1、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告（格式標(biāo)準(zhǔn)）（ 生命科學(xué)專業(yè) ）教 師：黎 勇目錄索引實(shí)驗(yàn)一 油鏡的使用和細(xì)菌的簡單染色法 3實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的革氏染色與芽孢染色 5實(shí)驗(yàn)三 常用培養(yǎng)基的配制 7實(shí)驗(yàn)四 酵母菌霉菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及酵母死活細(xì)胞的鑒別 8 實(shí)驗(yàn)五、微生物大小的測定與顯微計(jì)數(shù) 10實(shí)驗(yàn)六 環(huán)境中微生物的檢測和分離純化11實(shí)驗(yàn)七 細(xì)菌鑒定中常用的生理生化反應(yīng)12實(shí)驗(yàn)八 （綜合實(shí)驗(yàn)）化能異養(yǎng)微生物的分離與純化 13課程名稱：微生物學(xué) 實(shí)驗(yàn)班級：化生系生命科學(xué)本科實(shí)驗(yàn)日期： 指導(dǎo)教師：黎勇實(shí)驗(yàn)一 油鏡的使用和細(xì)菌的簡單染色法 目的要求學(xué)習(xí)并熟練掌握油鏡的使用技術(shù)；觀察細(xì)菌的基本形態(tài)；學(xué)習(xí)觀察細(xì)菌的 運(yùn)動性的基

2、本方法。基本原理1. N 2 A=r2 sin a2. D=入 /2N.A3. 目鏡可提高放大倍數(shù)，但有效放大率取決于鏡口率。已經(jīng)分辨的物體不放大看不清， 未分辨物放得再大也看不清。4. 用懸滴法或凹玻片法觀察細(xì)菌的運(yùn)動性時， 可以通過真運(yùn)動能定向地由一處快速運(yùn)動 來區(qū)別于顆粒的布朗運(yùn)動。器材用具顯微鏡、載玻片、凹玻片、蓋玻片、接種環(huán)、香柏油、二甲苯、凡士林、 吸水紙、擦鏡紙；細(xì)菌、放線菌等固定裝片；培養(yǎng) 18 小時左右的 B.subtilis. S.arueus 菌斜面培養(yǎng)物；無菌水、生理鹽水。方法步驟 ：（一）油鏡的使用鏡檢裝片在中倍 （或高倍鏡） 下找到目的物， 并使位于視野正中 聚光鏡

3、上升到最高位置， 虹彩光圈開到最大， 鏡頭轉(zhuǎn)開成八字形 在玻片的鏡檢部位 （光斑處） 滴一滴香柏油 油 鏡轉(zhuǎn)入正下方 側(cè)視小心上升載物臺（縮短鏡頭與裝片距離，鏡頭浸入油中，至油圈不 擴(kuò)大為止鏡頭幾與裝片接觸） 粗調(diào)器徐徐下降載物臺（密切注視視野，當(dāng)捕捉到物像時， 立即用細(xì)調(diào)器校正） 仔細(xì)觀察并繪圖取出裝片，清洗油鏡：擦鏡紙拭去鏡頭上的香柏油 擦鏡紙沾少許二甲苯擦去殘留（用手 指輔助，迅速拭擦一、二次） 用清潔擦鏡紙仔細(xì)擦干二甲苯（ 2-3 次）。（二）細(xì)菌的簡單染色法： 涂片 干燥 火焰固定 染色 水洗 干燥 油鏡 觀察（三）細(xì)菌運(yùn)動性的觀察 取潔凈蓋玻片， 四周涂上凡士林 滴加一小滴菌懸液

4、凹 玻片的凹窩向下蓋于蓋玻片上 翻轉(zhuǎn)觀察結(jié)果分析1、畫一圓圈表示視野，選取所觀察的微生物繪圖，注意特殊結(jié)構(gòu)、形狀和排列。（描繪時按視野實(shí)際大小 510 倍繪制）菌名：金黃色葡萄放大倍數(shù)： 1003 10特殊結(jié)構(gòu)：無菌名：大腸桿菌球菌放大倍數(shù)： 1003 10（3 5）（3 5）特殊結(jié)構(gòu)：無視野觀察下微生物的形態(tài)2、油鏡使用時為什么必須干燥裝片？ 防止水油分層，光受到折射而影響油鏡性能的發(fā)揮 實(shí)驗(yàn)討論首次實(shí)驗(yàn)中有幾個要點(diǎn)：一是按無菌操作取用菌；二是涂片技術(shù)的掌握；三是油鏡使用 技術(shù)。凡實(shí)驗(yàn)中學(xué)生的所思所想，如無菌操作技術(shù)要點(diǎn)、自行處理實(shí)驗(yàn)材料、失敗與思考等 均可進(jìn)行討論（如涂片時蒸餾水不宜過多、

