畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）論文（設(shè)計(jì)）題目急性豬瘟感染過程中IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平的研究姓名學(xué)號(hào)院系生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院專業(yè)生物技術(shù)年級(jí)2011級(jí)指導(dǎo)教師2015年5月15日目錄摘要1ABSTRACT2第1章前言311研究背景312研究目的413研究意義4第2章材料及方法621材料6211病毒6212引物6213實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組6214主要試劑6215主要溶液配制6216主要儀器722方法7221人工感染CSFV7222豬PBMCS分離7223PBMCS中總RNA抽提8224反轉(zhuǎn)錄合成CDNA8225反應(yīng)體系9226QPCR結(jié)果分析9第3章結(jié)果與結(jié)論1131QRTPCR檢測(cè)IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果11第4章討論1241QRTPCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子方法的優(yōu)勢(shì)1242CSFV感染PBMC對(duì)IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響13參考文獻(xiàn)14致謝16摘要豬瘟CLASSICALSWINEFEVER,CSF是由豬瘟病毒CLASSICALSWINEFEVERVIRUS,CSFV引起的一種豬的高發(fā)傳染病，它具有高發(fā)病率和高接觸性等特點(diǎn)，細(xì)胞白介素2（INTERLEUKIN2,IL2為調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著免疫正調(diào)節(jié)的作用。本實(shí)驗(yàn)意在通過CSFV感染試驗(yàn)豬，根據(jù)TRIZOL法提取豬外周血單核細(xì)胞（PERIPHERALBLOODMONONUCLEARCELL,PBMC）RNA并反轉(zhuǎn)錄為CDNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QUANTITATIVEREALTIMEPCR,QRTPCR）技術(shù)研究CSFV感染機(jī)體后IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果顯示IL2MRNA在CSFV感染后第3D轉(zhuǎn)錄水平正常，第7D轉(zhuǎn)錄水平最低，第14D轉(zhuǎn)錄水平最高，第21D又恢復(fù)正常。表明了第7D機(jī)體免疫損失最為嚴(yán)重，第14DIL2誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒感染應(yīng)答現(xiàn)象最為明顯。關(guān)鍵詞豬瘟病毒；外周血單核細(xì)胞；細(xì)胞白介素2；實(shí)時(shí)熒光定量PCRABSTRACTCLASSICALSWINEFEVERCSFISAHIGHINCIDENCEOFINFECTIOUSDISEASESBYSWINEFEVERVIRUSCSFVCAUSED,ITHASAHIGHINCIDENCEANDHIGHCONTACTRESISTANCEANDOTHERCHARACTERISTICS,CELLINTERLEUKIN2IL2ISANIMPORTANTFACTORINTHEREGULATIONOFIMMUNERESPONSESINIMMUNEREGULATIONPLAYSAROLEINIMMUNEENHANCEMENTTHISEXPERIMENTISINTENDEDBYCSFVINFECTIONINPIGS,ACCORDINGTOTRIZOLEXTRACTIONPORCINEPERIPHERALBLOODMONONUCLEARCELLSPBMCRNAANDREVERSETRANSCRIPTIONTOCDNA,QUANTITATIVEREALTIMEPCRQRTPCRRESEARCHCSFVIL2MRNATRANSCRIPTIONLEVELSCHANGEAFTERINFECTIONTHERESULTSSHOWEDIL2MRNAINTHEFIRSTTHREEDAYSAFTERCSFVINFECTIONTRANSCRIPTLEVELSWERENORMAL,THELOWESTLEVELOFTHEFIRSTSEVENDAYSOFTRANSCRIPTION,TRANSCRIPTIONLEVELSHIGHESTFIRST14DAYS,21DAYSANDRETURNTONORMALITSHOWSTHEFIRSTSEVENDAYSOFTHEMOSTSERIOUSIMMUNEDAMAGE,ONTHE14THDAYIL2INDUCECELLSTOPRODUCEANTIVIRUSRESPONSEPHENOMENONISMOSTOBVIOUSKEYWORDSCLASSICALSWINEFEVERVIRUSPERIPHERALBLOODMONONUCLEARCELLINTERLEUKIN2QUANTITATIVEREALTIMEPCR第1章前言細(xì)胞因子是一類小分子蛋白，具有廣泛生物活性，它是由機(jī)體免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞刺激刺激合成和分泌1。它產(chǎn)生具有多向性、多源性，其生物學(xué)活性主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)刺激造血功能并參與組織修復(fù)、參與免疫細(xì)胞的分化發(fā)育、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等2。細(xì)胞因子具有很強(qiáng)的生物學(xué)活性，細(xì)胞因子在病毒感染后轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的差異近年來備受關(guān)注3,4。