1、安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，JournalofAnhuiA Sei2014，42(11)：31533155，3198責(zé)任編輯 石金友 責(zé)任校對(duì) 況玲玲響應(yīng)面法優(yōu)化重組畢赤酵母菌表達(dá) D-甘露聚糖酶的誘導(dǎo)條件李慧玲 ，劉祖艷 ，趙敏(1東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040)摘要 目的對(duì)重組畢赤酵母茵表達(dá) B一甘露聚糖酶的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。方法以重組畢赤酵母 GS115為研究對(duì)象，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定最佳產(chǎn)酶條件，并采用響應(yīng)面試驗(yàn)確定 3個(gè)因素的最佳水平。結(jié)果最佳產(chǎn)酶條件為：培養(yǎng)溫度 28，培養(yǎng) pH 65，搖床轉(zhuǎn)速210rmin，培養(yǎng)基裝液量

2、100ml。響應(yīng)面試驗(yàn)確定3個(gè)因素即裝液量、甲醇添加量和 pH最佳值分別為10318ml、177和669；在此條件下，p一甘露聚糖酶的活力最大值為49175 Uml。結(jié)論驗(yàn)證試驗(yàn)證明模型預(yù)測(cè)值準(zhǔn)確、可靠，為重組畢赤酵母菌的合理開(kāi)發(fā)利用提供了依據(jù)。關(guān)鍵詞 重組畢赤酵母；3-甘露聚糖酶；響應(yīng)面中圖分類(lèi)號(hào) S182文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 05176611(2014)110315303Optimization ofExpression Conditionsof mflnnflnflse Induced by RecombinantPcha pastorsby Response Surface Meth

3、odologyLIHui-ling，ZHANG Manetal (ColegeofLifeSciences，NortheastForestryUniversity，Harbin，Heilongjiang150040；ColegeofPharma cy，HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin，Heilongjiang150040)Abstract ObjectiveTooptimize theinduction conditionsoftherecombinantPichiapastoris-mannanaseMethodWithrecomb

4、inantP iapastorisGS115 asstudyobjecttheoptimalenzymeproducingconditionsandhreetfactorsoptimal levelweredeterminedbysinglefactorexperimentandresponsesurfaceexperimentrespectivelyResultTheoptimum enzymeproducingconditionsrea：temperature28，pH 65，rotatingspeed210rmin，volumeofmedium 100m1Responsesurfacem

5、ethodologywasusedtooptimizetheabovehreetfactors(volumeofme dium，methanolconcentration，pH ofmedium)withtheoptimum value10318ml，177，669，respectivelyheTBmannanaseactivitywouldreachthehighestvalue(49175Um1)underhetoptimizedfermentationconditionsConclusionThepredictedvaluesfrom theresponsesurface methodo

6、logy wereproved tobecorrectand reliableby verificationtest，which wilprovidea referenceforappropfiateutilization and develop mentofrecomb inantPichia pastorisKey words RecombinantPichia pastoris；Bmannanase；Response surfacemethodologyp一1，4一D一甘露聚糖酶 (p一1，4一Dmannan mannanohydro-lase，EC32178)，簡(jiǎn)稱為 p甘露聚糖酶(p

7、mannanase)屬于半纖維素酶類(lèi)，可以斷裂 B一1，4-D-甘露糖苷鍵 。 一甘露聚糖酶廣泛應(yīng)用于紙漿、飼料和鉆井等生產(chǎn)領(lǐng)域 J。B-甘露聚糖酶存在于細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌和植物中 J。來(lái) 自于細(xì)菌的 B甘露聚糖酶已被分離得到，如 Baeillus subtilis WY34、Cellulosimicrobium spstrain HY一13、Sphingomonasstrain等 。克隆細(xì)菌的 B-甘露聚糖酶并且高效異源表達(dá)有助于滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母成功作為高水平表達(dá)異源蛋白的表達(dá)系統(tǒng) “。筆者為了使構(gòu)建的重組畢赤酵母表達(dá) B甘露聚糖酶潛力充分發(fā)揮出來(lái)，優(yōu)化其發(fā)酵過(guò)程，

8、以獲得較高的產(chǎn)物濃度。研究選用裝液量、甲醇添加量和 pH值 3個(gè)關(guān)鍵因素為 自變量，以重組 B-甘露聚糖酶的酶活力為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法(responsesurfacemethodology，RSM)進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化并確定最佳方案，以期為重組畢赤酵母的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。1 材料與方法11 材料111 供試菌株。分泌表達(dá) B一甘露聚糖酶的重組畢赤酵母菌 Manl2，由東北林業(yè)大學(xué)微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室保存。112 主要試劑。培養(yǎng)基的配制方法參見(jiàn) Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊(cè)。作者簡(jiǎn)介 李慧玲 (1979一 )，女，黑龍江北安人，講師，碩士，從事環(huán)境微生物和生物藥物研究。收稿 13期