5、取用菌時防止菌被灼燙變形、取菌宜少不宜多等 均是可以討論的內(nèi)容） 。實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的革氏染色與芽孢染色目的要求 觀察細(xì)菌菌落的特征； 掌握簡單染色法、 革蘭氏染色法的原理及操作步驟； 在油鏡下觀察細(xì)菌個體形態(tài)；學(xué)習(xí)環(huán)境中微生物的檢查方法，并加深對微生物分布廣泛性的 認(rèn)識器材用具 E.coliB.subtilisS.aureus. 的斜面培養(yǎng)物（ 18 24 小時）以及菌落平 板各一個；染液：草酸銨結(jié)晶紫、劃蘭氏染液、盧戈氏碘、95%的乙醇、蕃紅；無菌水、顯微鏡、載片、濾紙、液體石蠟是、 、擦鏡紙、接種環(huán)。方法內(nèi)容 ：（一）實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中微生物的檢查（二）革蘭氏染色法 涂片固定 冷卻 結(jié)晶紫染色 1

6、min 水洗 碘媒染 1min 95%乙醇 30-60s水洗 番紅復(fù)染 2 3min水洗 干燥 油鏡鏡檢（三）芽孢染色 涂片固定 孔雀綠加熱染色（勿干） 5min 水洗 番紅復(fù) 染 1min水洗 鏡檢 結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果被染成紫色者即為革蘭氏陽性，被染成紅色者為革蘭氏陰性；菌 體染成紅色，芽孢被染成綠色。菌名：大腸桿菌菌名：金黃色葡萄球菌放大倍數(shù)： 1003 10染色反應(yīng)： 紫色（陽放大倍數(shù)： 1003 10（3 5）（3 5）染色反應(yīng)： 紅色（陰性） 性）菌名：枯草芽孢桿菌放大倍數(shù)： 1003 10（3 5） 染色反應(yīng)：紫色（陽性） 圖 1 視野觀察下細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)圖 2 枯草芽孢桿菌芽

7、孢形態(tài)圖實(shí)驗(yàn)討論 嚴(yán)格掌握脫色程度，是成敗的關(guān)鍵。若脫色時間過度，則陽性菌初時之紫色脫出，復(fù)染 成紅色，誤成陰性，反之脫色時間不足，陰性菌在初染時的紫色未能脫出，復(fù)染時不能染成 紅色，誤以為陽性菌；涂片不能厚；盧弋氏碘即用即配。作業(yè)1、繪出所觀察到到細(xì)菌的視野圖，并說明染色反應(yīng)。2、哪些因素會影響到革蘭氏染色結(jié)果的正確？其中是關(guān)鍵的一步是什么？ 菌齡及培養(yǎng)條件和染色技術(shù)是最主要的，關(guān)鍵是脫色。3、怎樣對未知菌進(jìn)行革蘭氏染色，以證明你的結(jié)果的正確？ 與已知菌混合涂片比較。實(shí)驗(yàn)三 常用培養(yǎng)基的配制 目的要求了解培養(yǎng)基的配制原理；了解培養(yǎng)基常規(guī)配制程序；了解培養(yǎng)基過程各環(huán) 節(jié)的要求和注意事項(xiàng)。了解半

8、合成培養(yǎng)基的配制原理，學(xué)習(xí)掌握肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯 培養(yǎng)基的配制方法。器材用具等配各種培養(yǎng)基的組成成分，瓊脂、1N NaoH溶液1N HCI天平或臺秤高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、錐形瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。藥匙、稱量紙、 pH試紙、記號筆、棉花、紗布、線繩、塑料試管蓋、牛皮紙報(bào)紙等。方法步驟（一）玻璃器皿的洗滌和包裝 以小組為單位清洗、 控水， 按 9 個為一組， 分別用報(bào)紙包 好并放入烘箱中等待滅菌。（二）液體及固體培養(yǎng)基的配制過程原料稱量（按配方次序）溶解 調(diào)節(jié)p H過濾澄清分裝塞棉塞和包札滅菌分別按教材配方配制牛肉膏蛋白胨、馬鈴薯液體及固體培養(yǎng)基。（ 三） 培養(yǎng)基的分裝