細(xì)胞因子在機(jī)體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，白細(xì)胞介素是眾多免疫細(xì)胞因子中的一種，目前至少已發(fā)現(xiàn)了38個(gè)白細(xì)胞介素5，白細(xì)胞介素是由淋巴細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞等細(xì)胞分泌產(chǎn)生,主要作用介導(dǎo)白細(xì)胞間相互作用、調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化、參與免疫應(yīng)答和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，白細(xì)胞介素2（INTERLEUKIN2，IL2）是眾多白細(xì)胞介素中一種，IL2是由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的TH1細(xì)胞的特征性因子,具有促進(jìn)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的增殖、分化以及增強(qiáng)TC細(xì)胞、NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞的殺傷活性的功能，IL2對(duì)干擾素（INTERFERON，IFN、腫瘤壞死因子（TUMORNECROSISFACTOR，TNF等細(xì)胞因子的分泌具有促進(jìn)作用，它可以增強(qiáng)機(jī)體自身體液免疫和細(xì)胞免疫的能力和解除機(jī)體自身免疫抑制6，IL2還可以增加抗原遞呈細(xì)胞表面MHC類分子和MHC類的數(shù)量，促進(jìn)抗體的分泌和增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞作用7。在動(dòng)物感染性疾病防治中，IL2是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)核心物質(zhì)，豬IL2具有多種生物學(xué)活性，IL2具有較強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)功能，在抗毒素、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等方面都具有重要作用8。近幾年來國(guó)內(nèi)外在免疫調(diào)節(jié)方面的研究成果頗多，許多研究表明IL2能夠促進(jìn)抗體的分泌和降低病原體的入侵率9。通過對(duì)豬瘟病毒CLASSICALSWINEFEVERVIRUS,CSFV感染后IL2的研究，可為CSFV的致病機(jī)理以及研究宿主與病毒的關(guān)系提供理論依據(jù)，為研究CSFV感染后其它細(xì)胞因子的變化奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。11研究背景豬瘟（CLASSICALSWINEFEVER,CSF）是豬的一種重要的傳染病，在世界范圍內(nèi)廣泛流行。在我國(guó)，CSF被列為I類動(dòng)物疫病,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE將其列為A類傳染病之一，CSFV引起的豬高度接觸性致死性傳染病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大威脅和經(jīng)濟(jì)損失10。發(fā)展至今已流行70多年。我國(guó)在50年代已研制出CSFV兔化弱毒疫苗，在防控CSFV方面，已取得顯著成效，然而60年過去了，我國(guó)還未能真正消滅CSF。從細(xì)胞因子層次研究CSF感染的致病機(jī)理，對(duì)CSF的消滅和預(yù)防有著重要的意義。近年來，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者從細(xì)胞因子層次出發(fā)，研究CSFV感染與細(xì)胞因子的關(guān)系，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CSF可引起眾多細(xì)胞因子變化，表明了細(xì)胞因子的變化將直接影響其抗原遞呈與免疫功能的發(fā)揮。但是，關(guān)于CSFV感染PBMC后細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的研究卻較少，病毒感染的作用機(jī)理尚未弄清。CSFV在我國(guó)已流行許久，原有的免疫手段尚不能完全消滅CSF，近年來雖有眾多學(xué)者研究CSFV，但從細(xì)胞因子層次探究CSFV感染機(jī)制較少，研究CSFV感染機(jī)體后IL2變化情況的文章更是少之更少11。豬的細(xì)胞因子種類較多，主要分為白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子，其中IL2在預(yù)防和治療疾病方面?zhèn)涫荜P(guān)注，近年來許多研究已經(jīng)表明IL2在抗病毒和抗感染及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重大作用，展現(xiàn)出IL2廣闊的研究前景12。12研究目的急性CSFV感染常以發(fā)病急和外周血白細(xì)胞數(shù)目減少為主要特征，細(xì)胞因子在CSFV感染過程中起著至關(guān)重要的作用13。近年來，研究人員對(duì)急性CSFV感染后細(xì)胞因子的變化情況研究頗多，但對(duì)IL2在病毒感染后的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮的作用研究較少。本文主要以IL2為研究對(duì)象，通過對(duì)IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平的研究，從IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化解釋CSFV感染后IL2含量的變化，尋找CSFV感染機(jī)體與機(jī)體中IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)系，證明CSFV感染機(jī)體后IL2對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答起增強(qiáng)作用。13研究意義白細(xì)胞介素與CSFV感染關(guān)系密切，在抗病毒免疫中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。白細(xì)胞介素是由多種細(xì)胞產(chǎn)生并作用于多種細(xì)胞的一類細(xì)胞因子，IL2是眾多白細(xì)胞介素中一種，IL2又稱T細(xì)胞生長(zhǎng)因子（TCGF,其主要由T細(xì)胞產(chǎn)生，具有促進(jìn)B細(xì)胞增殖和激活巨噬細(xì)胞的功能14。因此，通過對(duì)CSFV感染后IL2的研究，可為CSFV的致病機(jī)理以及研究宿主與病毒的關(guān)系提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)意在通過CSFV石門毒株體外侵染試驗(yàn)豬，根據(jù)TRIZOL法提取豬外周血單核細(xì)胞PERIPHERALBLOODMONONUCLEARCELL,PBMCRNA，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QUANTITATIVEREALTIMEPCR，QRTPCR）技術(shù)研究CSFV持續(xù)感染后IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，證明CSFV石門毒株感染PMBC后對(duì)豬白細(xì)胞介素含量產(chǎn)生影響，為研究CSFV感染后其它細(xì)胞因子的變化奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，為論述CSFV感染后免疫系統(tǒng)變化機(jī)制提供理論依據(jù)。