTIBILITYGENES,PARTICULARLYTHOSETHATAREOFLOWFREQUENCYANDRARE,ARELARGELYREFRACTORYTOTHEINTERROGATIONBYGWASANDHAVETHEREFORENOTBEENSYSTEMATICALLYINVESTIGATEDOBJECTIVETHISSTUDYAIMEDTOINVESTIGATETHECONTRIBUTIONOFFUNCTIONALCODINGVARIANTSANDNONCODINGVARIANTSTOTHEGENETICSUSCEPTIBILITYOFPSORIASISANDIDENTIFIYADDITIONALASSOCIATIONWITHTHEDISEASEMETHODWECARRIEDOUTALARGESCALESEQUENCINGANALYSISOFFUNCTIONALCODINGVARIANTSINTWOINDEPENDENTSAMPLESCOMPRISING21,309INDIVIDUALSOFCHINESEHANFIRST,WEANALYZEDWHOLEGENOMENONSYNONYMOUSSINGLENUCLEOTIDEVARIANTSSNVSBYEXOMESEQUENCINGIN781CASESAND676CONTROLS,ANDFOLLOWINGVALIDATIONON1,326CANDIDATEGENESBYTARGETEDSEQUENCINGIN9,946CASESAND9,906CONTROLSOFCHINESEPOPULATIONFORTHENONCODINGSNVS,WEPERFORMEDINDEPTHDATAANALYSISANDAREPLICATIONSTUDYFOR22SNVSINANINDEPENDENTCOHORTOFCHINESEHANCONSISTINGOF4,480CASESAND8安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文6,521CONTROLSBASEDONTHELARGESCALESEQUENCINGDATA10,727CASESAND10,582CONTROLSTOFINDADDITIONALASSOCIATIONWITHTHEDISEASERESULTFORTHENONSYNONYMOUSSNVS,WEDISCOVERED6COMMONANDLOWFREQUENCYMISSENSESNVSTHATSHOWEDCONSISTENTASSOCIATIONINTHETWOINDEPENDENTSAMPLESOFEXOMEANDTARGETEDSEQUENCINGANALYSESANDACHIEVEDGENOMEWIDESIGNIFICANCEINCOMBINEDANALYSISCHR167421184CG530AATIL23RPEXOMETARGET1941011,OR072,RS72474224CG324AATGJB2PEXOMETARGET7461011,OR134,RS512208CC185AATLCE3DPEXOMETARGET2921023,OR124,RS27044CC2535GANDRS26653CG727CATERAP1PEXOMETARGET2161014,OR086ANDPEXOMETARGET5271012,OR087,ANDRS12459008CT590AATZNF816APEXOMETARGET225109,OR088ONECOMMONMISSENSESNVRS1047781CA418TANDTWORAREMISSENSESNVSCHR1953898296/CC271TANDCHR1953898541/CC516GINFUT2WEREALSOIDENTIFIEDWITHSUGGESTIVEASSOCIATIONEVIDENCEPEXOMETARGET278106,OR110,PEXOMETARGET551105,OR361ANDPEXOMETARGET292103,OR692,RESPECTIVELYFORTHENONCODINGSNVS,WECONFIRMED4PREVIOUSLYREPORTEDPSORIASISSUSCEPTIBILITYGENESIL12BRS2288831,PEXOMETARGET2301020,OR083,IFIH1RS13431841,PEXOMETARGET2961009,OR083,ERAP1RS27043,PEXOMETARGET6501012,OR087ANDRNF114RS4647954,PCOMBINED2411007,OR109,ANDIDENTIFIED3NEWSUSCEPTIBILITYLOCIEXCEEDEDTHEGENOMEWIDESIGNIFICANCETHRESHOLDNFKB1RS1020760,PEXOMETARGET2191008,OR112RS1609798,PEXOMETARGET9871008,OR112,12P133RS758739,PCOMBINED4081008,OR091RS2243750,PCOMBINED4381008,OR091AND17Q12RS10852936,PCOMBINED1961