9、 用玻璃漏斗，橡皮管，小玻璃管及彈簧夾制作分裝裝置選用153 150平口試管或150mL錐形瓶貼上標(biāo)簽分裝（至試管高度1/4-1/3，斜面制作用1/5 ,半固體用 1/3 ）要求：每人制作斜面 3 支。其余分裝至錐形瓶中。（四）棉塞的制作及試管、 錐形瓶的包扎 分別制作試管及錐形瓶棉塞并塞好好以牛皮紙 包裝頭部。（五）培養(yǎng)基的滅菌 培養(yǎng)基用濕熱法滅菌；皿用干熱法分別滅菌。（六）斜面和平板的制作（下次試驗(yàn)完成）（七）培養(yǎng)基的無菌檢查（下次實(shí)驗(yàn)完成）（八）無菌水的制備 同時制作無菌生理鹽水，置錐形瓶中備用。結(jié)果分析 以斜面接種培養(yǎng)驗(yàn)證培養(yǎng)基配制效果； 以平板制作及接種 24小時培養(yǎng)驗(yàn)證滅菌效果；

10、簡述移液管包裝的注意事項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)討論 滅菌器的滅菌效果必須間隔一段時間，加以驗(yàn)證，主要方法除無菌檢查外，還通過壓力 試紙同時滅菌來驗(yàn)證其壓力與溫度；培養(yǎng)基通常成批制作備用。但制作后，其貯藏時間有一 定限制，一般室溫條件下不超過三周；冰箱4C條件下可貯藏半年，過期不能用。作業(yè)：1、記錄培養(yǎng)基的成分和名稱2、分析所配制培養(yǎng)基的碳源、氮源、能源及無機(jī)鹽、維生素的來源。 所配制均為天然培養(yǎng)基，各成分主要來自有機(jī)質(zhì)，微量元素可以由自來水提供。3、什么是天然培養(yǎng)基？什么是半合成、合成培養(yǎng)基？實(shí)驗(yàn)四 酵母菌霉菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及酵母死活細(xì)胞的鑒別 目的要求觀察并掌握酵母菌霉菌的菌落特征、個體形態(tài)、生長及繁殖方式

11、。學(xué)習(xí)酵 母死活細(xì)胞的鑒別方法。材料用具釀酒酵母、紅酵母、假絲酵母； （ 釀酒酵母和紅酵母菌落平板各一個。釀酒 酵母豆芽汁斜面及釀酒酵母醋酸鈉斜面各一支， 假絲酵母加蓋片培養(yǎng)的平板 ） ；7.6%孔雀綠染 液， 0.5%蕃紅染液，蘇丹黑染液，二甲苯，中性紅染液，碘液；目鏡測微尺、鏡臺測微尺； 載片及蓋片。方法步驟（ 一） 菌落特征的觀察（ 二） 個體形態(tài)與出芽（ 三） 子囊孢子的觀察（ 四） 酵母死活細(xì)胞的觀察。結(jié)果分析描述釀酒酵母霉菌的菌落形態(tài)特征；繪圖釀酒酵母的菌體、出芽方式及細(xì) 胞細(xì)節(jié)；（一）酵母的菌落濕潤，大而隆起，顏色多樣，正反面顏色一致，不透明，邊緣整齊；菌名：釀酒酵母 放大倍數(shù)：

12、 1003 10（3 5） 特殊結(jié)構(gòu)：芽（出芽繁殖）（二）霉菌 菌落特征：干燥，正反面及中央與邊緣不一致；大而疏松。（如右圖）菌名：青霉（ Penicillium ） 放大倍數(shù)： 1003 10（3 5） 特殊結(jié)構(gòu)：分生孢子梗（帚狀分枝）菌名：毛霉（ Circinella ） 放大倍數(shù)： 1003 10（3 5） 特殊結(jié)構(gòu)：孢子囊菌名：曲霉（ Aspergillus ）放大倍數(shù)：模式圖3 10 （3 5）特殊結(jié)構(gòu)：足細(xì)胞菌名：根霉（ Rhizopus ）放大倍數(shù)： 100特殊結(jié)構(gòu)：假根實(shí)驗(yàn)討論作業(yè)：1、繪圖說明所觀察到的酵母菌、霉菌的形態(tài)特征。實(shí)驗(yàn)五、微生物大小的測定與顯微計(jì)數(shù) 目的要求學(xué)習(xí)并

13、掌握用測微尺測定微生物細(xì)胞大小的方法；了解血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的構(gòu) 造及計(jì)數(shù)原理，掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。材料用具啤酒酵母；顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺；血球計(jì)數(shù)板；蓋玻片，載 玻片，滴管，試管，無菌水，方法步驟（一） 酵母細(xì)胞大小測定（1）目鏡測微尺的校正 （2） 細(xì)胞大小的測定（ 二） 顯微計(jì)數(shù)法（1） 鏡檢計(jì)數(shù)室（2）菌懸液制備及加樣（3）計(jì)數(shù)（4）清洗計(jì)數(shù)板 結(jié)果分析結(jié)果記錄入表中。1、目鏡測微尺的標(biāo)定結(jié)果（精確到零點(diǎn)幾小格）物鏡倍數(shù)（目鏡均為 10 倍）目鏡測微尺的格數(shù)（小格）鏡臺測微尺的格數(shù)（小格）目鏡測微尺的每格的長度（卩m）40 倍2、酵母菌大小測定結(jié)果菌號1234