9、 2014-03-0412 方法121 菌株的誘導(dǎo)表達(dá)。取一80冰箱保存的甘油菌接種于 YPD培養(yǎng)基中，劃線活化，28倒置培養(yǎng)。挑取菌株接種至 BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng) 1618h至 DD =26，離心收集菌體，用 BMMY重懸菌體，使 0D =10左右；取菌液繼續(xù)震蕩培養(yǎng)，每隔 24 h加入無(wú)水 甲醇誘導(dǎo)，誘導(dǎo) 72h，測(cè)定酶活性。122 粗酶液的制備。取誘導(dǎo)表達(dá) Man12菌株培養(yǎng)液，離心后上清液即為粗酶液。123 重組 B-甘露聚糖酶活力測(cè)定方法。采用改進(jìn)的 3，5一二硝基水楊酸法(DNS方法)測(cè)定酶活力 ，利用比色法測(cè)定酶解后還原產(chǎn)物的生成量，以表示酶的活力。酶活力定義：在一定溫度和 pH

10、下，以每分鐘生成相當(dāng)于 1ixmolD一甘露糖所需酶量為一個(gè)酶活力單位(Iu)。124 培養(yǎng)溫度對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響。重組畢赤酵母菌分別在 24、26、28、30和32條件下培養(yǎng)，以確定最佳培養(yǎng)溫度。 125 甲醇濃度對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響。在 BMGY培養(yǎng)基中分別添加濃度為 025、050、100、150、200和 250的甲醇，誘導(dǎo)培養(yǎng) 72h后測(cè)定酶的活力，以確定甲醇的最佳添加量。126 不同 pH值對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響。通過(guò)添加01molL的磷酸鉀緩沖液使培養(yǎng)基的 pH值分別達(dá)到 30、40、50、60、70和 80的培養(yǎng)基，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá) 72 h后測(cè)定酶的活力，以獲得發(fā)酵

11、培養(yǎng)最佳 pH值。127 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響。重組畢赤酵3154安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)母菌搖床培養(yǎng)時(shí)轉(zhuǎn)速分別設(shè)定為 180、190、200、210、220和230rainr，進(jìn)行培養(yǎng)。128 培養(yǎng)基裝液量對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響。分別將50、70、100、110、120和 130ml經(jīng) BMMY重懸的菌液裝入 500 rnl三角瓶中培養(yǎng)，測(cè)定酶活，獲得最佳裝液量。129 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件。利用 Design。Expert軟件進(jìn)行裝液量、甲醇添加量和培養(yǎng)基 pH3個(gè)條件的響應(yīng)面分析，以B一甘露聚糖酶酶活力為響應(yīng)值。2 結(jié)果與分析21 培養(yǎng)溫度對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)的影響 圖 1表明，培養(yǎng)溫度在

12、28和 30時(shí)酶活達(dá)到最大值 ，32時(shí)酶活有所下降，畢赤酵母菌生長(zhǎng)在最適溫度的時(shí)候，生長(zhǎng)旺盛，產(chǎn)酶量增加，酶活達(dá)到最大值。5 0004 000寒 3 000髓罄 200543，11 000咖咖0O2426283O32培養(yǎng)溫度 圖 1 培養(yǎng)溫度對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響5 0004 0003 000鎏201 0000n 25旺5115225甲醇添加量 圖2 甲醇添加量對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影晌適的pH也可以減少 p一甘露聚糖酶在發(fā)酵過(guò)程中的消耗。圖 3表明，當(dāng)培養(yǎng)基 pH值是 65的時(shí)候酶活達(dá)到最高。墨謄455O5506570培養(yǎng)基pH值圖 3 培養(yǎng)基 pH值對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響4 0003 0

13、00毒201 000O1801902002l0220230轉(zhuǎn)速 rmin圖 4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響24 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響 由于重組畢赤酵母生長(zhǎng)過(guò)程耗氧量大，當(dāng)搖床速度增加時(shí)，培養(yǎng)基中的溶解氧含量上升，有利于其生長(zhǎng)。圖4表明，當(dāng)搖床增加轉(zhuǎn)速達(dá)到 210rmin時(shí)，重組 B一甘露聚糖酶活性最大。但是當(dāng)轉(zhuǎn)速進(jìn)一步提高后重組酶的活性提高不大。25 培養(yǎng)基裝液量對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響 圖 5表明，在 500ml三角瓶中裝入 100120 ml培養(yǎng)基時(shí)，產(chǎn) B一甘露聚糖酶活性最高。培養(yǎng)基的裝瓶量影響著培養(yǎng)基中的溶氧量，當(dāng)培養(yǎng)基所占體積過(guò)多時(shí)，搖瓶中的空氣含量減少，導(dǎo)致培養(yǎng)基