008,OR110,RS12936231,PCOMBINED5021008,OR110WEALSOIDENTIFIED2ADDITIONALLOCIEXHIBITINGSUGGESTIVEEVIDENCEOFANASSOCIATION3P2131RS1863837,PCOMBINED3911007,OR090AND17Q25RS3744017,PCOMBINED5831007,OR1129安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文CONCLUSIONTHERESULTSOFTHISSTUDYINDICATEDTHATCODINGVARIANTS,ATLEASTNONSYNONYMOUSONESWITHLOWANDRAREFREQUENCYMIGHTHAVELIMITEDCONTRIBUTIONTOTHEOVERALLGENETICRISKOFPSORIASISANDINCREASETHENUMBEROFCONFIRMEDPSORIASISRISKLOCIKEYWORDSPSORIASIS/SINGLENUCLEOTIDEVARIANTS/EXOMESEQUENCING/SUSCEPTIBILITYGENE/GENETICS10安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文正文中國(guó)漢族人銀屑病外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)3個(gè)新的易感位點(diǎn)博士研究生盛宇俊導(dǎo)師張學(xué)軍教授楊森教授1引言11研究背景銀屑?。≒SORIASIS）【OMIM177900】是一種常見的反復(fù)發(fā)作、以表皮增殖和炎癥為特征的免疫相關(guān)性皮膚病，嚴(yán)重的影響健康和生活質(zhì)量。該病屬于皮膚病領(lǐng)域常見重大疾病，一直困擾世界各地廣大患者，尚缺乏有效的治療方法，被稱為“不死的癌癥”。臨床上多見于青壯年，以紅斑、鱗屑為主要表現(xiàn)，易復(fù)發(fā)、難根治，約1040的患者具有關(guān)節(jié)損傷，常伴發(fā)腫瘤、自身免疫等其他系統(tǒng)疾病，且多數(shù)患者終身患病。銀屑病的患病率在世界各地差異較大，與種族、地理位置、環(huán)境等因素有關(guān)?？傮w上，高加索人群的患病率約為23，而日本人的患病率較低且絕大多數(shù)銀屑病患者為散發(fā)1,2。我國(guó)銀屑病的患病率約為0123，總患病人數(shù)接近1,000萬例3,4，分布趨勢(shì)表現(xiàn)為男性患病率高于女性，北方高于南方，城市高于農(nóng)村。該病容易復(fù)發(fā)、難以根治、大多數(shù)患者終身患病，約40患者具有關(guān)節(jié)損傷，常伴發(fā)癌癥及自身免疫等其他系統(tǒng)疾病，因此給患者身心帶來11安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文極大痛苦。然而到目前為止，銀屑病的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為銀屑病的發(fā)生是遺傳與環(huán)境相互作用的結(jié)果，其中遺傳因素在銀屑病的發(fā)病中起到重要作用，并且該病是由多個(gè)易感基因共同參與的復(fù)雜性疾病5,6。家系研究表明銀屑病具有明顯家族聚集現(xiàn)象，并且銀屑病表型的嚴(yán)重性及其病情的發(fā)展程度優(yōu)先受父系的影響，從父親遺傳來的發(fā)病年齡早一些且病情要相對(duì)嚴(yán)重。雙生子調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，同卵雙生中銀屑病的同時(shí)發(fā)病率為3573，異卵雙生中銀屑病的同時(shí)發(fā)病率為12307,8，此外，同卵雙胞胎銀屑病患者在發(fā)病年齡、分布類型，嚴(yán)重程度和病程等方面極其相似，而這種相似性在異卵雙胞胎患者中得不到相應(yīng)體現(xiàn)。銀屑病的遺傳度約為60909，這在所有多因素遺傳疾病中為數(shù)不多10，例如，克羅恩氏病的遺傳度為5011，高血壓的遺傳度為305012和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的遺傳度為406013。國(guó)內(nèi)1043例尋常型銀屑病患者及其家族成員的遺傳流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)一、二級(jí)親屬的發(fā)病率明顯高于一般人群，一、二級(jí)親屬的遺傳度分別為6704和465914，且隨親緣系數(shù)的增加呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。