14、5678910 目鏡測微尺的格數(shù)（小格） 長軸短軸酵母大小平均值=± （保留小數(shù)點(diǎn)后2 位）短軸=長軸=3、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對酵母菌懸液計(jì)數(shù)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)次數(shù) 各中格中菌數(shù) 總菌數(shù) 稀釋倍數(shù)平均值菌數(shù)（個/mL）1實(shí)驗(yàn)討論作業(yè)：1. 什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡和物鏡時，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺校正。2. .根據(jù)實(shí)驗(yàn)體會說明血細(xì)胞計(jì)數(shù)法的誤差主要來自哪些方面？如何減少誤差？3. .在滴加菌液時，為什么要先置蓋玻片然后滴加菌液？能否先加菌液再置蓋玻片？4. .用血球計(jì)數(shù)板測定微生物數(shù)量時，哪些步驟易造成誤差？如何預(yù)防？計(jì)算細(xì)胞數(shù)目時此法是否可以適用？實(shí)驗(yàn)六 環(huán)境中微生物的檢測和分離純化目

15、的要求1、 學(xué)習(xí)并掌握各種無菌操作技術(shù)，并用此技術(shù)進(jìn)行微生物的劃線分離接種2、學(xué)習(xí)掌握平板菌落計(jì)數(shù)法 基本原理 土壤是微生物生活的大本營，是生物多樣性的重要場所，也是發(fā)揚(yáng)微生物資源的重要基地， 可以從中分離純化得到許多的菌株。 劃線法是常用的分離與純化方法， 通過無菌操作條件下， " 漸劃漸稀 " 的效應(yīng)而得到菌落純的菌株。平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測樣品經(jīng)過適當(dāng)稀釋，使其中的微生物充分分散形成單個細(xì)胞，取一 定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落， 即一個單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即 可換算出

16、樣品含菌量。 這種方法為活菌計(jì)數(shù)法， 廣泛應(yīng)用于生物制品及污染程度 （含菌指數(shù)） 的檢測。材料與用品土樣10g,無菌平皿（20套）及無菌水，牛肉膏蛋白胨平板（2只）；取液器（0.5mL及1mL各三支）；無菌有帽試管，三角瓶，無菌涂棒，接種環(huán)，記號筆，酒精燈，火柴，試管架 方法步驟1 、周圍環(huán)境中微生物的檢測平板分 4 個區(qū)做好標(biāo)記 用未洗的手指及肥皂洗過的手指（ 1 次、2 次、3 次，或其它）分 別在四個區(qū)上涂抹倒置到37C培養(yǎng)24小時觀察結(jié)果。2、土壤中微生物分離純化及平板計(jì)數(shù)采土樣（5 20cm） 土 10g,裝入到已滅菌的牛皮袋 （信封）中，封好袋口1.0g加入99mL無菌水（三角瓶）

17、中1mL無菌吸管0.5mL加入到4.5mL無菌水試管中，吹吸三次，振蕩均勻 （10-3） 。同法得 10 4 10 6 土壤溶液用接種環(huán)沾取 10-2 土壤懸液在已經(jīng)凝固的平板表面進(jìn)行劃線分離分別取各濃度土壤懸液 0.1mL 對號均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉膏蛋白胨平 板，用無菌涂棒涂勻（多涂幾遍） 。每個濃度做 3 個平板。結(jié)果分析1 、 有較大片菌苔生長時，棄用。2、 選擇平均菌落數(shù)在 30 300 之間的平板。只有一個濃度符合此范圍時，以該平均菌落數(shù) 為準(zhǔn)；有兩個濃度的平板菌落數(shù)在30 300 之間時，按兩者的總數(shù)平均決定，比值小于 2，取平均，比值大于 2 則取較少的菌落總數(shù)。所有菌落

