1、殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法1第八章 殘留農(nóng)藥的檢測方法 -免疫分析法殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法2一、免疫學(xué)基礎(chǔ)知識1.抗原抗原 （antigen, ag）是一類能夠引起機體特異性免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)抗體 或 t 細胞受體發(fā)生特異反應(yīng)的物質(zhì)?？乖哂幸韵聝煞N特性： 免疫原性，即誘導(dǎo)刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或者激活淋巴細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力，具有這種特性的物質(zhì)稱為免疫原； 殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法3l 抗原性（ antigenicity ) ，指與抗體反應(yīng)的性質(zhì)，這種結(jié)合反應(yīng)具有特異性?？乖倪@兩種特性是不同的，具有免疫原性的物質(zhì)必然有抗原性，反之則不一定成立。l具有上述兩種特性的物質(zhì)稱為完全抗原，

2、只具有抗原性的物質(zhì)稱為半抗原，它能與抗體結(jié)合但不能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答.殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法4l2.抗體（antibody,ab)l機體受抗原刺激后，在體液中出現(xiàn)一種能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白，因其具有免疫活性，習(xí)慣上稱為免疫球蛋白.l 殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法5l4.抗原抗體反應(yīng)l抗原與抗體相互作用是免疫學(xué)的基礎(chǔ)，二者通過大量非共價鍵連接，包括靜電力、氫鍵、疏水作用和范德華力等。l抗原和抗體在體內(nèi)進行的反應(yīng)稱為免疫反應(yīng)，在體外進行的反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)。 殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法6l5.免疫分析l免疫分析方法是研究免疫學(xué)的工具。免疫分析是基于抗原抗體之間的特異性相互作用從而實

3、現(xiàn)對抗原、抗體或相關(guān)物質(zhì)進行分析檢測的方法。l免疫反應(yīng)的高選擇性、高親和性和高靈敏性為免疫分析的可靠和準(zhǔn)確提供了保證。 殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法7l從本質(zhì)上講，幾乎所有的免疫分析都是基于識別位點的占據(jù)率的測定，根據(jù)這種反應(yīng)性質(zhì)可分為競爭免疫分析和非競爭免疫分析。殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法8二、酶聯(lián)免疫吸附分析法1971年瑞典學(xué)者engvail和perlmann,荷蘭學(xué)者van weerman和schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法 (enzyme-linked immunosorbentassay , elisa) 。 elisa現(xiàn)在

4、已成為目前分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題 ，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)( immunoenzymatic techniques ) 的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù) 。殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法9l酶聯(lián)免疫吸附分析法（ elisa ）集抗原抗體反應(yīng)的高靈敏性和強特異性于一體，表現(xiàn)出簡單、快速、靈敏和選擇性高等優(yōu)勢，在 20 世紀(jì) 80 年代得到了快速發(fā)展，尤其在農(nóng)藥殘留測定方面表現(xiàn)最為活躍。采用 eijsa 法不僅可以定性，而且可以定量，使用多孔滴定板，一次可進行大批量樣品的測定。殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法10l已商品化的篩選農(nóng)藥殘留的 eiasa 試劑盒種類很多，不僅能用于

5、各種食品和多種環(huán)境樣品中的殺蟲劑、殺菌劑、除草劑分析，而且也能檢測多種環(huán)境污染物，如多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴，以及黃曲霉素等多種天然毒素。lelisa 一次只能檢測單一農(nóng)藥或結(jié)構(gòu)近似的少數(shù)幾種農(nóng)藥，不能解決農(nóng)藥多殘留分析問題。而且抗體制備難度較大。殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法11l目前抗體數(shù)量還較少；分析會受到特異性或非特異性的干擾；如果在不能肯定試樣中農(nóng)藥品種的情況下，檢測具有一定的盲目性；此外有可能出現(xiàn)假陽性或假陰性現(xiàn)象等等。隨著技術(shù)的日趨成熟， elisa 在農(nóng)藥殘留速測中的應(yīng)用會得到新的發(fā)展。殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法12l1.基本原理基本原理l將抗原或抗體固定于合適的載體上，并保持其生物活性

6、使抗原或抗體與某種酶連接這種酶標(biāo)抗原或抗體同時其有免疫活性和酶的活性；待測樣品和酶標(biāo)抗原或抗體與包被的抗原或抗體經(jīng)過一系列反應(yīng)；用洗滌的方法將固相載體上的復(fù)合物與其他物質(zhì)分離；加入酶反應(yīng)的底物，復(fù)合物上的酶催化底物使其水解，氧化或還原成有色產(chǎn)物，一定條件下，產(chǎn)物的色澤與待測物的含量直接相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺對待測物進行定性或定量分析。l測定的對象可以是抗體也可以是抗原。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法13底物顯色底物顯色定性或定量的分析定性或定量的分析原理原理包被包被反應(yīng)反應(yīng)加入待測抗體或加入待測抗體或抗原和酶標(biāo)抗原抗原和酶標(biāo)抗原或抗體或抗體洗滌洗滌使結(jié)合在固相上

