1、高級生物化學(xué)（生化分離與分析技術(shù)或生物化學(xué)研究技術(shù)）研究生的特點：“研究” 專一性、系統(tǒng)性。各學(xué)科研究的共性：機理的研究(物質(zhì)基礎(chǔ)蛋白質(zhì))，通過機理的研究，使研究者由 一葉障目 不見泰山 一葉知秋(蛋白質(zhì)種類與含量的變化)。恩格斯曾說:"生命是蛋白體的存在方式,這種存在方式本質(zhì)上就在于蛋白質(zhì)化學(xué)成分的不斷自我更新." 這就是說:沒有蛋白質(zhì)的存在,也就沒有生命。100多年前, 恩格斯提出“蛋白體” 是生命運動的物質(zhì)承擔(dān)者, 由此就產(chǎn)生了“生命是蛋白體的存在方式” 這一生命定義；恩格斯所指的蛋白體其實是以蛋白質(zhì)為主體的, 包括各種與代謝活動有關(guān)的生物分子的有機組合體。即生物體。

2、并不是現(xiàn)在的單純蛋白質(zhì)。本課程的主要內(nèi)容：沉淀技術(shù)、離心技術(shù)(常與沉淀技術(shù)結(jié)合使用)、層析（色譜）技術(shù)、電泳技術(shù)、免疫化學(xué)技術(shù)(與親和層析有重疊)、酶分析技術(shù)、同位素示蹤技術(shù)、蛋白質(zhì)與核酸的序列分析技術(shù)。以蛋白質(zhì)為主線（因為還有基因工程原理課）。生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究技術(shù)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究技術(shù)是研究生物大分子最基本、最重要的技術(shù)之一，是生命科學(xué)發(fā)展過程中必不可少的重要組成部分。生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究技術(shù)都是以生物大分子為研究對象，是目前在生物大分子水平上研究的最常用技術(shù)。生物化學(xué)研究技術(shù)是以蛋白質(zhì)研究技術(shù)為主，介紹一些相關(guān)生物化學(xué)技術(shù)如：光譜技術(shù)、色譜技術(shù)、蛋白質(zhì)電泳技術(shù)、蛋白質(zhì)測

3、序技術(shù)、超離心技術(shù)等。分子生物學(xué)研究技術(shù)是以核酸化學(xué)為主介紹一些相關(guān)的研究技術(shù)：如基因構(gòu)件、分子克隆、DNA測序、核酸電泳等技術(shù)。從基因工程或蛋白質(zhì)工程的角度說分子生物學(xué)研究技術(shù)稱之為基因工程上游技術(shù)，生物化學(xué)研究技術(shù)稱之為基因工程下游技術(shù)。前者具有一定的共性，后者具有一定的個性特點。但是從廣義上來說許多技術(shù)的原理都是相同的，只是在實際應(yīng)用中各有側(cè)重。生物工程下游技術(shù)：泛指從工程菌或工程細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化、質(zhì)量監(jiān)測所需要的一系列操作技術(shù)。其中產(chǎn)品的分離純化是最重要的部分。主要包括離心、沉淀、膜分離、色譜分離、電泳分離等。目標(biāo)產(chǎn)品蛋白質(zhì)的分析檢測：1. 蛋白質(zhì)的含量與純度；2.

4、 氨基酸分析（組成種類、排列順序）；3. 蛋白質(zhì)的分子量測定； 4. 等電點；5. 肽譜分析（結(jié)合裂解方法）；6. 蛋白質(zhì)的突變點分析(酶)； 7. 二硫鍵分析；8. 序列測定；9. 蛋白質(zhì)翻譯后修飾的分析。隨著蛋白質(zhì)組計劃的展開，下游技術(shù)顯得越來越重要，以致多數(shù)用人單位要求熟悉“色譜技術(shù)等下游技術(shù)”本課程采用討論式 歡迎大家提出問題、積極參與討論！參考書目1趙永芳編著，生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用，武漢大學(xué)出版社，1995年7月第二版2 （美）C.W.迪芬巴赫等著，黃培堂等譯，PCR技術(shù)實驗指南，科學(xué)出版社，1998年8月第一版，1999年4月第二次印刷3（美）F.奧斯伯等著，顏子穎等譯，精編分

5、子生物學(xué)實驗指南，科學(xué)出版社，1998年6月第一版4楊安鋼、毛積芳、藥立波主編，生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗技術(shù)，高等教育出版社，2001年2月第1版5. 陳毓荃主編，生物化學(xué)實驗方法和技術(shù)，科學(xué)出版社，2002年8月第一版學(xué)知識與應(yīng)用：不謀全局者，不足謀一域；不謀萬世者，不足謀一時。學(xué)習(xí)的動力：有人說求名計利：計利當(dāng)計天下利，求名應(yīng)求萬世名學(xué)習(xí)的態(tài)度：水惟善下方成海，山不矜高自極天待人：反觀自己難全是，細(xì)論人家未盡非對錢：事能知足心常愜，人到無求品自高煩惱：欲除煩惱須無我，歷盡艱難好做人交友：友如作畫須求淡，文似看山不喜平學(xué)習(xí)內(nèi)容：世事洞明皆學(xué)問，人情練達(dá)即文章做事：欲除天下不平事，方顯人間大丈

6、夫前序：要從生物體內(nèi)獲得某一組分進(jìn)行分析與研究，首先要確定取樣對象及其部位！一、取樣的原則1、 取樣的代表性：代表研究對象的本質(zhì)，從自然群體或待研究的群體中取樣；樣本量小于30份為小樣本，大于30則為大樣本；研究病例時，可能只有一個樣本，難于總結(jié)出規(guī)律(只能對癥醫(yī)治) 2、 部位：表現(xiàn)研究特征與本質(zhì)的部位，越精細(xì)越好，如：表現(xiàn)特征的部位，缺鋅的葉主脈兩側(cè)、缺鈣的根尖、莖尖等停長壞死。研究癌細(xì)胞就要從癌組織中取樣。細(xì)胞分化常常從某一個細(xì)胞或幾個細(xì)胞開始，所以取樣要精細(xì)，才能有針對性。二、提取與分離或制備樣品分子1. 生化分離分為分離分析與分離制備，分離分析即分離各組分，而進(jìn)行定量與定性鑒定，不一