隨著遺傳學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展和研究方法的更新，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在銀屑病遺傳學(xué)領(lǐng)域研究方面作出了大量的工作，發(fā)現(xiàn)了一批有價(jià)值的疾病易感基因/區(qū)域?！岸ㄎ豢寺　焙汀岸ㄎ缓蜻x克隆”的方法是研究孟德爾遺傳模式疾病遺傳學(xué)基礎(chǔ)、發(fā)現(xiàn)疾病致病基因的主要方法。在上個(gè)世紀(jì)末，科學(xué)家們嘗試著把遺傳連鎖分析研究的方法應(yīng)用到銀屑病的易感基因研究中。目前，通過連鎖分析方法運(yùn)用定位克隆和全基因組掃描的方法共計(jì)在全基因組范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)了10個(gè)銀屑病易感位點(diǎn)1Q2115,16、1P17、3Q2118,19、4Q20、4Q31Q3421、6P213317,18,2126、16Q23,26、17Q2522,23,2628、18P112329和19P1325，這10個(gè)銀屑病易感位點(diǎn)被OMIM（ONLINEMENDELIANINHERITANCEINMAN,在線人類孟德爾遺傳）收錄，分別命名為PSORS4、PSORS7、PSORS5、PSORS3、PSORS9、PSORS1、PSORS8、PSORS2、PSORS10和PSORS6，其中的PSORS1、PSORS2、PSORS4和PSORS5位點(diǎn)與銀屑病的連鎖在多個(gè)人群中得到了重復(fù)。12安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文雖然連鎖分析在銀屑病遺傳易感位點(diǎn)研究中取得了較為豐碩的成果，但是對(duì)于確定諸如銀屑病這種復(fù)雜疾病的真正易感基因卻存在一定的局限性。首先，連鎖分析所利用的微衛(wèi)星標(biāo)記STR信息量有限，所定位區(qū)域往往較大，很難從中尋找出真正的易感基因；其次，目前連鎖分析研究發(fā)現(xiàn)復(fù)雜疾病易感位點(diǎn)只用少部分能夠在其他種族和人群中得到重復(fù)驗(yàn)證；最后，畢竟復(fù)雜疾病發(fā)生明顯家族聚集的比例較小，這些連鎖的位點(diǎn)是否能夠代表大部分散發(fā)的病例還不得而知3032。1996年，RISCH等33研究顯示在常見復(fù)雜疾病的遺傳學(xué)研究中關(guān)聯(lián)分析較連鎖分析研究有更高的效力，對(duì)于發(fā)現(xiàn)疾病的微效基因具有更高的效力，更適宜于研究復(fù)雜疾病背后的致病基因或位點(diǎn)。從此，關(guān)聯(lián)研究在常見的多基因遺傳模式疾病中迅速開展起來，該研究手段已成為研究復(fù)雜疾病的主導(dǎo)方向。在銀屑病易感基因研究中關(guān)聯(lián)分析研究也得到迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。關(guān)聯(lián)分析的基本原理是在一定人群中選擇病例組和對(duì)照組，某個(gè)等位基因或基因型在病例出現(xiàn)的頻率明顯高于或低于健康對(duì)照，說明它與疾病有關(guān)聯(lián)性。通過觀察標(biāo)記位點(diǎn)與致病基因位點(diǎn)間存在連鎖不平衡現(xiàn)象，得到某一遺傳標(biāo)記和引起疾病基因關(guān)聯(lián)的相對(duì)危險(xiǎn)度。例如，在糖尿病患者中一個(gè)等位基因A的頻率是030，而在健康對(duì)照中的頻率是020。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)差異有顯著性，可以說等位基因A與疾病存在關(guān)聯(lián)性。在連鎖分析研究的基礎(chǔ)上，研究者們對(duì)易感區(qū)域進(jìn)行候選基因關(guān)聯(lián)分析研究確定了一批銀屑病的易感基因，如SEEK134、CDSN35、RUNX136、VEGF37等。隨著研究技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)人類基因組的認(rèn)識(shí)不斷加深。2003年人類基因組計(jì)劃（HUMANGENOMEPROJECT,HGP）揭示了人類基因組是由30億個(gè)堿基對(duì)和大約39,000多個(gè)編碼蛋白的基因組成。隨后，國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃（HUMANHAPLOTYPEMAP,HAPMAP）確定了人類基因組中的300多萬個(gè)單核苷酸多態(tài)性SINGLENUCLEOTIDEPOLYMORPHISM,SNP，即平均約每1000個(gè)堿基會(huì)有一個(gè)SNP38。