7、使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離與未結(jié)合的分離1234殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法14l在這種測定方法中有3種必要的試劑：l固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）l酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）l酶作用的底物（顯色劑）殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法15 測量時，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體測量時，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗活性，當(dāng)偶聯(lián)物

8、與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法16l其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。含量成正比。l l 這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標(biāo)儀）加以測定。（酶標(biāo)儀）加以測定。l l 其方法簡單，方便訊速，特異性強。其方法簡單，方便訊速，特異性強。殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法17 酶結(jié)合物是酶與

9、抗體或抗原、半抗原在交酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原、半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是elisa成敗的成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物大作用，但不同的酶選用不同的底物 ，將得到不同的顏色反應(yīng)將得到不同的顏色反應(yīng).殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法18酶酶 底底 物物顯色反顯色反應(yīng)應(yīng) 測定波長測定波長 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶 鄰苯二胺鄰苯二胺四甲替聯(lián)苯胺四甲替聯(lián)苯胺氨基水楊酸氨基水楊酸鄰聯(lián)苯甲胺鄰聯(lián)苯甲胺2,2-2,2-連胺基連胺

10、基-2(3-2(3-乙基乙基- -并噻唑并噻唑啉磺酸啉磺酸-6)-6)銨鹽銨鹽 橘紅色橘紅色黃色黃色棕色棕色蘭色蘭色藍綠色藍綠色492492460460449449425425642642堿性磷酸酯酶堿性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸鹽硝基酚磷酸鹽(pnp)(pnp)萘酚萘酚-as-mx-as-mx磷酸鹽磷酸鹽+ +重氮鹽重氮鹽 黃色黃色紅色紅色 400400500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 abts+hrp+abts+hrp+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+ +甲硫酚嗪甲硫酚嗪+ +噻唑蘭噻唑蘭 黃色黃色深藍色深藍色 405405420 420 -半乳糖苷半乳糖苷酶酶 甲基傘酮基半乳糖苷甲基

11、傘酮基半乳糖苷(4mug)(4mug)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(onpg) (onpg) 熒光熒光黃色黃色 360,450360,450420420 殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法19l3. elisa 方法的建立l elisa 方法的建立包括待測農(nóng)藥、滴定板和酶的選擇、半抗原合成、人工抗原合成、抗體制備和樣品前處理方法及質(zhì)量控制等。殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法20殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法21三、三、elisa應(yīng)用實例應(yīng)用實例l 飼料中鹽酸克倫特羅的測定飼料中鹽酸克倫特羅的測定 飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素，飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素， 簡曲霉毒素簡曲霉毒素 ） 飼料中有害微

12、生物的快速篩檢飼料中有害微生物的快速篩檢 （如沙門氏（如沙門氏菌菌 ）elisa在飼料安全檢測中的應(yīng)用在飼料安全檢測中的應(yīng)用殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法22 甲胺磷殘留分析甲胺磷殘留分析 甲基對硫磷殘留分析甲基對硫磷殘留分析 呋喃丹殘留分析呋喃丹殘留分析 elisa用于農(nóng)藥殘留的檢測用于農(nóng)藥殘留的檢測殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法23l 主要有除草劑與殺蟲劑兩大類主要有除草劑與殺蟲劑兩大類 例如殺暝松（例如殺暝松（ fn fn ）、）、 甲氟磷酸異已酶（甲氟磷酸異已酶（ soman soman ）、）、 草不綠（草不綠（ alachor alachor ）、）、 西維因（西維因（ carbaryl

13、carbaryl ）、）、 多菌靈及克菌丹（多菌靈及克菌丹（ captan captan ）等。）等。農(nóng)藥的檢測農(nóng)藥的檢測：殘留農(nóng)藥檢測方法免疫分析法24快速快速elisa試劑盒試劑盒elisa 試劑盒目前在食品檢測、水產(chǎn)品檢測、動試劑盒目前在食品檢測、水產(chǎn)品檢測、動物檢疫檢測和農(nóng)藥殘留檢測等方面已得到了廣物檢疫檢測和農(nóng)藥殘留檢測等方面已得到了廣泛的應(yīng)用。它具有快速、靈敏度高、測定步驟泛的應(yīng)用。它具有快速、靈敏度高、測定步驟簡便、成本低、操作安全等特點，完整的簡便、成本低、操作安全等特點，完整的 elisa 試劑盒包含以下各組分：試劑盒包含以下各組分： 包被抗原包被抗原或抗體的固相載體；或抗體的固相載體； 酶標(biāo)抗原或抗體；酶標(biāo)抗原或抗體； 酶的底物；酶的底物； 陰性和陽性對照品（定性測定）陰性和陽性對照品（定性測定），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定）；，參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定）；