7、定把某組分從混合物中分離提取出來，如，氨基酸的定性與定量分析。分離制備則是為獲得某一單純組分。并有活性或生理功能，這與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，所以，生化分離與化學(xué)分離不同，要保證其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不改變。有如下特點： 成分復(fù)雜且時刻在發(fā)生代謝變化。 有的含量很少，用材料多。如，激素、酶等。 離開活體易變性，所以條件要溫和，且低溫 使代謝減慢不變質(zhì)。 都在溶液中進(jìn)行，影響因素多，要重復(fù)性好，就必須嚴(yán)格規(guī)定材料、方法、條件與試劑等。 均一性鑒定需多種方法：層析、電泳、染料顯色、理化特性分析等。故生化分離與制備大都根據(jù)混合物中不同組分分配率的差別（順其自然，先試驗再總結(jié)規(guī)律，用于實踐），將它們分配于可用機械方法分離的

8、兩個或幾個物相中（如有機溶劑抽提油脂、鹽析、結(jié)晶等沉淀分離蛋白），或?qū)⒒旌衔镏糜谀骋晃锵嘀校ǘ嗍且合啵?，外加一定的作用力，使各組分分配于不同區(qū)域而分離（如電泳、超離心、超濾等）。先介紹溶劑提取、沉淀、膜分離、濃縮與干燥?，F(xiàn)代生化分離制備常用沉淀、離心、層析、電泳四大技術(shù)。第一節(jié) 溶劑提取法利用溶劑的溶解作用，從細(xì)胞中提取所需物質(zhì)，這里影響物質(zhì)溶解度即影響提取的因素主要有：1溶質(zhì)的性質(zhì)：如，DNA、RNA易溶于鹽溶液中【DNA提取緩沖液（500mM NaCl、100 mMTris·HCl、50mM EDTA）】，微溶于水，不溶于有機溶劑。蛋白質(zhì)中清蛋白：溶于水與稀鹽溶液；球蛋白不溶于水

9、，溶于稀鹽；谷蛋白可溶于稀酸稀堿，但不溶于水2溶劑的性質(zhì)，相似相溶原理（極性）。 酸、堿互溶機制：堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中，反之亦然；極性溶劑中，溶解極性物質(zhì)，溶劑的介電常數(shù)減小一些溶質(zhì)的溶解度就減小?？赏ㄟ^丙酮等沉淀一些蛋白。3離子強度：I=1/2CZ2 （Z：離子價數(shù)，C：離子的摩爾濃度）高鹽中DNA溶解度大，低離子強度下RNA溶解度大，0.14mol/LNaCl 中可溶出RNA而沉淀DNA(一般以2mol/L氯化鈉溶解)。蛋白質(zhì)在稀鹽中，比水中溶解度大，稱為鹽溶效應(yīng)，此乃少量離子的活動，減少了蛋白質(zhì)分子極性基團之間的靜電引力，加強了蛋白質(zhì)與溶劑間的相互作用之故。低鹽還可穩(wěn)定一些物質(zhì)的生理

10、活性，所以生化物質(zhì)多用之提取。4pH：溶劑的pH值影響溶質(zhì)的解離狀態(tài)，離子態(tài)易溶于水，分子態(tài)則易溶于有機溶劑，酸性物質(zhì)在低pH下或堿性物質(zhì)在高pH下均可轉(zhuǎn)溶于有機溶劑，兩性物質(zhì)在等電點之外，均成離子態(tài)，所以AA一般不用有機溶劑提取。Pr、酶等還要考慮pH對其活性的影響，一般控制在pH68左右，避免過酸、過堿。5溫度：高溫時溶解度增大，但易變性，絕大多數(shù)生物大分子，提取溫度選在010，避免變性。6去夠劑（雙親物質(zhì)）：具有乳化、分散和增溶作用；有陰、陽離子和中性去垢劑等多種類型，中性去垢劑有Tween20、40、60、80（聚氧乙烯（20）山梨醇酐單油酸酯），Triton X-100（非離子型系列

11、去污劑的商品名 為聚乙二醇辛基苯基醚）等，對蛋白質(zhì)和酶的變性影響較小，宜用于蛋白質(zhì)與酶的提取，常用的陰離子去垢劑SDS(十二烷基硫酸鈉)可促進(jìn)核蛋白的解體（使蛋白變性），釋放出核酸，并抑制核酸酶，所以，常用于核酸的提取。 提取酶等的新鮮材料的儲存：保鮮的最佳方法是冷凍貯藏：冰壺、冰袋、冰箱、冷藏庫等。組織細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的提?。航M織細(xì)胞的破碎： 研磨法：研缽等需預(yù)冷，磨料石英沙等要洗凈消毒（幼嫩組織可不加）；以預(yù)冷的水或緩沖液抽提。滲透壓法：動植物組織在04下，用20%蔗糖的緩沖液處理12h而后轉(zhuǎn)入無蔗糖的水或緩沖液內(nèi)，使細(xì)胞破裂。突然吸水脹破！多用于動物細(xì)胞和幼嫩的植物細(xì)胞（成熟的壁厚不易破）自

12、溶法：自溶法是在一定的pH和適當(dāng)?shù)臏囟认?利用組織細(xì)胞內(nèi)自身的酶系統(tǒng)將細(xì)胞破碎的方法.自溶法所需時間較長,常添加少量防腐劑如甲苯,氯仿等防止細(xì)菌的污染.酶解法：以溶菌酶（破壞糖苷鍵，屬單純蛋白質(zhì)）破壁，多與EDTA（抑制其他酶）結(jié)合使用。如細(xì)菌DNA提取，加EDTA可抑制核酸酶活性。凍融法：-20下凍結(jié)，讓冰晶（4時體積最?。┢茐募?xì)胞（可先吸水）。并可保持酶活性。如動物酶的提取。超聲波法：超聲波的空化作用，使不同部位產(chǎn)生壓力差，迫使細(xì)胞破碎，此法適于懸浮樣品。超聲波破碎作用基本原理：超聲波在媒質(zhì)中傳播可使媒質(zhì)質(zhì)點在其傳播空間內(nèi)進(jìn)入振動狀態(tài)強化溶質(zhì)擴散，即超聲波機械機制。超聲波在媒質(zhì)質(zhì)點傳播過程