第2章材料及方法21材料211病毒CSFV石門毒株由新鄉(xiāng)學(xué)院生物技術(shù)研究中心保存。212引物根據(jù)GENBANK上公布的CSFV石門毒株的全基因序列，并參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，利用PRIMER50引物分析軟件進(jìn)行同批次引物設(shè)計(jì),引物由大連TAKARA公司合成，以ACTIN作為參照，引物信息見表1。表1引物序列信息213實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組30日齡、CSFV抗體陰性二元雜交豬，購(gòu)自河南省種豬育種中心，體重約15KG，身體健康，無其它疾病，狀況良好，并進(jìn)行一周的觀察。實(shí)驗(yàn)組10頭，對(duì)照組5頭，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組實(shí)驗(yàn)條件控制在同等狀態(tài)下。214主要試劑淋巴細(xì)胞分離液（FICOLL1077G/ML），天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PRIMESCRIPTRTPCRKIT、PRIMESCRIPTRTREAGENTKITWITHGDNAERASERPERFECTREALTIME、反轉(zhuǎn)錄酶和TAQ酶，大連TAKARA公司產(chǎn)品；SYBRGREEN試劑盒，美國(guó)APPLIEDBIOSYSTEMS公司產(chǎn)品；TRIZOL，美國(guó)INVITROGEN公司產(chǎn)品。基因名稱序列（53）基因序列號(hào)產(chǎn)物長(zhǎng)度（BP）FGGACTTCGAGCAGGAGATGGACTINRAGGAAGGAGGGCTGGAAGAGDQ4525691121IL2FCATTGCACTAACCCTTGCACTCRGGCTCCAGTTGTTTCTTTGTGTTJN85182181215主要溶液配制10檸檬酸鈉（抗凝劑）稱取10G檸檬酸鈉溶于100ML蒸餾水中，過濾除菌，4保存?zhèn)溆谩?0紅細(xì)胞裂解液稱取NH4CL8277G，NAHCO3084G，EDTA0037G，溶于100ML蒸餾水中，攪拌溶解，過濾除菌，4保存?zhèn)溆谩Ａ姿猁}緩沖液稱取NACL8G，KCL02G，KH2PO402G，NA2HPO412H2O363G，加蒸餾水定溶至1000ML，高壓滅菌，4保存?zhèn)溆?。DEPC水無菌蒸餾水中加入01（V/V）DEPC，磁力攪拌器室溫?cái)嚢?H，121高壓滅菌30MIN，冷卻備用。216主要儀器22方法221人工感染CSFV30日齡二元雜交豬隨機(jī)分成2組，試驗(yàn)組10頭，對(duì)照組5頭，隔離飼養(yǎng)，飼養(yǎng)57D，觀察豬只有無異常情況，試驗(yàn)組和對(duì)照組分別頸部肌肉注射105TCID50的CSFV和05MLPBS，攻毒后每天觀察臨床變化。攻毒后0D、3D、7D、10D、14D和21D，分別采集抗凝血5ML，用于分離PBMCS。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀7500型美國(guó)APPLIEDBIOSYSTEMS公司臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)ST40R型美國(guó)THERMO公司核酸蛋白分析儀美國(guó)GE公司倒置顯微鏡PRIMOVERT型德國(guó)SEISS公司水浴鍋上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司電子天平METTLERTOLEDO國(guó)際股份有限公司微量移液器德國(guó)EPPENDORF公司超凈臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司微型振蕩器北京吳諾斯生物技術(shù)有限公司222豬PBMCS分離（1）頸靜脈采集正常豬抗凝血5ML（10檸檬酸鈉，全血與抗凝劑比例為101），抗凝血與等量PBS輕輕混勻；（2）取4ML淋巴細(xì)胞分離液于15ML玻璃離心管中，將上述混勻血10ML沿管壁慢慢加入離心管中（注動(dòng)作要輕，不能混勻），水平離心，2000R/MIN，室溫離心20MIN；（3）用毛細(xì)管吸取血漿層與分離液之間的白色細(xì)胞薄層，移入新的15ML玻璃離心管中，加入25倍體積PBS，輕輕懸浮細(xì)胞，1000R/MIN，室溫離心10MIN，棄上清，加入10MLPBS，輕輕懸浮細(xì)胞，重復(fù)離心一次，棄上清；（4）觀察白細(xì)胞中紅細(xì)胞量，適當(dāng)加入12ML紅細(xì)胞裂解液，冰上裂解紅細(xì)胞5MIN，加入10MLPBS，1000R/MIN，室溫離心10MIN，棄上清，加入05MLPBS，懸浮細(xì)胞，即為PBMC細(xì)胞懸液。223PBMCS中總RNA抽提（1）取1MLTRIZOL于15MLEP管中（無RNASE），加入250LPBMCS細(xì)胞懸液混勻，室溫放置10MIN；（2）加入200L氯仿混勻，室溫放置10MIN，12000R/MIN，4離心15MIN；（3）轉(zhuǎn)上層水相于新15MLEP管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置10MIN，12000R/MIN，4離心10MIN，棄上清；（4）加入1ML75酒精，懸浮沉淀，7500R/MIN，4離心5MIN，棄上清，重復(fù)離心一次，棄上清；（5）放置510MIN，待酒精蒸發(fā)完畢，離心管底部透明狀膠體樣物質(zhì)即為RNA，加入20LDEPC水懸浮RNA，核酸蛋白分析儀測(cè)定RNA濃度，立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。224反轉(zhuǎn)錄合成CDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒PRIMESCRIPTRTREAGENTKITWITHGDNAERASERPERFECTREALTIME合成CDNA，具體步驟如下RNA1L5GDNAERASERBUFFER2LGDNAERASER1LRNASEFREEDH2O補(bǔ)加至10L總體積10L以上體系混勻后，42水浴2MIN，取出立即放置冰上，待加入以下成分以上體系混勻后，37孵育15MIN，85水浴5SEC，4冷卻5MIN，即為合成CDNA，20保持備用。225反應(yīng)體系如下本實(shí)驗(yàn)室已建立QPCR檢測(cè)豬IL2的方法，反應(yīng)體系和程序如下SYBRGREENMIX10L上游引物04L下游引物04LCDNA2L雙蒸水72L總體積20L以上體系混勻后，反應(yīng)程序?yàn)?5預(yù)變性30SEC；進(jìn)行40個(gè)循環(huán)95變性5SEC，60反應(yīng)34SEC；溶解曲線9530SEC，601MIN，9515SEC。