14、中的溶氧量降低，影響重組畢赤酵母的生長(zhǎng)。54咖22 甲醇濃度對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響 畢赤酵母是甲醇利用型酵母，能以甲醇為唯一的碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。由于外源基因是整合到 AOX1下游的，因此重組畢赤酵母外源基因的墨表達(dá)受甲醇的嚴(yán)格調(diào)控。圖 2表明，當(dāng)甲醇濃度在 15時(shí) ，鎏重組 B一甘露聚糖酶活性達(dá)到最大值。在重組畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白過(guò)程中：當(dāng)甲醇濃度過(guò)低時(shí)，重組畢赤酵母因缺乏碳源生長(zhǎng)受到抑制，當(dāng)甲醇含量過(guò)高時(shí)，由于甲醇會(huì)導(dǎo)5O7O10O110120130致細(xì)胞中毒，也可使重組畢辦酵母表達(dá)外源基因受到影響，裝液量mL適宜的甲醇含量可使重組畢赤酵母高效表達(dá)外源基因 。23 不同 pH值對(duì)重組畢赤酵

15、母產(chǎn)酶的影響 重組畢赤酵圖 5裝液量對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響母生產(chǎn) B一甘露聚糖酶的過(guò)程涉及多種酶促反應(yīng) ，在某一 pH26 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果篩選培養(yǎng)基的裝液量、甲醇添值條件下 B一甘露聚糖酶會(huì)被畢赤酵母生長(zhǎng)過(guò)程 中釋放的蛋加量和培養(yǎng)基 pH進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，以粗酶液的 B一甘露聚糖酶活力為響應(yīng)值。A代表裝液量，B代表甲醇用量，c代表溶白酶所降解，因此必須添加合適 pH的緩沖溶液以穩(wěn)定酵母液 pH值。采用 DesignExpert軟件建立回歸模型為 y(p-甘生長(zhǎng)環(huán)境的 pH，以此來(lái)提高 p一甘露聚糖酶的產(chǎn)量。同時(shí)合3198安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2014盎是含尿素培養(yǎng)基，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照，原因與碳源試驗(yàn)相同

16、，可能是菌絲死亡了一部分，所以產(chǎn)量較低。因此，從多糖產(chǎn)量上分析，最佳氮源為黃豆粉，尿素不應(yīng)作為氮源加以使用。1201OO鑿爭(zhēng)婀苷 80婚蘋(píng)2。0甏謄蕾饕集注：數(shù)據(jù)來(lái)源于 4個(gè)重復(fù)的平均值。無(wú)相同小寫(xiě)字母表不差異顯著。圖 7 不同氮源培養(yǎng)基中菌絲體多糖含量3 結(jié)論該研究以人工栽培的花臉香蘑分離獲得的菌株為研究對(duì)象，采用液體培養(yǎng)的方法，對(duì)菌絲體進(jìn)行碳源和氮源利用能力試驗(yàn)，通過(guò)比較分析菌絲體麥角固醇含量和多糖含量，研究不同碳源和氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)和多糖含量的影響。通過(guò)比較分析麥角固醇含量結(jié)果顯示，果糖、甘露糖、纖維二糖、蔗糖、葡萄糖和麥芽糖都可以作為花臉香蘑菌絲體生長(zhǎng)的碳源，但相比之下，果糖、甘露糖和

17、纖維二糖是更為理想的碳源，而選擇果糖作為碳源，多糖含量則最高。丙氨酸、甘氨酸、黃豆粉和蛋白胨都可以作為氮源使用，添加丙氨酸的培養(yǎng)基中，菌絲生長(zhǎng)效果最好，而含有黃豆粉的培養(yǎng)基中，則是多糖含量最高。不論是比較菌絲體生物量，還是分析多糖含量，其結(jié)果都顯示，在液體培養(yǎng)條件下，不應(yīng)該選擇尿素作為氮源。(上接第 3155頁(yè))蛋白的培養(yǎng)條件有一定差別，需要后期優(yōu)化其發(fā)酵條件，以獲得更多的表達(dá)產(chǎn)物。3 結(jié)論試驗(yàn)利用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化重組酵母菌搖瓶培養(yǎng)條件，最終獲得產(chǎn)酶最優(yōu)條件為：培養(yǎng)溫度為 28，搖床轉(zhuǎn)速是 210rmin，裝液量是 10318ml(500ml三角瓶)、甲醇加入量為 177 、pH是 669，

18、為重組畢赤酵母的中試發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)1MCCLEARY B VBInalfnanaseJMethodsin Enzymology，1988，160：5966102SCHOMBUGD，SALZMANN MEnzymeHandbokMBerlin：Springer-Verlay Berlin Heideberg，1991，1-53BENECH RO，H X，PATROND，et1aRecombinantexpression，character-ization，nda pulp pr ebleaching propey ofa Phanerochaete chrysosporiumendo

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