13、中其能量不斷被媒質(zhì)質(zhì)點吸收變成熱能，導(dǎo)致媒質(zhì)質(zhì)點溫度升高，即超聲波熱學(xué)機制。同時當(dāng)大能量的超聲波作用于提取介質(zhì)，在振動處于稀疏狀態(tài)時，介質(zhì)被撕裂成許多小空穴（氣泡，空化是液體內(nèi)局部壓力降低時，液體內(nèi)部或液固交界面上蒸氣或氣體的空穴（空泡）的形成、發(fā)展和潰滅的過程），這些小空穴瞬時即閉合，閉合時產(chǎn)生高達(dá)幾千大氣壓的瞬時壓力，即空化現(xiàn)象。超聲法輸入高能超聲波可以破碎細(xì)胞，其機理與超聲波作用溶液時的氣泡產(chǎn)生、長大和破碎的空化現(xiàn)象有關(guān)。空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力使細(xì)胞裂解。超聲波破碎的效率取決于聲頻、聲能、處理時間、細(xì)胞濃度及細(xì)胞類型等。超聲波破碎在處理少量樣品時操作簡便,效率高,液量損失少,適于實

14、驗室使用。但應(yīng)注意的是超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團能使敏感的活性物質(zhì)變性失活,另外噪聲比較大。勻漿器法：使細(xì)胞在高壓摩擦下破裂或通過微孔而被擠破。經(jīng)過以上步驟將細(xì)胞中的組分集中溶在溶劑中。如何分離？第二節(jié) 沉淀法（分離）用于濃縮、純化、利于保存方法有：鹽析沉淀法、有機溶劑沉淀法、等電點沉淀法、非離子多聚體沉淀法、生成鹽復(fù)合物沉淀法、加熱及酸堿變性沉淀法和專一性沉淀法。1鹽析法：鹽溶與鹽析蛋白質(zhì)膠體只在某一特定的低鹽濃度下溶解度最大，少量離子可減少蛋白質(zhì)分子極性基團之間的靜電引力，加強蛋白質(zhì)與溶劑之間的作用力（同時減弱蛋白質(zhì)分子間的引力）鹽溶；但鹽濃度增大到一定程度時，會破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜、并中

15、和掉其表面的電荷，進(jìn)而使蛋白質(zhì)分子之間相互聚集而沉淀鹽析。所以可用鹽沉淀。影響蛋白質(zhì)鹽析的因素：蛋白質(zhì)濃度：太濃易出現(xiàn)共沉淀，太稀時鹽的消耗量太大，蛋白質(zhì)回收率也低。以2.53.0%較好（含量測定）。蛋白質(zhì)制備前期，保持一定的pH和溫度而改變鹽濃度，后期分離純化，則保持一定的鹽濃度而改變pH和溫度（微調(diào)）。離子強度與類型：各離子與蛋白質(zhì)分子間爭奪水分子，破壞其水和膜，使蛋白質(zhì)溶解度減小而沉淀，離子濃度越大，越易鹽析沉淀。不同蛋白質(zhì)所需的離子強度不同，所以可分步鹽析。離子半徑越小，價數(shù)越高的離子（吸水能力強）鹽析作用越強，所以，不同離子沉淀能力不同。pH：影響蛋白質(zhì)所帶電荷，蛋白質(zhì)所帶靜電荷越多

16、，溶解度越大，等電點時溶解度最小。所以鹽析時可調(diào)節(jié)pH到pI(左右)。溫度：要求不嚴(yán)格，一般用低溫，可防止蛋白質(zhì)變性而喪失生理活性。同時，低溫時多數(shù)蛋白的溶解度低；不需活性的可用熱變性沉淀。 如，硫酸銨鹽析法：各種中性鹽均可，但硫酸銨價格便宜，溶解度大，且其溶解度受溫度變化影響小，但因含氮，對蛋白質(zhì)分析有影響(弊)。用時要注意：1. 保證純度，可重結(jié)晶后再用(去除重金屬離子)，其溶液成酸性，要用氨水(不要用NaOH)或H2SO4(不用HCl)調(diào)成所需的pH。（防氨蒸發(fā)和Cl離子污染）2. 硫酸銨的飽和度及其調(diào)整法：飽和狀態(tài)時的飽和度為100%，不同飽和度的調(diào)整：通常硫酸銨的添加以百分飽和度來表

17、示 (不是濃度百分比)，例如大部分蛋白質(zhì)可在 80% 硫酸銨飽和度下沉淀。 因為硫酸銨加入的體積很大，會改變最后的體積，很難由濃度百分比來計算，因此使用百分飽和度作為沉淀蛋白質(zhì)的度量。 加入固體鹽法：要求飽和度高又不增大溶液體積時用(樣品少時)。要磨細(xì)，在攪拌下、緩慢加入，各種分離分析技術(shù)工具書中均有附表，可按此加入。硫酸銨的飽和度亦可直接加入固體硫酸銨調(diào)節(jié)，其加入量可按下式計算：x=G(S2-S1)/(1-AS2) 其由來：x+1*S1G = (1+xB)*S2G = S2G+ S2GxB令B*G=A則x+S1G = S2G+A S2x x(1-AS2) = S2G-S1G x=G(S2-S