HGP和HAPMAP計(jì)劃帶來了深遠(yuǎn)影響，為世界各國(guó)的研究者提供了人類基因組的相關(guān)序列信息，研究人員可以利用這些開放的信息對(duì)多基因遺傳疾病以及個(gè)體對(duì)藥物和環(huán)13安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文境因子反應(yīng)的差異進(jìn)行遺傳關(guān)聯(lián)分析研究，把遺傳多態(tài)位點(diǎn)和特定疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)聯(lián)系起來，尋找并發(fā)現(xiàn)與疾病易感性相關(guān)的基因，從而為預(yù)防、診斷和治療疾病提供新的方法和思路。在HGP和HAPMAP計(jì)劃推動(dòng)下，關(guān)聯(lián)分析研究獲得了長(zhǎng)足的發(fā)展，被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜疾病的研究中。隨著分型技術(shù)的迅速發(fā)展和分型成本的不斷降低、覆蓋整個(gè)人類基因組的高通量商業(yè)化SNP檢測(cè)芯片的出現(xiàn)和不斷更新，全基因組關(guān)聯(lián)研究（GENOMEWIDEASSOCIATIONSTUDY，GWAS）得到發(fā)展。該研究是在人類全基因組的范圍內(nèi)根據(jù)HAPMAP計(jì)劃選擇標(biāo)簽SNPS進(jìn)行基因分型，比較病例和對(duì)照間等位基因頻率的差異，并分析等位基因變化對(duì)疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的作用大小。簡(jiǎn)而言之，即從整個(gè)人類基因組的遺傳變異中，篩選出與疾病性狀關(guān)聯(lián)的變異，再根據(jù)其在基因組中的位置和連鎖不平衡推測(cè)出可能的疾病易感基因，并對(duì)這些基因和疾病的關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證及相關(guān)的功能研究39。2005年科學(xué)雜志報(bào)道了全球首個(gè)復(fù)雜疾病的GWAS研究，KLEIN等40利用AFFYMETRIX100K的基因芯片對(duì)年齡相關(guān)性視網(wǎng)膜黃斑變性（AGERELATEDMACULARDEGENERATION,AMD）進(jìn)行了GWAS研究，該研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)位于CFH基因的第9號(hào)外顯子上的錯(cuò)義變異與AMD顯著相關(guān)。此后，一系列復(fù)雜疾病的GWAS研究相繼發(fā)表在科學(xué)、自然、新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志和自然遺傳等世界頂級(jí)學(xué)術(shù)雜志上。在復(fù)雜疾病的基因組學(xué)研究中，GWAS顯示出了卓越優(yōu)勢(shì)，人類基因組學(xué)和疾病的相關(guān)性研究進(jìn)入了一個(gè)新的階段。美國(guó)國(guó)立人類基因組研究院（NATIONALHUMANGENOMERESEARCHINSTITUTE,NHGRI）和美國(guó)國(guó)立癌癥研究院（NATIONALCANCERINSTITUTE,NCI）對(duì)世界各國(guó)研究者發(fā)表的復(fù)雜疾病或性狀的GWAS研究結(jié)果進(jìn)行分類匯總（HTTP/WWWGENOMEGOV/26525384），并進(jìn)行定期更新。如同其他復(fù)雜疾病一樣，GWAS在銀屑病的基因組學(xué)研究中的應(yīng)用也顯示出其顯著優(yōu)勢(shì)。自2007年首次銀屑病GWAS研究發(fā)表在美國(guó)人類遺傳學(xué)雜志以來，目前已有15篇關(guān)于銀屑病GWAS研究或GWAS相關(guān)研究在自然遺傳等著名雜志上發(fā)表，發(fā)現(xiàn)了一大批銀屑病易感基因（表1），如位于11Q224上的ETS1基因14染色體位置基因參考引文1P313IL23R46NAIRETAL1P36RUNX341TSOIETAL1P3611IL28RA43STRANGEETAL1P362SLC45A1,TNFRSF941TSOIETAL1Q213LCE3D,LCE3A4243ZHANGETALSTRANGEETAL2P15B3GNT241TSOIETAL2P161REL4443ELLINGHAUSETALSTRANGEETAL2Q242IFIH143STRANGEETAL3P24無43STRANGEETAL5Q15ERAP14345STRANGEETALSUNETAL5Q311IL1346NAIRETAL5Q331TNIP14546SUNETALNAIRETAL5Q333IL12B424846ZHANGETALCARGILLETALNAIRETALHFFMEIERET495043ALELLINGHAUSETALSTRANGEETAL5Q333PTTG145SUNETAL6P2133HLAC51424652CAPONETALZHANGETALNAIRETALLIUETAL495043HFFMEIERETALELLINGHAUSETALSTRANGEETAL安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文41、1Q213上的LCE3D和LCE3A基因42,43、2P161上的REL基因43,44、5Q15上的ERAP1基因43,45、13Q1211上的GJB2基因45、9Q3413上的TSC1基因46和10Q223上的ZMIZ1基因47等。