18、數(shù)大于 300，取稀釋度最高的平均菌落 數(shù)乘稀釋倍數(shù)；所有菌落數(shù)均小于 30，取稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)（即當(dāng)所有菌 落數(shù)均不在 30 300 之間時， 此實(shí)驗(yàn)的精確度要求下， 可以最接近 30 或 300 的菌落數(shù)乘稀釋 倍數(shù)）。實(shí)驗(yàn)討論 土壤中的菌數(shù)量在哪個數(shù)量級？你分離的微生物主要有哪些種類？為什么？105 數(shù)量級，主要是細(xì)菌，也有酵母。主要通過其菌落特征來判斷。細(xì)菌的菌落為濕潤，其 正反面顏色一般一致，普遍比較小。酵母的菌落濕潤，大而隆起，顏色多樣，正反面顏色一 致，不透明，邊緣整齊；而霉菌菌落特征：干燥，正反面及中央與邊緣不一致；大而疏松。實(shí)驗(yàn)七 細(xì)菌鑒定中常用的生理生化反應(yīng)

19、目的要求了解細(xì)菌生理生化反應(yīng)原理，掌握細(xì)菌鑒定中常用的生理生化反應(yīng)方法；通過 對不同細(xì)菌對不同含碳、氮化合物的分解利用情況，了解基代謝多樣性；學(xué)習(xí)不同培養(yǎng)基基 中的不同生長現(xiàn)象及其代謝產(chǎn)物在鑒別細(xì)菌中的意義。實(shí)驗(yàn)原理各種細(xì)菌所具有的酶系統(tǒng)不盡相同，對營養(yǎng)基質(zhì)的分解能力也不一樣，因而代 謝產(chǎn)物存在差別。細(xì)菌的這種代謝方式可供鑒別細(xì)菌之用。用生理生化試驗(yàn)的方法檢測細(xì)菌 對各種基質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物，從而鑒別細(xì)菌的種屬，稱為細(xì)菌的生理生化反應(yīng)。有 些細(xì)菌能發(fā)酵葡萄糖，而不能分解乳糖；有些細(xì)菌能分解某種糖產(chǎn)生有機(jī)酸和氣體；有的細(xì) 菌則只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。在配制培養(yǎng)基時預(yù)先加入溴甲酚紫（pH4.4紅色p

20、H6.2黃色），當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時， 培養(yǎng)基由紫色變黃， 氣體的產(chǎn)生則可由試管中倒置的杜氏小管中有無氣泡來判斷。 大腸桿菌不產(chǎn)生丁二醇，V.P. 試驗(yàn)為陰性。其進(jìn)行混合酸發(fā)酵，故甲基紅試驗(yàn)為陽性。產(chǎn)氣桿菌則進(jìn)行丁二醇發(fā)酵，V.P 試驗(yàn)為陽性，甲基紅試驗(yàn)為陰性。材料用具 E.coli ，變形桿菌，枯草芽孢桿菌，產(chǎn)氣桿菌，糞水中分離的未知菌種斜面， 糖發(fā)酵培養(yǎng)基；超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，試管，移液管，杜氏小管。甲基紅試劑、V.P. 試劑。實(shí)驗(yàn)步驟各取 4 支相應(yīng)的培養(yǎng)基，標(biāo)記好發(fā)酵培養(yǎng)基的名稱、所接菌種名及組號，1 支接大腸桿菌， 1支接變形桿菌， 1支接未知斜面菌種， 1 支不接。1、糖發(fā)酵試驗(yàn)2、甲

21、基紅試驗(yàn)3、V.P. 試驗(yàn)接種后37C分別培養(yǎng)24h、48h、48h,觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入表中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表 71 實(shí)驗(yàn)結(jié)果編號大腸桿菌 枯草芽孢桿菌產(chǎn)氣桿菌未知菌CK 葡萄糖發(fā)酵乳糖發(fā)酵甲基紅實(shí)驗(yàn)V.P. 試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)討論 如：討論通過哪些生理生化反應(yīng)可以區(qū)分大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌？大腸桿菌不產(chǎn)生丁二醇， V.P. 試驗(yàn)為陰性。其進(jìn)行混合酸發(fā)酵，故甲基紅試驗(yàn)為陽性。產(chǎn)氣 桿菌則進(jìn)行丁二醇發(fā)酵， V.P 試驗(yàn)為陽性，甲基紅試驗(yàn)為陰性。實(shí)驗(yàn)八 （綜合實(shí)驗(yàn)）化能異養(yǎng)微生物的分離與純化 目的要求 1 掌握細(xì)菌、放線菌、酵母苗和霉菌稀釋分離、劃線分離等技術(shù)。2 學(xué)習(xí)從樣品中分離、純化出所需菌株。3 學(xué)