18、1)/(1-AS2) 式中X是將1升飽和度為S1的溶液提高到飽和度為S2時所需硫酸銨的重量（g），G（由飽和度轉(zhuǎn)化為重量的系數(shù) 均值）及A（B為將重量x換算為體積的常數(shù)）為常數(shù)，與溫度有關(guān)。G在0時為488.34，20時為533；A在0時為0.356，20時為0.29。G在25時為541，A在25時應(yīng)為0.31. 調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表（ 25 ）硫酸銨終濃度 ,%飽和度 （25）10 20 25 30 33 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 90 100 每 1升溶液加固體硫酸銨的克數(shù) 硫 酸銨 初 濃 度 ， % 飽和 度 0 56 114 144 176 1

19、96 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 662 767 10 57 86 118 137 150 183 216 251 288 326 365 406 449 494 592 694 20 29 59 78 91 123 155 190 225 262 300 340 382 424 520 619 25 30 49 61 93 125 158 193 230 267 307 348 390 485 583 30 19 30 62 94 127 162 198 235 273 314 356 449 546 33 12 43 74 107 142

20、 177 214 252 292 333 426 522 35 31 63 94 129 164 200 238 178 319 411 506 40 31 63 97 132 168 205 245 285 375 469 45 32 65 99 134 171 210 250 339 431 50 33 66 101 137 176 214 302 392 55 33 67 103 141 179 264 353 60 34 69 105 143 227 314 65 34 70 107 190 275 70 35 72 153 237 75 36 115 198 80 77 157 90

21、 79 指在 25 下，硫酸銨溶液由初濃度調(diào)到終濃度時，每升溶液所加固體硫酸銨的克數(shù)。2. 調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表（ 0 ）在 0 硫酸銨終濃度 ,% 飽和度 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 每 100毫升溶液加固體硫酸銨的克數(shù) 硫 酸銨 初 濃 度 ， % 飽和 度 0 10.6 13.4 16.4 19.4 22.6 25.8 29.1 32.6 36.1 39.8 43.6 47.6 51.6 55.9 60.3 65.0 69.7 5 7.9 10.8 13.7 16.6 19.7 22.9 26.2 29.6

22、 33.1 36.8 40.5 44.4 48.4 52.6 57.0 61.5 66.2 10 5.3 8.1 10.9 13.9 16.9 20.0 23.3 26.6 30.1 33.7 37.4 41.2 45.2 49.3 53.6 58.1 62.7 15 2.6 5.4 8.2 11.1 14.1 17.2 20.4 23.7 27.1 30.6 .4.3 38.1 42.0 46.0 50.3 54.7 59.2 20 0 2.7 5.5 8.3 11.3 14.3 17.5 20.7 24.1 27.6 31.2 34.9 38.7 42.7 46.9 51.2 55.7 2

23、5 0 2.7 5.6 8.4 11.5 14.6 17.9 21.1 24.2 28.0 31.7 35.5 39.5 43.6 47.8 52.2 30 0 2.8 5.6 8.6 11.7 14.8 18.1 21.4 24.9 28.5 32.3 36.2 40.2 44.5 48.8 35 0 2.8 5.7 8.7 11.8 15.1 18.4 21.8 25.4 29.1 32.9 36.9 41.0 45.3 40 0 2.9 5.8 8.9 12.0 15.3 18.7 22.2 25.8 29.6 33.5 37.6 41.8 45 0 2.9 5.9 9.0 12.3 1

24、5.6 19.0 22.6 26.3 30.2 34.2 38.3 50 0 3.0 6.0 9.2 12.5 15.9 19.4 23.0 26.8 30.8 34.8 55 0 3.0 6.1 9.3 12.7 16.1 19.7 23.5 27.3 31.3 60 0 3.1 6.2 9.5 12.9 16.4 20.1 23.1 27.9 65 0 3.1 6.3 9.7 13.2 16.8 20.5 34.4 70 0 3.2 6.5 9.9 13.4 17.1 20.9 75 0 3.2 6.6 10.1 13.7 17.4 80 0 3.3 6.7 10.3 13.9 85 0

25、3.4 6.8 10.5 90 0 3.4 7.0 95 0 3.5 100 0 指在 0 下，硫酸銨溶液由初濃度調(diào)到終濃度時，每 100 毫升溶液所加固體硫酸銨的克數(shù)。 加入飽和溶液法:V=V0(S2-S1)/(1-S2) S1、2分別為調(diào)整前后的飽和度因為：V0×S1V×1=(V0+V)*S2 V0*S2+V*S2= V0×S1V×1 V×1- V*S2= V0*S2-V0*S1 V=V0(S2-S1)/(1-S2) 透析平衡法：將待透析的樣品溶液裝入透析袋中，浸入飽和硫酸銨溶液中進(jìn)行透析(反向)，使外部的硫酸銨靠擴散作用不斷進(jìn)入透析袋中，

26、逐步達(dá)到所需的鹽析飽和度，使蛋白質(zhì)沉淀，此時停止透析。因硫酸銨濃度變化是連續(xù)的，所以鹽析效果較好，多用于蛋白質(zhì)的結(jié)晶。注意問題：1.加入硫酸銨（固液）時要在攪拌中緩慢加入，以免局部濃度過高造成共沉淀影響分離。分不開各段都有。研究時盡量不用，而用加入飽和溶液的方法。2.要保證鹽析條件的穩(wěn)定性，如pH、溫度及硫酸銨的純度等。摸索條件，以后備用，也作為蛋白的一個特性。3.鹽析后要放置0.5-1小時，待沉淀完全后再分離(沉淀需要過程)（離心或過濾），以免影響回收率。4.分離沉淀時，低濃度硫酸銨溶液用離心分離，高濃度時則用過濾，因為此時需要較高的離心速度與時間，所以不如過濾快。如：超氧化物歧化酶(SOD