此外還證實(shí)了既往通過定位克隆和候選基因關(guān)聯(lián)分析研究發(fā)現(xiàn)的一些銀屑病易感基因，如HLA、IL12B、IL23R和TRAF3IP2等。利用目前已發(fā)現(xiàn)的銀屑病易感基因得出參與發(fā)病機(jī)制可能包括先天性免疫、獲得性免疫和皮膚屏障功能等三個(gè)方面。表1GWAS研究及其相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)的銀屑病易感基因/位點(diǎn)TAB1PSORIASISSUSCEPTIBILITYGENES/LOCIIDENTIFIEDBYGWASSANDRELATIVESTUDIES155354KNIGHTETALFENGETAL6P2133MICB53KNIGHTETAL6P2133HLAA53KNIGHTETAL6P2133HCG953KNIGHTETAL6P2133HLAB5754FENGETAL6P2133HLAB4054FENGETAL6P253EXOC2,IRF441TSOIETAL6P253TAGAP41TSOIETAL6Q21TRAF3IP2495043HFFMEIERETALELLINGHAUSETALSTRANGEETAL6Q233TNFAIP346NAIRETAL7P141ELMO141TSOIETAL8P232CSMD145SUNETAL9P12DDX5841TSOIETAL9Q31KLF441TSOIETAL9Q3413TSC146NAIRETAL10Q223ZMIZ147ELLINGHAUSETAL11Q13PRDX547ELLINGHAUSETAL11Q223ZC3H12C41TSOIETAL11Q224ETS141TSOIETAL12Q132IL23A,STAT246NAIRETAL13Q1211GJB245SUNETAL13Q133COG652LIUETAL14Q132NFKBIA,PSMA65543STUARTETALSTRANGEETAL16P112FBXL1955STUARTETAL16P133PRM3,SOCS141TSOIETAL17Q112NOS255STUARTETAL安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文1617Q212PTRF,STAT3,STAT5A/B41TSOIETAL17Q25CARD1441TSOIETAL18Q121POL1,STARD6,MBD241TSOIETAL18Q221SERPINB845SUNETAL19P13TYK243STRANGEETAL19P132ILF3,CARM141TSOIETAL19Q1341ZNF816A45SUNETAL20Q13ZNF3135155CAPONETALSTUARTETAL安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文雖然GWAS研究取得了豐碩成果，但GWAS也存在難以回避的缺陷。例如，GWAS發(fā)現(xiàn)的復(fù)雜疾病相關(guān)遺傳變異大多位于基因的非功能區(qū)內(nèi)，僅能夠解釋月15的疾病易感性，因此，單獨(dú)用SNP為遺傳標(biāo)記的GWAS并不能發(fā)現(xiàn)疾病的全部遺傳變異，尤其是很難直接發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的外顯子區(qū)編碼遺傳變異（直接導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的改變，影響其蛋白功能）。近幾年，DNA測(cè)序技術(shù)和方法不多得到創(chuàng)新和改良，在保證基因組測(cè)序精確度的前提下，操作程序逐步優(yōu)化，測(cè)定通量急速增加，甚至達(dá)到傳統(tǒng)SANGER測(cè)序法的數(shù)百倍至數(shù)千倍，測(cè)序成本也在不斷下降。在此背景下，“新一代測(cè)序技術(shù)”（NEXTGENERATIONSEQUENCING，NGS）即全基因組外顯子測(cè)序應(yīng)運(yùn)而生，成功實(shí)施彌補(bǔ)了GWAS的上述缺陷。今后通過全基因組外顯子測(cè)序和靶向測(cè)序技術(shù)，使得我們有望找到銀屑病相關(guān)罕見變異和少見變異，與GWAS發(fā)現(xiàn)銀屑病常見變異形成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，全面揭示銀屑病的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而為藥物研發(fā)、疾病預(yù)防、診斷和治療提供新的契機(jī)，為將來實(shí)現(xiàn)優(yōu)化的個(gè)體化診斷、治療奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。