22、習(xí)并掌握平板傾注法和斜面接種技術(shù)， 了解培養(yǎng)細(xì)菌、 放線菌、 酵母菌及霉菌 四大類微生物的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間。4 學(xué)習(xí)平板菌落計(jì)數(shù)法。 基本原理 土壤是微生物生活的大本營，是尋找和發(fā)現(xiàn)有重要應(yīng)用潛力的微生物的主要菌源。不同 土樣中各類微生物數(shù)量不同，一般土壤中細(xì)菌數(shù)量最多，其次為放線菌和霉菌。一般在較干 燥，偏堿性、有機(jī)質(zhì)豐富的土壤中放線苗數(shù)量較多；酵母菌在一般土壤中的數(shù)量較少，而在 水果表皮、葡萄園、果園土中數(shù)量多些。本次實(shí)驗(yàn)從土壤中分離細(xì)菌、放線菌和霉菌；白面 曲（ 發(fā)面用的引子 ）或酒曲或果園土中分離酵母菌。為了分離和確保獲得某種微生物的單苗落，首先要考慮制備不同稀釋度的苗懸液。各類 菌

23、的稀釋度因菌源、采集樣品時的季節(jié)、氣溫等條件而異。其次，應(yīng)考慮各類微生物的不同 特性，避免樣品中各類微生物的相互干擾。細(xì)菌或放線苗在中性或微堿性環(huán)境較多但細(xì)菌 比放線萌生長快，分離放線菌時，一般在制備土壤稀釋液時添加10%酚或在分離培養(yǎng)基中加相應(yīng)的抗生素以抑制細(xì)菌和霉菌（如加鏈霉素25-50卩g mL以抑制細(xì)菌；添加制霉菌素50卩g/ mL或多菌靈30卩/ mL以抑制霉菌）;酵母苗和霉菌都喜酸性環(huán)境，一般酵母菌只能以糖為碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH 5時生長極快。而細(xì)菌生長適宜的酸堿度為pH7,所以分離酵母菌時只要選擇好適宜的培養(yǎng)基和pH,可降低細(xì)菌增殖率，霉菌生長慢，也不干擾酵母菌分

24、離。若分離霉菌，需降低細(xì)菌增殖率，一般培養(yǎng)基臨用前須添加滅過菌的乳酸或鏈 霉素。為了防止菌絲蔓延干擾菌落計(jì)數(shù),分離霉菌時常在培養(yǎng)基中加入化學(xué)抑制劑。要想獲 得某種微生物的純培養(yǎng),還需提供有利于該微生物生長繁殖的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。四大 類微生物的分離培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間見表所示。 材料與用品 1. 菌源選定采土地點(diǎn)舌。 鏟去表土層23cm,取310cm深層土壤10g ,裝入已滅過菌的牛皮紙袋內(nèi)封好袋口,并記錄取樣地點(diǎn)、環(huán)境及日期。土樣采集后應(yīng)及時分離,凡不能 立即分離的樣品,應(yīng)保存在低溫、干燥條件下,盡量減少其中菌種的變化。從面曲中分離酵 母菌。也可用酒曲等替代。2培養(yǎng)基 肉膏蛋白胨培

25、養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基、高氏合成一號培養(yǎng)基、豆芽汁葡萄糖 培養(yǎng)基 （ 制平板和斜面,3. 無菌水或無菌生理鹽水配制生理鹽水.分裝于250mL錐形瓶中，每瓶裝 99mL（或95mL分離霉菌用），每瓶內(nèi)裝10粒玻璃珠；分裝試管，每管裝約4.5-5mL（不超過試管高度的 1/5）。4. 其他試劑與用品無菌培養(yǎng)皿、無菌移液管、無菌玻璃涂棒（刮刀） 、稱量紙、藥匙、洗耳球、 1 0酚溶液。 實(shí)驗(yàn)步驟 1 .稀釋分離法 平板分離菌有傾注法和涂布法兩種。 本次實(shí)驗(yàn)分離細(xì)菌、 放線菌、 霉菌 時采用傾注法,酵母菌分離采用涂布法：（1）細(xì)菌的分離 1）制備土壤稀釋液稱取土樣1 g，在火焰旁加入盛有 99mL并裝有玻

26、璃珠的無菌水或無菌生理鹽水錐形瓶中.振蕩10 一 20min，使土樣中菌體、芽孢或孢子均勻分散,制成 10-2 稀釋度的土壤稀釋液。然后按 10倍稀釋法進(jìn)行稀釋分離,以制備 10-2 稀釋度為例，具體操作過程如下：取4.5 mL無菌水試管6支，按10-210-7順序編號，放置在試管架上。取無菌移液管一支,從移液管包裝紙?zhí)字虚g撕口,將包裝紙?zhí)追殖缮?、下兩?去除下段包裝紙?zhí)?在移液管上端管口裝橡皮頭,取出下段移液管紙?zhí)追胖米烂? 以右手拇指、食指、中指拿住移液管卜端的橡皮頭,將吸液端口及移液管外部表面迅速通過 火焰 2 3 次,殺滅撕紙?zhí)讜r可能污染的雜菌, 切忌不要用手指去觸摸移液管吸液端口及外