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋的6個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)，根據(jù)R2值和溶解曲線判斷QPCR的穩(wěn)定性和特異性。上述混合液10L5PRIMESCRIPTBUFFER24LPRIMESCRIPTRTENZYMEMIXI1LRTPRIMERMIX1LRNASEFREEDH2O4L總體積20L226QPCR結(jié)果分析參考PFAFFL的方法15，以ACTIN為內(nèi)參，將QPCR結(jié)果的CT值帶入下列公式，用PFAFFL法計(jì)算目的基因MRNA相對(duì)于ACTIN的表達(dá)量，公式如下RATIO目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)量；ETARGET目的基因的表達(dá)效率，E101/斜率；EREF內(nèi)參基因的表達(dá)效率；CPTARGET對(duì)照組（CONTROL）和樣品組（SAMPLE）目的基因CT值之差；CPREF對(duì)照組（CONTROL）和樣品組（SAMPLE）內(nèi)參基因CT值之差。ETARGETCPTARGET（CONTROLSAMPLE）RATIOEREFCPREF（CONTROLSAMPLE）第3章結(jié)果與結(jié)論31QRTPCR檢測(cè)IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的細(xì)胞因子為IL2，利用QRTPCR技術(shù)分別對(duì)CSFV感染PBMC后第0D、第3D、第7D、第10D、第14D、第21D進(jìn)行IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)，觀察CSFV感染對(duì)IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果見圖1圖1IL2轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果結(jié)果顯示CSFV感染后07D，IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，而在第1014D，IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，第21DIL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平又恢復(fù)到正常水平。綜上所述，提示CSFV石門毒株感染后第7DIL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平最低，表明機(jī)體免疫能力和抗病毒能力最低，而感染后第14DIL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平最高，表明機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答現(xiàn)象最為明顯。第4章討論本研究運(yùn)用QRTPCR技術(shù)分析了CSFV感染豬PBMC后IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平的情況，從定量的角度分析IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平載量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為臨床診斷提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。臨床與結(jié)果表現(xiàn)出一致性，伴隨著血液中CSFV核酸載量的增加，感染豬臨床表觀癥狀越發(fā)嚴(yán)重。41QRTPCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子方法的優(yōu)勢(shì)QRTPCR技術(shù)是由美國(guó)APPLIEDBIOSYSTEMS公司推出的一種新型定量PCR技術(shù)，目前，在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為廣泛。QRTPCR實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的轉(zhuǎn)變,提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物檢測(cè)定量產(chǎn)生的偏差,提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、線性關(guān)系好等優(yōu)點(diǎn)，常用于基因定量檢測(cè)、定量疾病相關(guān)基因的表達(dá)，現(xiàn)在已廣泛用于人類和禽類疾病的定量分析、快速檢測(cè)、基因分型、早期診斷等方面16。QRTPCR可以采用相對(duì)定量和絕對(duì)定量2種方式實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，但都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，需根據(jù)具體的試驗(yàn)選擇合適的定量方式，從而得到更準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果。提高QRTPCR技術(shù)的特異性和靈敏度需從多方面著手，主要指特異性探針及引物的設(shè)計(jì)，選擇合適的MG2濃度、引物和探針濃度、循環(huán)數(shù)等，該技術(shù)己被廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞MRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的MRNA表達(dá)差異；驗(yàn)證基因芯片；SIRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。它涉及到DNA或RNA樣品制備，反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)等一系列重要的分子生物學(xué)過程17。目前QRTPCR技術(shù)主要有SYBRGREEN和TAQMAN探針兩種方法。SYBRGREEN是一種熒光染料，它能夠與雙鏈DNA非特異結(jié)合，這種熒光染料適用于所有引物的擴(kuò)增，成本較低，方法簡(jiǎn)便，但熒光染料也能夠與其它雙鏈DNA結(jié)合，因此需要對(duì)其進(jìn)行溶解曲線分析，達(dá)到對(duì)其它非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物或者引物二聚體加以辨別去除的目的。而TAQMAN探針法則是探針與靶序列配對(duì)，探針上有兩個(gè)基因（3淬滅基因和5報(bào)告基因）。完整的探針沒有熒光產(chǎn)生，而報(bào)告基因與淬滅基因分離時(shí)，發(fā)射熒光。