27、)的分段分離 蚯蚓SOD主要在70-80%硫酸銨飽和液的沉淀中。雜質(zhì)中有共沉淀的SOD.測定及純化需透析除鹽。二、有機溶劑沉淀法降低溶液的介電常數(shù)（束縛電荷的能力），增加溶質(zhì)分子間的相互作用，使溶解度減小，同時還有破壞溶質(zhì)分子表面水化膜的作用，使大分子溶質(zhì)脫水而相互集聚析出。V=V0(S2-S1)/(S3-S2) S3：表示需要加入的有機溶劑的濃度。S1、S2分別表示原濃度和所要達(dá)到的濃度。有機溶劑沉淀法比鹽析法分辨能力高，且不用脫鹽，易于過濾；但易引起生物大分子變性，常需在低溫下操作。最常用的是乙醇、丙酮等。樣品濃度要適宜，過濃易引起共沉淀(近飽和時)和溶質(zhì)變性，過稀回收率低；此外，pH值、

28、離子強度與種類也應(yīng)使溶質(zhì)的溶解度最低才好。三、等電點沉淀法：在等電點時，兩性電解質(zhì)的凈電荷為零，這樣的物質(zhì)分子在溶液中因為沒有相同電荷而相互排斥的影響，極易借靜電引力迅速結(jié)合成較大的聚集體，而沉淀析出，所以這時最不穩(wěn)定，溶解度最小。不同的兩性電解質(zhì)因pI不同，故可用之分離，如氨基酸、蛋白質(zhì)（酪蛋白）、核苷酸等，常與鹽析、有機溶劑沉淀等一起使用，提高沉淀效果。四、非離子多聚物沉淀法： 如PEG(聚乙二醇)、葡聚糖、右旋糖酐硫酸鈉(右旋糖酐 系葡萄糖組成的多糖, 右旋糖酐硫酸鈉是帶有電荷的葡聚多糖)、聚丙烯酰胺干凝膠等，通過空間位置排斥使溶液中的溶質(zhì)顆粒被擠在一起而引起沉淀，此法不易引起生物大分子

29、變性，同時沉淀效能高，沉淀后多聚物易于除去，所以多用于核酸、蛋白質(zhì)及酶的沉淀分離，有兩種操作方法：1.用兩種非離子多聚物，組成液液兩相系統(tǒng)(互不相溶的)，使生物大分子在兩相中不等量分配而分離，如可用葡聚糖和聚乙二醇為兩相系統(tǒng)分離單鏈DNA、雙鏈DNA和多種RNA制劑；在20世紀(jì)六十年代，聚乙二醇開始用于蛋白質(zhì)純化，其分子量多在2000-6000之間變化，多數(shù)認(rèn)為PEG6000沉淀蛋白較好。右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物也常用于蛋白質(zhì)沉淀中。2.用一種非離子多聚物，構(gòu)成液相系統(tǒng)，使生物大分子在其中因被排斥而積聚沉淀（用不同濃度）。多用后者。五、其它沉淀法：表面活性劑變性、有機溶劑變性、熱變

30、性、酸、堿變性沉淀法等。如，蛋白尿的鑒定。第三節(jié) 膜分離技術(shù)（人為的）用一定孔徑的分離膜用于生物大分子的脫鹽、濃縮與提純，主要根據(jù)各種溶質(zhì)分子的大小、形狀及性質(zhì)的差異，對于不同孔徑的濾膜有不同的通透性，濾膜有選擇性的讓小分子通過，而擋住大分子(象篩子)；分子透過膜的動力有：簡單擴散、膜兩側(cè)的流體壓力差或電壓差，由此衍生出透析、超濾、反滲透、電滲析(膜分離技術(shù)之一，直流電只提供動力)等。一、透析：1.原理：根據(jù)溶質(zhì)分子的大小利用膜兩側(cè)存在的小分子濃度差進(jìn)行分離。2.影響因素：膜的通透性即膜孔徑的大小，能阻礙大分子擴散時，孔徑越大透析越快。要選透析外液的更換速度：因透析過程中小分子不斷向外擴散逐漸

31、達(dá)到平衡。所以不斷更換透析外液或?qū)α魉肝觯跃S持膜兩側(cè)的濃度差，可加快透析速度。 溫度：溫度高可使溶液黏度下降分子運動加快，故可提高透析速度。但易使生物大分子變性，所以一般在低溫下進(jìn)行。壓力：增加膜兩側(cè)的壓差，可加快透析速度。如將透析袋放在真空系統(tǒng)中，不斷提高真空系統(tǒng)的真空度（減壓），亦可加壓過濾（微孔過濾、超濾和反滲透）。溶劑：蒸餾水?dāng)U散速度最快，分子又小，易進(jìn)入透析袋內(nèi)，使透析溶液濃度下降，所以常將透析袋裝滿，另外，在純水中透析易出現(xiàn)杜南平衡（蛋白質(zhì)帶電荷吸附反離子，使膜內(nèi)、外溶液pH升高或降低可擴散離子亦出現(xiàn)濃度不平衡，只是電荷平衡），引起生物大分子變性。故一般對緩沖溶液進(jìn)行透析。如：

32、血液透析（人工腎）所用的膜：有纖維素膜、纖維素衍生膜和合成膜三種。  纖維素膜是將天然纖維溶解、再生后制成再生纖維素和纖維素衍生物。 纖維素衍生膜有醋酸纖維素膜、血仿膜。  合成膜是高分子聚合物,生物相容性好,常用的有聚丙烯氰膜(PAN)、聚甲基丙烯酸甲酯膜(PMMA)、乙烯基乙烯醇共聚膜(E-,VAL)、聚砜膜(PS)、聚酰胺膜(PA)、聚酯聚合物合金膜,(PEPA)。  血液透析所使用的半透膜厚度為1020微米，膜上的孔徑平均為3納米，所以只允許分子量為1.5萬以下的小分子和部分中等大小的分子通過，而分子量大于3.5萬的大分子物質(zhì)