27、部。 左手持錐形瓶底, 以右手掌及小指、 無名指夾住錐形瓶上棉塞, 在火焰旁拔出棉塞 （棉塞夾在 于上, 不能亂放在桌上 ） ,將 lmL 移液管的吸液端伸進(jìn)振蕩混勻的錐形瓶土壤懸液底部,用手指輕按橡皮頭,在錐形瓶內(nèi)反復(fù)吹吸二次 （吹吸時注意第二次液面要高于第一次吹吸的液面） ,然后準(zhǔn)確吸取 0.5mL10-2 土壤稀釋液, 右手將棉塞插回錐形瓶上, 左手放下錐形瓶, 換 持一支盛有 4.5mL 無菌水的試管, 依前法在火焰旁拔除試管帽 （或棉塞 ）,將 0.5m10-2 土壤稀 釋液注入 4.5m1 無菌水試管內(nèi),制成 l0-3 的土壤稀 釋液,將此移液管通過火焰再插入原來 包裝移液管的下段

28、紙?zhí)變?nèi), 以備再用。 另取一只未用過的無菌移液管在試管內(nèi)反復(fù)吹吸三次, 然后取出移液管,并將其通過火焰再插入原來包裝移液管的下段紙?zhí)變?nèi),以備再用。蓋上試 管帽。右手持 10-3 稀釋液試管在左手十敲打 2030次?；靹蛲寥老♂屢?。再從紙?zhí)兹〕鲈?來的移液管, 插入稀釋液已搖勻的試管內(nèi), 再吹吸三次, 然后準(zhǔn)確吸出 o.5mL 10-3 的稀釋液。 置第二支裝有 4.5 m1 無菌水試管,制成 10-4 ：土壤稀釋液。用同法再制成 10-5 、 10-6、 10一 7的土壤稀釋液 （為避免稀釋過程誤差,進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)時,最好每一個稀釋度更換一 支移液管 ）：最后用的移液管重新放人紙?zhí)變?nèi)。 待滅菌

29、后, 再洗刷或?qū)⒂眠^的移液管放在廢棄 物筒中.用3%-5%來蘇爾浸泡I h后再滅菌洗滌。2）傾注法分離取無菌培養(yǎng)皿6-9套,分別于培養(yǎng)皿底面按稀釋度編號。 稀釋完畢后， 用原來的移液管從菌液濃度最小的 10-7 土壤 稀釋液開始吸取1mL稀釋液，按無菌操作技術(shù)加到和應(yīng)編號的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。再依同方法分 別吸取 1mLl0-6 、10-5 的土壤稀釋液， 各加到和應(yīng)編號為 10-6、10-5 的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。 將已 滅菌的肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基融化， 待冷卻至 45-50 度左右， 分別傾入到已盛有 I0-5 、1 0-6 、 10-7 土壤稀釋液的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。注意：溫度過高易將菌燙死，且皿蓋上冷

30、凝水太多，會影 響分離效果；低于 45培養(yǎng)基易凝固，平板易出現(xiàn)凝塊、高低不平。傾倒培養(yǎng)基時注意無菌 操作，要在火焰旁進(jìn)行。左手拿培養(yǎng)皿，右手拿錐形瓶底部，左手同時用小指和手掌將棉塞 拔開， 灼燒瓶口 用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫， 至瓶口正好伸入， 傾入培養(yǎng)基約 12-15 mL，將培養(yǎng)皿在桌面上輕輕轉(zhuǎn)動，使稀釋的菌懸液與融化的瓊脂培養(yǎng)基混合均勻混勻后靜 置桌上，待凝。3）培養(yǎng)待平板完全冷凝后，將平扳倒置于35-37 C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2448h觀察結(jié)果。（2） 放線菌的分離1）制備土壤稀釋液稱取土樣I g，加入盛有99m1并裝有玻璃珠的無菌水或無菌生理鹽水錐形瓶中.并加人Io滴10%酚溶