此法對(duì)引物及探針的設(shè)計(jì)要求更高，但同時(shí)檢測(cè)的特異性更高，結(jié)果更為可靠18。本實(shí)驗(yàn)采用的是SYBRGREEN法，此法的優(yōu)點(diǎn)是使用方便，成本低，通用性好，設(shè)計(jì)引物時(shí)僅需設(shè)計(jì)兩個(gè)引物，而且熒光染料對(duì)DNA模板沒有選擇性。但缺點(diǎn)是SYBRGREEN能與所有雙鏈DNA結(jié)合，所以反應(yīng)結(jié)束時(shí)，必須對(duì)產(chǎn)物做溶解曲線分析。42CSFV感染PBMC對(duì)IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響CSFV石門毒株感染豬PBMC后機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，PBMC分泌的白介素類發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，白介素類細(xì)胞因子若在異常情況下可能會(huì)導(dǎo)致免疫病理反應(yīng)。其中IL2為調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子，它是動(dòng)物機(jī)體中最重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子之一，是由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生并作用于T淋巴細(xì)胞，具有激活T淋巴細(xì)胞、促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分化和誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素的功能19。研究CSFV感染PBMC對(duì)IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響，對(duì)了解CSFV感染過程中免疫應(yīng)答的激發(fā)和調(diào)控具有重大的意義。CSFV感染PMBC后結(jié)果顯示在CSFV感染后07D，IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，而在第1014D，IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，第21DIL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平又恢復(fù)到正常水平。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得出如下結(jié)論CSFV感染后07D，CSF在機(jī)體內(nèi)大量增殖，對(duì)機(jī)體的免疫細(xì)胞及免疫因子造成了一定的損傷，造成了機(jī)體內(nèi)IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平的降低，以至于導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)IL2含量的下降和機(jī)體對(duì)抗CSFV產(chǎn)生免疫應(yīng)答能力的下降，即在IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平上顯示為降低；CSFV感染后714D，隨著機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫的不斷進(jìn)行，T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞相繼分化各種免疫相關(guān)因子，各種免疫細(xì)胞因子之間的相互協(xié)調(diào)使機(jī)體免疫應(yīng)答能力不斷提高，機(jī)體抗病毒能力進(jìn)一步增強(qiáng)，與此同時(shí)IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平提高，機(jī)體內(nèi)IL2的含量呈遞增趨勢(shì)，即在IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平上顯示為增加，其中CSFV感染后第14DIL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平最高，表明了在第14DIL2誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒感染應(yīng)答現(xiàn)象最為明顯；CSFV感染后1421D，IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平又恢復(fù)到正常水平，表明機(jī)體內(nèi)CSFV已經(jīng)被消滅，機(jī)體內(nèi)不再需要過多IL2，因此IL2MRNA轉(zhuǎn)錄水平為正常水平。參考文獻(xiàn)1葛明東,胡德建,王藝超細(xì)胞因子類藥物的臨床應(yīng)用J中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥,2009,16644452KOUWENHOVENM,OZENCIV,TELESHOVAN,ETALENZYMELINKEDIMMUNOSPOTASSAYSPROVIDEASENSITIVETOOLFORDETECTIONOFCYTOKINESECRETIONBYMONOCYTESJCLINDIAGNLABIMMUNOL,2001,86124812573MYERSMJ,FARRELLDE,BAKERJD,ETALCHALLENGEDIFFERENTIALLYAFFECTSCYTOKINEPRODUCTIONANDMETABOLICSTATUSOFGROWINGANDFINISHINGSWINEJDOMESTANIMENDOCRINOL,1999,1743453604WILLIAMSPN,COLLIERCT,CARROLLJA,ETALTEMPORALPATTERNANDEFFECTOFSEXONLIPOPOLYSACCHARIDEINDUCEDSTRESSHORMONEANDCYTOKINERESPONSEINPIGSJDOMESTANIMENDOCRINOL,2009,3731391475袁仙麗,李明才,李燕,等白細(xì)胞介素38及其相關(guān)細(xì)胞因子在炎癥中的作用J中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào),2013,358123212376TANIGUCHIT,MATSUIH,FUJITAT,ETALSTRUCTUREANDEXPRESSIONOFACLONEDCDNAFORHUMANINTERLEUKINJNATURE,1983,30259063053107HERZBERVLSMITHCELLGROWTHWITHOUTSERUMJDOMESTANIMENDOCRINOL1987,139499810048李蘊