33、不能通過。因此，蛋白質(zhì)、致熱源、病毒、細(xì)菌以及血細(xì)胞等都是不可透出的；尿的成分中大部分是水，要想用人工腎替代腎臟就必須從血液中排出大量的水分，人工腎只能利用滲透壓和超濾壓來達(dá)到清除過多的水分之目的?，F(xiàn)在所使用的人工腎即血液透析裝置都具備上述這些功能，從而對血液的質(zhì)和量進(jìn)行調(diào)節(jié)，使之近于生理狀態(tài)。血液透析的透析液從生理學(xué)考慮, 需要有以下幾個功能能維護(hù)恒定的溶質(zhì)清除率; 補充患者缺乏的物質(zhì)(如鈣離子、氨基酸、營養(yǎng)物質(zhì)); 能糾正酸中毒pH為生理性。因透析液具備調(diào)節(jié)體液的水-電解質(zhì)平衡等作用 透析液處方的基本要求： 電解質(zhì)的組成和濃度與正常血漿相近; 滲透壓一般不低于血漿滲透壓; 根據(jù)病情適當(dāng)?shù)丶?/p>

34、入藥物，如抗生素、肝素等。 故血液透析的透析液最接近于血漿，才能形成平衡作用3.透析袋的處理與保存處理：為了去掉膜上可能帶有的金屬離子，防止大分子失活，一般將透析袋在堿性EDTA溶液（Na2CO3 10g/L、EDTA 1mmol/L）中煮沸30分鐘，然后用蒸餾水洗凈。(堿性使EDTA帶負(fù)電螯合能力增大)保存：用過的透析袋最好浸泡在含有微量苯甲酸鈉（抑菌劑）的溶液里，以防長霉。二、超濾：是加壓膜分離技術(shù)，分離原理似過濾；一般以氮氣加壓或在超濾液另一側(cè)抽氣產(chǎn)生負(fù)壓（抽濾），按所加操作壓及所用濾膜的孔徑的不同，可分為微孔過濾、超濾和反滲透三種。超濾均在密閉容器中進(jìn)行。微孔過濾：所用操作壓在5磅/平

35、方英寸以下（合0.35大氣壓以下），膜孔徑為500埃至14微米。1磅/平方英寸0.07kg/cm2(即大氣壓)=6894.8Pa；1atm=100000Pa。超濾：所用操作壓在5100磅/平方英寸（合0.357大氣壓），膜孔徑為10至100埃。反滲透：用于分離小分子物質(zhì)，所用操作壓在5002000磅/平方英寸（合35140.6大氣壓），膜孔徑在10埃以下。如，現(xiàn)代的海水淡化主要用之分離水和其中溶解的離子。即反滲透所用操作壓應(yīng)在35個大氣壓以上?。ㄅc滲透水流方向正好相反，通過加壓）常用的反滲透膜有三種：醋酸纖維素膜，芳香聚酰胺膜（似尼龍）和復(fù)合膜。反滲透膜幾乎可以適應(yīng)任何進(jìn)水水質(zhì)，但其對進(jìn)水處理

36、要求很嚴(yán)格，要求進(jìn)水的主要水質(zhì)指標(biāo)為污染指數(shù)，其值應(yīng)小于5。第五節(jié) 濃縮與干燥一、濃縮：除去水或溶劑，蒸發(fā)、離子交換吸附(溶質(zhì))、沉淀、萃取、親和層析等均可，這里只介紹吸收濃縮與膜濃縮： 吸收濃縮：加入吸收劑從溶液中吸收水或溶劑，吸收劑應(yīng)具有不與溶液反應(yīng)、不吸附溶質(zhì)、易與溶質(zhì)分離，除去溶劑后可重新利用等特性，常用的有：聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺干凝膠等（非離子多聚物）。通過空間位置排斥，濃縮前后pH無變化。 膜濃縮： 低滲透析：在多聚物的低滲溶液中進(jìn)行透析（分離物放于纖維素膜制成的透析袋中），水或溶劑透出被多聚物吸收，常用的吸收多聚物有：聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇及葡聚糖

37、等（吸收劑可對分離物吸附時加膜），缺點是多聚物中有雜質(zhì)時易污染。 其他膜濃縮：減壓透析、離心（超濾離心管）、加壓超濾等均可。二、干燥：除盡水或溶劑的過程，在生化研究中，最重要的干燥方法是真空干燥與冰凍干燥。 真空干燥：即減壓干燥，有利于保持活性。 冰凍干燥：將溶液冷凍成固體然后在低溫、低壓下使之升華留下干物質(zhì)。制取物成粉末狀，極易溶于水，用途較廣。冷凍干燥機分離技術(shù)領(lǐng)域：新型生化分離技術(shù)    研究內(nèi)容：    1、超臨界CO2分離技術(shù)的應(yīng)用    2、膜分離、親和色譜等新型

38、分離技術(shù)在天然產(chǎn)物有效成分的提取與分離、生物技術(shù)產(chǎn)品的純化分離中的應(yīng)用 超臨界CO2萃取技術(shù)、分子蒸餾技術(shù)、超重力場技術(shù)是目前國際上較新的三大提取分離技術(shù)、采用這些技術(shù)對中藥進(jìn)行提取分離純化，對實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化具有重要意義。超臨界流體（Supercritical Fluid,簡稱SF或SCF）是指超臨界溫度（Tc）和臨界壓力（Pc）狀態(tài)下的高密度流體。超臨界流體具有氣體和液體的雙重特性，其粘度與氣體相似，但擴散系數(shù)比液體大得多，其密度和液體相近。超臨界流體對物質(zhì)進(jìn)行溶解和分離的過程就叫超臨界流體萃?。⊿upercritical Fluid Extracti

39、on,簡稱SFE）。其基本原理為：CO2的臨界溫度（Tc）和臨界壓力（Pc）分別為31.05和7.38MPa，當(dāng)處于這個臨界點以上時，此時的CO2同時具有氣體和液體雙重特性。它既近似于氣體，粘度與氣體相近；又近似于液體，密度與液體相近（密度大粘度?。鋽U散系數(shù)卻比液體大得多。是一個優(yōu)良的溶劑，能通過分子間的相互作用和擴散作用將許多物質(zhì)溶解。同時，在稍高于臨界點的區(qū)域內(nèi)，壓力稍有變化，即引起其密度的很大變化，從而引起溶解度的較大變化。因此，超臨界CO2可以從基體中將物質(zhì)溶解出來，形成超臨界CO2負(fù)載相，然后降低載氣的壓力或升高溫度，超臨界CO2的溶解度降低，這些物質(zhì)就沉淀出來（解析）與CO2