31、液（抑制細(xì)菌生長，可用I %的重鉻酸鉀溶液代替 Io%酚溶 液效果更好）。振蕩后靜置5min,即成10-2 土壤稀釋液。2）傾注法分離 按前法將土壤稀釋液分別稀釋為10-3、10-4、10-5 三個稀釋度，然后用無菌移液管依次分別吸取 ImL 10-5、I0-4 、10-3 土壤稀釋液于對應(yīng)編號的無菌培養(yǎng)皿內(nèi),用 高氏合成 1 號培養(yǎng)基依前法傾倒平板,每個稀釋度做 23 個平行培養(yǎng)皿。理鹽水內(nèi),振蕩 20min,即成10-2的面曲稀釋液。若選用果園上樣，也依前法稱取土樣，制成10-2壤稀釋液。3）涂布法分離依前法向無菌培養(yǎng)皿中傾倒已融化并冷卻至45-50 C的豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基,待平板冷凝后,

32、 用無菌移液管分別吸取上述 I0-6 、I0-5 、10-4 三個稀釋度苗懸液 0.1mL, 依次滴加于對應(yīng)編號已制備好的豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基平板上。右手持無菌玻璃涂棒,左手拿 培養(yǎng)皿,并用拇指將皿蓋打開一縫,在火焰旁右手持玻璃涂棒于培養(yǎng)皿平板表面將菌液自平 板中央均勻向四周涂布擴(kuò)散,切忌用力過猛將菌液直接推向平板邊緣或?qū)⑴囵B(yǎng)基劃破。4）培養(yǎng) 接種后，將平板倒置于 30C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 23 d觀察結(jié)果。2 劃線分離法 菌種被其他雜苗污染時或混合菌懸液常用劃線法進(jìn)行純種分離。此法 將蘸有混合菌懸液的接種環(huán)在平板表面多方向連續(xù)劃線,使混雜的微生物細(xì)胞在平板表面分 散,經(jīng)培養(yǎng)得到分散成由單個微生

33、物細(xì)胞繁殖而成的菌落,從而達(dá)到純化目的。平板制作方 法如前所述。但劃線分離的培養(yǎng)基必須事先傾倒好,需充分冷凝待平板稍于后方可使用；為 便于劃線, 一般培養(yǎng)基不宜太薄, 每皿約傾倒 20mL 培養(yǎng)基, 培養(yǎng)基應(yīng)厚薄均勻, 平板表面光 滑。劃線分離主要有連續(xù)劃線法和分區(qū)劃線法兩種。（1） 連續(xù)劃線法 連續(xù)劃線法是從平板邊緣一點(diǎn)開始,連續(xù)作波浪式劃線直到平板的另一端為止,當(dāng)中不需灼燒接種環(huán)上的菌。 以無菌操作用接種環(huán)直接取平板上待分離純化的菌落。將菌種點(diǎn)種在平板邊緣一處,取出接 種,燒去多余菌體。將接種環(huán)再次通過稍打開皿蓋的縫隙伸人平板,在平板邊緣空白處接觸 一下使接種環(huán)冷卻然后從接種有菌的部位在平

34、板上自左向右輕輕劃線。劃線時平板面與接 種環(huán)面成 30 40°的角度, 以手腕力量在平板表面輕巧滑動劃線。 接種環(huán)不要嵌入培養(yǎng)基內(nèi) 劃破培養(yǎng)基, 線條要平行密集, 充分利用平板表面積, 注意勿使前后兩條線重疊。 劃線完畢, 關(guān)上皿蓋。 灼燒接種環(huán), 待冷卻后放置接種架上。 培養(yǎng)皿倒置于適溫的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) （以 免培養(yǎng)過程中皿蓋冷凝水滴下, 沖散巳分離的菌落 ） 。培養(yǎng)后在劃線甲板上觀察沿劃線處長出 的菌落形態(tài),涂片鏡檢為純種后再接種斜面。（2） 分區(qū)劃線法 平板分四區(qū),故又稱四分區(qū)劃線法。劃線時每次將平板轉(zhuǎn)動 60 一 70°劃線,每換一次角度,應(yīng)將接種環(huán)上的菌燒 死后,再在上次劃線末尾處繼續(xù)劃線。取菌、接種、培養(yǎng)方法與連續(xù)劃線法相似。分區(qū)劃線法劃線分離的平板分 4個區(qū),其中第四區(qū)是單菌落的主要分布區(qū),故其劃線面積應(yīng)最大。 為防止第四區(qū)內(nèi)劃線與 I、2、3 區(qū)線條和接觸,應(yīng)使 4 區(qū)線條與 I 區(qū)線條和平行,這樣區(qū)與區(qū)間線條夾角最好保持 120度左右。先將接種環(huán)沾取少量菌在平板1區(qū)劃35條平行線，取出接種環(huán)，左手關(guān)上皿蓋將平板轉(zhuǎn)動6070°,右手把接種環(huán)上多余苗體燒死，將燒紅的接種環(huán)在子板邊緣冷卻，再按以上方法