(yùn)玉,李佩國(guó),張艷英,等白細(xì)胞介素2IL2在獸醫(yī)中的應(yīng)用進(jìn)展綜述J河北科技師范學(xué)院學(xué)報(bào),2006,20463669LOWENTHALJW,LAMBRECHTB,VANDENBERGTP,ETALAVIANCYTOKINESTHENATURALAPPROACHTOTHERAPEUTICSJDEVELOPMENTALCOMPARATIVEIMMUNOLOGY,2000,24235536510王琴我國(guó)豬瘟的分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)及防控J豬業(yè)科學(xué),2010,271828411王琴豬瘟病毒流行病學(xué)、病原致病特性及豬瘟綜合防制研究J中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2006,85131812焦偉,鄧卓霖,劉時(shí)才腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素和干擾素的體內(nèi)外抗鼻咽癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究J腫瘤防治研究,2002,291151713孫金福,史子學(xué),郭煥成,等豬瘟病毒感染豬外周血白細(xì)胞凋亡及CD4和CD8T淋巴細(xì)胞亞群的變化J中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2008,38434234514周遠(yuǎn)成CSFVSM株感染對(duì)豬外周血白細(xì)胞的影響以及在豬體內(nèi)的分布D四川農(nóng)業(yè)大學(xué),200915PFAFFLMWANEWMATHEMATICALMODELFORRELATIVEQUANTIFICATIONINREALTIMERTPCRJNUCLEICACIDSRES,2001,299E4516蔣春燕,王泰健,王琴,等實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)J動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2005,26129710117范學(xué)政,陳鍇,徐璐,等豬瘟病毒感染對(duì)豬外周血細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的影響J中國(guó)獸醫(yī)雜志,2013,963618李敏,汪洋,張銀萍,等TAQMAN探針與SYBRGREEN實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物外源基因拷貝數(shù)的差異分析J安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,39456857019張曉昂高劑量和低劑量的白細(xì)胞介素2對(duì)小鼠T細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎的不同影響D中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué),2009致謝畢業(yè)論文終于寫完了，大學(xué)生活也即將畫上句號(hào)?；叵雱偺と氪髮W(xué)校門的時(shí)候，我成人禮剛過，仍稚氣未脫，回首大學(xué)四年走過的歲月，不論在學(xué)習(xí)上，還是生活中，周圍的人幫助了我很多，教會(huì)了我很多東西。這四年之間我成長(zhǎng)了很多，學(xué)會(huì)了很多，不論是學(xué)習(xí)還是做人方面。最需要感謝的是我的母校新鄉(xiāng)學(xué)院，學(xué)風(fēng)嚴(yán)謹(jǐn)，為我創(chuàng)造了良好的學(xué)習(xí)氛圍，讓我能在大學(xué)四年期間專心學(xué)習(xí)，充實(shí)自己。感謝生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院的領(lǐng)導(dǎo)認(rèn)真負(fù)責(zé)，嚴(yán)格管理使得生科院有一個(gè)好的學(xué)習(xí)氛圍，因此我得以獲益。感謝母校，感謝生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院院領(lǐng)導(dǎo)。首先，我非常感謝岳鋒岳老師，岳老師是我的論文指導(dǎo)老師，他是位嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)真，很有責(zé)任心的老師。近期他在忙自己的博士論文，而且在系里還要代課，平常都很忙，感謝他在百忙的教學(xué)工作之中抽出時(shí)間修改我的論文。我的論文修改過很多遍，感謝岳老師的耐心指導(dǎo)，即使是很簡(jiǎn)單的問題，他從來沒覺得不耐煩。沒有他的耐心指導(dǎo)，就沒有我論文的最終完成。誠(chéng)摯的感謝岳老師其次，感謝我大學(xué)期間的任課老師和舍友同學(xué)們。老師們都很認(rèn)真負(fù)責(zé)，他們?cè)谡n堂上激情澎湃，認(rèn)真授課，課堂下悉心指導(dǎo)，給了我很多的幫助。感謝我的舍友和同學(xué)，在日常的學(xué)習(xí)和生活中幫助了我很多。在此，感謝我的老師和各位同學(xué)。最后，我真摯的感謝我的父母。感謝父母對(duì)我無微不至的照顧。從小學(xué)到大學(xué)一直悉心照顧，感謝父母教會(huì)了我做人的道理，讓我一直健康成長(zhǎng)，順利完成我的學(xué)業(yè)，謝謝我的父母。謝謝所有的老師，同學(xué)還有我的父母。為你提供優(yōu)秀的畢業(yè)論文參考資料，請(qǐng)您刪除以下內(nèi)容，O_O謝謝ALARGEGROUPOFTEAMERCHANTSONCAMELSANDHORSESFROMNORTHWESTCHINASSHAANXIPROVINCEPASSTHROUGHASTOPONTHEANCIENTSILKROAD,GANSUSZHANGYECITYDURINGTHEIRJOURNEYTOKAZAKHSTAN,MAY5,2015THECARAVAN,CONSISTINGOFMORETHAN100CAMELS,THREEHORSEDRAWNCARRIAGESANDFOURSUPPORTVEHICLES,STARTEDTHETRIPFROMJINGYANGCOUNTYINSHAANXIONSEPT19,2014ITWILLPASSTHROUGHGANSUPROVINCEANDXINJIANGUYGURAUTONOMOUSREGION,ANDFINALLYARRIVEINALMATY,FORMERLYKNOWNASALMAATA,THELARGESTCITYINKAZAKHSTAN,ANDDUNGANINZHAMBYLPROVINCETHETRIPWILLCOVERABOUT15,000KILOMETERSANDTAKETHECARAVANMORETHANONEYEARTOCOMPLETETHECARAVANISEXPECTEDTORETURNTOJINGYANGINMARCH2016THENTHEYWILLCOMEBACK,CARRYINGSPECIALTYPRODUCTSFROMKAZAKHSTANASMALLARTTROUPEFOUNDEDSIXDECADESAGOHASGROWNINTOAHOUSEHOLDNAMEINTHEINNERMONGOLIAAUTONOMOUSREGIONINTHE1950S,ULANMUQIRARTTROUPEWASCREATEDBYNINEYOUNGMUSICIANS,WHOTOUREDREMOTEVILLAGESONHORSESANDPERFORMEDTRADITIONALMONGOLIANMUSICANDDANCESFORNOMADICFAMILIESTHE54YEAROLDWASBORNINTONGLIAO,INEASTERNINNERMONGOLIAANDJOINEDTHETROUPEIN1975HESAYSTHEREARE74BRANCHTROUPESACROSSINNERMONGOLIAANDACTORSGIVEAROUND100SHOWSEVERYYEARTOLOCALNOMADICPEOPLE“ICANSTILLRECALLTHEDAYSWHENITOUREDWITHTHETROUPEINTHEEARLY80SWESATONTHEBACKOFPICKUPTRUCKSFORHOURSTHESKYWASBLUE,ANDWECOULDNTHELPBUTSINGTHEFOLKSONGS,“NASUNSAYSTHEVASTNESSOFINNERMONGOLIAANDTHELACKOFENTERTAINMENTOPTIONSFORPEOPLELIVINGTHERE,MADETHEIRLIVESLONELY“THENOMADICPEOPLEWEREVERYEXCITEDABOUTOURVISITS,“NASUNRECALLS“WEDIDNTHAVEAFORMALSTAGETHEAUDIENCEJUSTSATONTHEGRASSUSUALLY,THEPERFORMANCESBECAMEABIGPARTYWITHLOCALPEOPLEJOININGIN“FORHIM,THEREWARDINGPARTABOUTTOURINGISNTJUSTABOUTSHARINGARTWITHNOMADICFAMILIESBUTALSOABOUTGAININGINSPIRATIONFORTHEMUSICANDDANCEULANMUQIRLITERALLYTRANSLATESAS“REDBURGEON“,ANDTODAYSPERFORMERSOFTHETROUPESTILLTOURTHEREGIONSVILLAGESANDENTERTAINNOMADICFAMILIES,BUTTHEIRFAMEHASSPREADAROUNDTHEWORLDONMAY16AND17,NEARLY100SINGERSANDDANCERSFROMTHETROUPEPERFORMEDATBEIJINGSPOLYTHEATERTHEIRSHOW,TITLEDULANMUQIRONTHEGRASSLAND,DEPICTEDTHEHISTORYANDDEVELOPMENTOFTHEARTTROUPE“BEINGFROMTHEREGIONALLOWEDMETOEMBRACETHECULTUREOFINNERMONGOLIAANDBEINGAMEMBEROFTHETROUPESHOWEDMEWHEREIBELONGED,“NASUN,THEARTTROUPESPRESIDENT,WHOISALSOARENOWNEDTENOR,TELLSCHINADAILYDURINGATOURIN1985,HEWENTTOAVILLAGEANDMETANELDERLYLOCALMAN,WHOTOLDHIMASTORYABOUTHISFRIENDSHIPWITHASOLIDERFROMSHENYANG,CAPITALOFNORTHEASTCHINASLIAONINGPROVINCE,DECADESAGOTHESOLIDERGAVETHEOLDMANAHANDMADESADDLEWHENTHEYBIDFAREWELLTHESTORYINSPIREDNASUNTOWRITECARVEDSADDLE,ASONGTHATLATERBECAMEONEOFHISMOSTPOPULARNUMBERSNOW,EVERYYEAR,NASUNRECRUITSYOUNGSINGERSANDDANCERSFORTHETROUPETHETROUPEHASALSODESIGNEDANEWREPERTOIRE,WHICHISMOSTLYBASEDONTHEDAILYLIVESOFMONGOLIANPEOPLE,ESPECIALLYTHELIVESOFNOMADICFAMILIES,ANDHASCOMBINEDCONTEMPORARYMUSICALELEMENTSWITHFOLKSONGSOFTHEREGIONHAIMU,A25YEAROLDKHOOMEIALOCALVARIANTOFOVERTONESINGINGSINGER,JOINEDTHETROUPETHREEYEARSAGOALONGWITHASIXMEMBERBAND,HEPERFORMSFASTSONGSANDSOFTONESTHATHEWRITESALLWHILEPLAYINGTHEHORSEHEADFIDDLE“ALTHOUGHILEARNEDTHEPIANOSINCECHILDHOODANDGREWUPLISTENINGTOVARIOUSKINDSOFMUSIC,TOME,THEFOLKMUSICOFINNERMONGOLIAISTHEROOT,“HESAYS“PERFORMINGINREMOTEVILLAGESISPLEASANTIFEELATHOMEONTHEBOUNDLESSGRASSLANDS,ANDTHEWARMPEOPLETHEREMAKEMEFEELFULFILLED“THEFIRSTROUNDOFSPRINGAUCTIONSEASONINBEIJINGENDEDLASTWEEK,BUTITFAILEDTOCREATEMUCHSPRINGINTHEARTMARKETALTHOUGHTWOPIECESOFCHINESEPAINTINGFETCHEDMORETHAN100MILLIONYUAN,THEDECLINEINTRADINGVOLUMEANDSALERATESHOWEDADOWNTURNTHISYEARINTHE“GRANDVIEWCHINESEPAINTINGHIGHLIGHT”SESSIONATCHINAGUARDIAN2015SPRINGAUCTIONS,PANTIANSHOUSREPRESENTATIVEWORKEAGLE,ROCKANDFLORAHITARECORDAUCTIONPRICEOF279MILLIONYUAN,WHILELIKERANSMASTERWORKJINGGANGMOUNTAINFETCHED1265MILLIONYUAN,ANUNEXPECTEDHIGHINRECENTYEARSHOWEVER,THETRADINGVOLUMEFELLSTO187BILLIONYUANFROM222BILLIONYUANINTHESAMEPERIODTHEYEARBEFORETHEHUANGCHEN2015SPRINGAUCTIONS,WHICHRECORDED425MILLIONYUANINTOTALSALES,EXPERIENCEDTHESAMETHESECTIONNUMBERWENTDOWNTO5FROM12COMPAREDTOLASTYEARACCORDINGTOEXPERTSHAOJIANWU,THEARTMARKETDIDNOTATTRACTMUCHEXCITEMENTTHISYEARDUETOTHEBOOMINGSTOCKMARKETANDTHEPERSISTENTPROBLEMSOFFORGERYANDFAKEDEALSTHETWOPIECESOFCHINESEPAINTINGNOTCHEDUPHIGHPRICETHISSPRINGDUETOTHEIROWNVALUENOTDUETOAREVIVALINTHEMARKET“THESUCCESSFULTRANSACTIONOFTWOWORKSWITHAHAMMERPRICEOFMORETHAN100MILLIONYUANONCEAGAINCONFIRMSTHATVALUABLEANDRAREWORKSOFHIGHQUALITYALWAYSEARNTHELONGLASTINGHIGHPRICECHINESEPAINTINGANDCALLIGRAPHYISSTILLTHEPILLAROFTHEMARKETHOWEVER,THEOVERALLSALESRATEHASDROPPEDSLIGHTLY,WHICHREFLECTSTHEDEMANDFORTHEORDINARYAUCTIONGOODSHASWEAKENED,”SAIDTHEPRESIDENTOFCHINAGUARDIANSHUYANYAN“BESIDES,THEENTRYOFNEWBUYERSALSOMAKESCERTAINCHANGESTOTHEDIRECTIONOFPURCHASINGINAWORD,THEOVERALLMARKETTRENDISVERYUNPREDICTABLEALTHOUGHCHINAGUARDIAN2015SPRINGAUCTIONSHASACHIEVEDREMARKABLERESULTS,ITDOESNOTMEANTHATTHEMARKETHASWALKEDOUTOFTHEPREDICAMENTWESTILLHAVETOWAITFORTHEBIGECONOMICBOOMTOINVIGORATETHEARTMARKET”EVENSO,THEHOTPURSUITOFSOMESPECIALITEMSAPPEAREDTHISSPRINGASPECIALSESSIONOFCHINAGUARDIANSPRINGAUCTIONSTITLED“FINEGILTBRONZEBUDDHISTIMAGES”ACHIEVEDAGREATDEALWITHTOTALSALESVOLUMEOF4189MILLIONYUANAND92PERCENTSALERATETHE5THSHAMARRINPOCHESTATUEFROM1617THCENTURYOFTIBETWASSOLDFOR506MILLIONYUANTHEBEIJINGCHENGXUANAUCTIONSFEATUREDALMOST2,800ITEMSOFCOINSANDSTAMPSINTHREESESSIONSWITHGOODSALERATETHEHUACHENAUCTIONSALSOSETASPECIALSESSIONOFPHOTOGRAPHSUNDERTHECONDITIONOFLARGESCALEDECLINEOFAUCTIONSESSIONSTHEREWASAPALPABLEDULLTHUDOFDISAPPOINTMENTTHATACCOMPANIEDTHERETURNOFTHEIMPERIALENTOURAGEOFZHENHUANTOHERHOMELANDITFOLLOWEDACOUPLEYEARSOFHUSHEDEXCITEMENTASCHINESEFANSWEREFEDTIDBITSABOUTTHEIRPROUDCONCUBINEWHOWASSUPPOSEDTOCONQUERTHEHIGHGROUNDOFTHENORTHAMERICANMARKETZHENHUANIS,OFCOURSE,THETITLECHARACTEROFTHELEGENDOFZHENHUAN,A2011TELEVISIONSERIESTHATSWEPTCHINAOFFITSFEETANDLATERTOOKOTHERASIANCOUNTRIESBYSTORMTWOYEARSAGO,ITWASREPORTEDTHATHBO,APREMIUMCABLESERVICEHEADQUARTEREDINTHEUNITEDSTATES,WASGOINGTOAIRITINNORTHAMERICAAFTERSOMEMODIFICATIONNOW,ACONDENSEDVERSIONTHATPROVIDESENGLISHSUBTITLESBUTNODUBBINGHASFINALLYBEENMADEAVAILABLEONNETFLIXFORONLINESTREAMINGTHISVERSION,HIGHLYANTICIPATEDASAMILESTONEINCHINASCULTURALFORAYOVERSEAS,HASBEENWIDELYPANNEDBYITSHOMEAUDIENCERETITLEDEMPRESSESINTHEPALACE,THEAMERICANVERSIONHASBEENSHORTENEDFROMITSORIGINAL76EPISODESAT45MINUTESEACH,TOSIX90MINUTEEPISODESTHEQUICKPACINGTHREWOFFMANYNATIVEVIEWERS,WHOAREACCUSTOMEDTOAMORELEISURELYDAYTIMESOAPSTYLENARRATIVERHYTHMCHINESETVSTATIONSWOULDRUNTWOORTHREEEPISODESEVERYDAYIDIDNOTFINISHTHEFULLLENGTHVERSIONANDFOUNDTHETRUNCATEDONENOTDIFFICULTTOFOLLOWWHATSLOST,IBELIEVE,ARETHEINTERESTINGSETUPSANDPAUSESTHATILLUMINATETHECHINESEARTOFSTORYTELLINGMUCHOFTHEPLOTISSTILLTHEREITISTHEFLAVORTHATWASSACRIFICEDTHEAMERICANEDITIONUSESTHEFRAMEWORKOFTHEEMPRESSDOWAGERINHERSENIORYEARSREMINISCINGATTHEBEGINNINGANDTHEENDOFEACHEPISODE,HINTINGATWHATSTOCOMEANDRECAPPINGTHEKEYPOINTSTHISDEVICE,NOTUSEDINTHEORIGINAL,ISCULTURALLYUNDERSTANDABLEBUTARTISTICALLYMEDIOCREWHATPUZZLESMEISTHETWONEWSONGSFORTHEOPENINGANDENDCREDITSTHEYWEREWRITTENINENGLISH,BUTSUNGBYCHINESEWITHANUNCOMFORTABLEACCENTTHEYWEREOBVIOUSLYDESIGNEDTOAPPEALTOANENGLISHSPEAKINGBASE,BUTDONOTJIBEWITHTHECHINESEDIALOGUESPEAKINGOFTHEDIALOGUE,THEENGLISHTRANSLATION,PICKEDAPARTBYSOMECHINESE,ISTOOLITERALFORMYTASTEICANIMAGI