40、分離，從而達(dá)到提取分離的目的。不同的物質(zhì)由于在CO2中的溶解度不同或同一物質(zhì)在不同的壓力和溫度下溶解狀況不同，使這種提取分離過程具有較高的選擇性。通過摸索不同溫度和壓力下不同物質(zhì)在超臨界CO2中的溶解度，可用此方法提取之！分子蒸餾技術(shù) 分子蒸餾是一種特殊的液-液分離技術(shù)，它不同于通常的沸騰過程，更確切地的說，它應(yīng)稱為"分子蒸發(fā)".在二十世紀(jì)六七十年代，發(fā)達(dá)國家已經(jīng)將分子蒸餾技術(shù)成功地應(yīng)用于天然產(chǎn)物分離領(lǐng)域。分子蒸餾過程是在高真空條件下（系統(tǒng)壓力只有0.1Pa）進(jìn)行的連續(xù)分離過程，它不僅利用混合物組分之間的相對揮發(fā)度，還充分利用組分之間分子量的差異，因此其分離能力比常規(guī)的蒸餾

41、和精餾有顯著的提高，可以對一些常規(guī)分離技術(shù)難以實現(xiàn)的分離物系進(jìn)行分離。分子蒸餾過程對產(chǎn)品的收集采用不同的冷卻系統(tǒng)，最后一級是采用液氮深冷，因此對沸點較低組分的損失可以減小到最低程度。 分子蒸餾技術(shù)是天然產(chǎn)物提取、純化的先進(jìn)共性關(guān)鍵技術(shù)，可用于中藥原料生產(chǎn)過程的提取和純化。分子蒸餾是一種特殊的液-液分離技術(shù)，它不同于傳統(tǒng)蒸餾依靠沸點差分離原理，而是靠不同物質(zhì)分子運動平均自由程的差別實現(xiàn)分離。當(dāng)液體混合物沿加熱板流動并被加熱，輕、重分子會逸出液面而進(jìn)入氣相，由于輕、重分子的自由程不同，因此，不同物質(zhì)的分子從液面逸出后移動距離不同，若能恰當(dāng)?shù)卦O(shè)置一塊冷凝板，則輕分子達(dá)到冷凝板被冷凝排出，而重分子達(dá)不

42、到冷凝板沿混合液排出。這樣，達(dá)到物質(zhì)分離的目的。它已在化工、輕工、制藥（西藥） 領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，并且受到廣泛重視和應(yīng)用。分子蒸餾在中藥原料分離過程具有其它傳統(tǒng)分離方法難以達(dá)到的優(yōu)勢：分離效率高、分離溫度低，對熱敏性物料的損失可以降到最低程度；同時分離過程不需要任何有機溶劑，是綠色分離工藝。超重力作用就是離心力場的作用，在強大的離心力場中物質(zhì)的相對運動加快，不同物相的反應(yīng)加快（強化）第二章 離心 離心是最重要的分離技術(shù)之一，是完全的物理方法分離技術(shù)，它既不使樣品受到污染，也不易使樣品變性，所以是一種較為理想的分離方法。第一節(jié) 離心技術(shù)的基本原理與設(shè)備一、沉降原理懸浮液中的顆粒在重力場中的沉降速

43、度，受沉降過程中的摩擦力F1與浮力F2（等于重力）的雙重作用， F1=6rpdr/dt （即受到的阻力） F2=(p -m)V*g （重力）（衣塔）:介質(zhì)的黏度 rp ：顆粒半徑 dr/dt：沉降速率 p ，m：分別是顆粒和介質(zhì)的密度 V：顆粒體積g:重力加速度（不同場所有別）當(dāng)顆粒勻速沉降時，F(xiàn)1=F2，即6rpdr/dt= (p -m)V*g 球形顆粒的體積V=4/3·rp3 6rpdr/dt=4/3·rp3(p -m)g dr/dt=2rp2(p -m)g/9當(dāng)沉降是在強大的離心力場中進(jìn)行時，顆粒沉降的離心加速度2r比重力加速度g大得多，此時沉降速度(由離心加速度2r

44、的方向和大小所決定)：即dr/dt=2 rp2(p -m)2r /9，當(dāng)顆粒與介質(zhì)的性質(zhì)確定之后，沉降速度主要取決于離心加速度2r的大小，即與離心機轉(zhuǎn)速和顆粒離轉(zhuǎn)軸中心的距離有關(guān)。一般以相對離心力（與所受重力的比值）表示顆粒在離心力場中所受到的離心力：RCF= F離/F重=2r/g (因為F離=2rm ；F重=mg)。角速度不便測量，它與離心機每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)(rpm)有如下關(guān)系： = 2rpm/60=rpm/30（弧度/秒）所以:RCF=(rpm/30)2r/g=2rpm2r/900g=1.119×10-5rpm2r（因為g=9.8m/s2=980cm/s2）（=3.14159，2/90

45、0g=1.119×10-5）RCF的大小以重力加速度g的倍數(shù)表示。所以知道了離心機的每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)和轉(zhuǎn)頭半徑即可計算相對離心力（RCF）。也可由RCF和r求出所需rpm。離心機轉(zhuǎn)頭說明書上一般標(biāo)明半徑大小（最大r與最小r），不予說明時一般指平均離心力。只說明每分轉(zhuǎn)數(shù)是不明確的，RCF=1,r=10cm時，rpm=94.5轉(zhuǎn)/分，即離心半徑為10厘米，每分鐘94.5轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速所產(chǎn)生的離心力即相當(dāng)于物體受到的重力。討論： 顆粒勻速沉降只是假設(shè) 無法保證離心力與阻力相等，因為受到離心力的作用，應(yīng)進(jìn)行勻加速運動， 物體受到一定的力作用，將進(jìn)行勻加速運動，物體受到外力作用時，會改變物體的運動狀態(tài)，產(chǎn)