12本課題的研究設(shè)計(jì)方案本研究擬在中國(guó)漢族人群中進(jìn)行一項(xiàng)大樣本量全基因組外顯子測(cè)序研究、靶向測(cè)序研究和基因分型研究。第一階段研究（即781例患者和676例對(duì)照的全基因組外顯子測(cè)序）采用NIMBLEGEN21M探針測(cè)序捕獲芯片進(jìn)行每個(gè)樣本的外顯子DNA捕獲和富集（可捕獲18,654個(gè)CCDS基因9886的編碼序列），并通過ILLUMINA17安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文HISEQ2000平臺(tái)對(duì)捕獲區(qū)域進(jìn)行測(cè)序（平均覆蓋度約為34X），經(jīng)過數(shù)據(jù)處理、質(zhì)量控制和統(tǒng)計(jì)分析后篩選出一批可能的銀屑病易感SNV。第二階段研究（即9,946例患者和9,906例對(duì)照的靶向測(cè)序）采用定制SEQCAPEZLIBRARY芯片（NIMBLEGEN）對(duì)1,326個(gè)基因（包括第一階段單點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)的最為顯著133個(gè)非MHC區(qū)域的SNVS和GENEBASED關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)的最顯著的742個(gè)基因以及與免疫疾病相關(guān)的622個(gè)基因）進(jìn)行靶向捕獲和富集，同樣利用ILLUMINAHISEQ2000平臺(tái)對(duì)捕獲區(qū)域進(jìn)行測(cè)序（平均覆蓋度約為64X），經(jīng)過數(shù)據(jù)處理、質(zhì)量控制和統(tǒng)計(jì)分析后獲得一批與銀屑病易感易感性相關(guān)的SNVS和提示SNVS。第三階段（即基因分型）在另外一個(gè)獨(dú)立的中國(guó)漢族人群（包括4,480例患者和6,521例對(duì)照）中采用SEQUENOMMASSARRAY基因分型系統(tǒng)進(jìn)行多重PCR以及基因分型，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理、質(zhì)量控制和統(tǒng)計(jì)分析，合并三個(gè)階段基因分型數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，再次篩選出與銀屑病相關(guān)聯(lián)的SNVS，查閱相關(guān)文獻(xiàn)以及專業(yè)網(wǎng)站分析研究結(jié)果。本研究設(shè)計(jì)方案概況見圖1。圖1研究設(shè)計(jì)方案概況FIG1THEOVERVIEWOFSTUDYDESIGN18安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文2實(shí)驗(yàn)材料與方法21研究對(duì)象本研究中的所有銀屑病和對(duì)照樣本均由國(guó)內(nèi)多家醫(yī)院和研究中心收集而來，全基因組外顯子測(cè)序研究階段的樣本包括781例患者和676例對(duì)照樣本（表2），主要來自于前期GWAS樣本；靶向測(cè)序研究階段包括9,946例患者和9,906例對(duì)照樣本（表2）；基因分型階段包括4,480例患者和6,521例對(duì)照樣本（表2）。所有患者和對(duì)照使用相同的樣本收集標(biāo)準(zhǔn)，病例和對(duì)照的臨床和人口信息通過相同的結(jié)構(gòu)式問卷收集。本研究中所使用的對(duì)照樣本均不患銀屑病、自身免疫性疾病和系統(tǒng)性疾病，并且沒有任何銀屑病家族史（包括一、二、三級(jí)親屬）。病例組和對(duì)照組在年齡、性別和地域上相匹配。所有參與者提供書面的知情同意書。該研究經(jīng)過了各家醫(yī)院和研究機(jī)構(gòu)的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并按照赫爾辛基宣言的條款執(zhí)行。表2本研究樣本總結(jié)TAB2THESUMMARYOFSAMPLESANALYZEDINTHISSTUDY全基因組外顯子測(cè)序靶向測(cè)序基因分型病例對(duì)照病例對(duì)照病例對(duì)照樣本量平均年齡（SD）78130921247676341212929,946351514499,906358116014,480351614806,52129201517平均發(fā)病年齡（SD）22459392702134727261344男女比例458/323407/2695,864/4,0825,361/4,6422,220/2,0603,378/3,14322實(shí)驗(yàn)試劑221DNA提取試劑1）基因組DNA提取試劑QIAGENDNA抽提試劑盒（250），包括FG1（細(xì)胞裂解19安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文緩沖液），F(xiàn)G2（蛋白變性緩沖液），F(xiàn)G3（DNA溶解緩沖液），QIAGEN蛋白酶（QIAGENPROTEASE）。2）異丙醇（ISOPROPANOL），（蚌埠化學(xué)試劑廠）。3）75乙醇（ETHANOL），（蚌埠新科電化試劑廠）。222電泳試劑1）瓊脂糖（AGAROSE），（上海生工生物工程公司）。2）LAMBDADNA/ECORIHINDIII，（大連寶生物工程公司）。3）超純水。4）TRIS堿，（上海生工生物工程公司）。5）硼酸，（上海生工生物工程公司）。6）EDTA，（上海生工生物工程公司）。7）溴酚藍(lán)，（上海生工生物工程公司）。8）蔗糖，（上海生工生物工程公司）。9）TRIS硼酸電泳緩沖液（TBE）濃貯存液（每升），5TRIS堿54G，硼酸275G，濃度為05MOL/L的EDTA20ML（PH80）；使用液，05濃度為0045MOL/L的TRIS硼酸，濃度為0001MOL/L的EDTA。10）6加樣緩沖液025溴酚藍(lán)，40（W/V）蔗糖水溶液。11）溴化乙錠，10MG/ML貯存液，（上海生工生物工程公司）。223標(biāo)準(zhǔn)化DNA試劑FG3（DNA溶解緩沖液）。224全基因組外顯子測(cè)序和靶向測(cè)序試劑1）TAQDNAPOLYMERASE（TAKARA公司）；2）AGILENTDNA1000KIT（AGILENT公司）；3）AGILENTHIGHSENSITIVITYDNAKIT（AGILENT公司）；4）AMPUREKIT（SPRIXPBEADS）（AGENCOURT公司）；5）ILLUMINAPAIREDENDGENOMICDNA（ILLUMINA公司）；20安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文6）SAMPLEPREPKIT（ILLUMINA公司）；7）DNTPS（TAKARA公司）；8）HERCULASEIIFUSIONDNAPOLYMERASE（STRATAGENE公司）；9）SURESELECTHUMANALLEXONKIT（AGILENT公司）；10）SURESELEETHUMANALLEXONPLUSKIT（AGILENT公司）；11）DYNABEADSMYONESTREPTAVIDINT1（INVITROGEN公司）；12）GENOMIEDNAEXTRACTIONKIT（TAKARA公司）。23研究?jī)x器231DNA提取器材1）MICROTEC1542R低溫高速離心機(jī)（日本）；2）MSIMINISHAKER振蕩器（馬來西亞）；3）BS60型電熱恒溫水浴箱，（北京市醫(yī)療設(shè)備廠）；4）192型超低溫冰箱（85）（日本三洋公司）；5）美菱BCD238型冰箱（中國(guó)美菱集團(tuán)公司產(chǎn)品）；6）HAIER20冰柜（中國(guó)海爾集團(tuán)公司產(chǎn)品）；7）0125L、0550L、50200L、2001000L移液器（EPPENDORF，GERMAN）；0510L、20200L、1001000LTIP（QUALITYSCIENTIFICPLASTIC，USA）；8）EDTAK2（或EDTANA4）抗凝真空管；9）15ML離心管（AXYGEN產(chǎn)品）；10）搖床（TY80R，國(guó)產(chǎn)）；11）水浴鍋；12）50ML試管架；13）一次性塑膠手套。232電泳儀器1）MICROTEC1542R低溫高速離心機(jī)（日本）。2）TANON3500全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。21安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3）MSIMINISHAKER振蕩器（馬來西亞）。4）FD201穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京通用分析儀器廠）。5）DYY型電泳槽（北京市六一儀器廠）。6）TN100B型托盤式扭力天平（上海第二天平儀器廠）。7）0510UL、20200UL、1001000ULTIP（QUALITYSCIENTIFICPLASTIC，USA）。8）0125UL、0550UL、50200UL、2001000UL移液器（EPPENDORF，GERMAN）。9）HAIER20冰柜（中國(guó)海爾集團(tuán)公司產(chǎn)品）。10）15ML離心管（AXYGEN產(chǎn)品）。11）05ML離心管（AXYGEN產(chǎn)品）。12）超純水系統(tǒng)（PURELAB，ENGLAND）。233測(cè)OD值儀器1）全波長(zhǎng)紫外/可見光掃描分光光度計(jì)NANODR