46、生加速度，只有不受外力作用時，靜止的物體則會一直靜止，運動的物體，則會做勻速直線運動。 實際遠(yuǎn)比這要復(fù)雜！肯定產(chǎn)生加速度的。只是簡化研究而已。二、沉降系數(shù)S沉降速度與離心力場成正比，這一比例常數(shù)就是沉降系數(shù)Sdr/dt=2 rp2(p -m)g/9：重力作用下的自然沉降 離心時顆粒、介質(zhì)均固定為常量，沉降速度只與2r有關(guān)，故可寫成：dr/dt=S*2r S= dr/dt/2r是單位離心加速度下的沉降速度，稱為沉降系數(shù)。單位應(yīng)為秒(根據(jù)概念為cm.s-1/cm.s-2=s,因為離心加速度一般很大，所得值很小，所以一般以10-13秒為單位，稱斯維伯格單位)。1S=10-13秒 可用來描述生物大分子

47、，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的大小，如16SRNA、28SRNA、80S核糖體等（同密度下，顆粒越大，沉降速度越快），測定如下：S=ln（r2/r1）/2*（t2-t1）=2.303*lg（r2/r1）/2*（t2-t1） =2*rpm/60 =2.1*100* lg（r2/r1）/（rpm）2*（t2-t1） 得到的單位是秒。注：t2-t1是消逝時間（秒）r1，r2是離心起始和終了時顆粒與轉(zhuǎn)軸中心的距離rpm是每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)亦可根據(jù)S=dr/dt/2r 直接用分析型超速離心機測定(因為dr/dt可測知，按平均速度計；r用離心過的平均半徑，2r離心機及轉(zhuǎn)子可提供)。三、離心設(shè)備1. 離心機按轉(zhuǎn)速高低可分為三種類型

48、： 低速離心機2000-6000rpm，最大離心力為6000g。一般只有驅(qū)動和速度控制系統(tǒng)。 高速離心機10000-25000rpm，最大離心力達(dá)60000g。一般備有冷卻裝置，有的還有真空系統(tǒng)。一般配有角度轉(zhuǎn)頭、水平轉(zhuǎn)頭、垂直轉(zhuǎn)頭等。超速離心機轉(zhuǎn)速在40000轉(zhuǎn)/分鐘以上，最大離心力可達(dá)600000g?？煞譃榉治鲂汀⒅苽湫秃头治鲋苽湫?。分離主要用制備型的。超速離心機主要有三大系統(tǒng)：驅(qū)動和速度控制系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)和真空系統(tǒng)。一般都配有多種不同容量和性能的轉(zhuǎn)頭（1.5ml*24，50ml*8,50ml*10,500ml*4），可供選擇，有微處理機可按使用者編定的程序重復(fù)運轉(zhuǎn)而無差錯。RCF、離

49、心速度、時間及2r均由電腦自動計算和顯示。2. 轉(zhuǎn)頭（轉(zhuǎn)子）：離心機的轉(zhuǎn)頭一般有角度轉(zhuǎn)頭、垂直轉(zhuǎn)頭和水平轉(zhuǎn)頭三種，角度轉(zhuǎn)頭：最常用。是離心管腔與轉(zhuǎn)軸中心所成角度在14-40度之間。角度轉(zhuǎn)頭一般用于樣品的差速離心，從大容量的樣品中收集或去掉沉淀。垂直轉(zhuǎn)頭：垂直轉(zhuǎn)頭是離心管腔與轉(zhuǎn)軸中心所成角度0度而與水平面垂直?？捎糜诓钏匐x心（距離小 快）和等密度梯度離心（自生密度梯度）。水平轉(zhuǎn)頭：由轉(zhuǎn)頭和吊桶（籃）兩部分組成，離心前吊桶處于與水平面垂直位置，加速后被甩成水平位置，因為它有長距離的特點，所以產(chǎn)生的液體對流比角度轉(zhuǎn)頭和垂直轉(zhuǎn)頭要少的多，因此很適合于密度梯度離心。注意事項：1.每個轉(zhuǎn)頭都有一定的使用限

50、度，即運轉(zhuǎn)次數(shù)和運轉(zhuǎn)時間。達(dá)到限度(運轉(zhuǎn)時間)后，再使用它其最大額定速度應(yīng)降低10% ，二次超限使用時應(yīng)再降低10% ，所以每個轉(zhuǎn)頭必須單獨建檔，記錄使用時間和使用次數(shù)。一般每年減10%，直到60%為止。我們生化室的為4年。2.最大額定轉(zhuǎn)速是有條件的，若條件不符，應(yīng)按下式計算：最大允許轉(zhuǎn)速=最大額定轉(zhuǎn)速*SQRT（WA/WB）注：WA是指注滿了比重為1.2溶液的塑料離心管重量+硬鋁帽的重量，WB是操作時所用離心管重量+管帽重量+樣品溶液重量。離心管或樣品液重，則最大允許轉(zhuǎn)速就小。3.離心管及其管帽：是轉(zhuǎn)頭的重要附件，按質(zhì)地可分為：玻璃、塑料和不銹鋼。管口有螺口和光口兩類。玻璃離心管：只能用于低

51、速離心。除水平轉(zhuǎn)頭外，角度轉(zhuǎn)頭和垂直轉(zhuǎn)頭中所用的離心管離心時都要加蓋管帽，作用有二：防止樣品液外溢造成腐蝕或污染離心腔；防止離心管變形。第二節(jié) 制備超離心方法制備超離心技術(shù)主要包括：差速離心法和密度梯度離心法一、差速離心法差速離心法又叫分級離心法：為了分出某一組分，需要進(jìn)行一系列離心，先選擇一個離心速度和離心時間，把大部分不需要的大的顆粒沉降去掉，再把上清液用更高的速度離心，把需要的粒子沉降下來。再用更高的離心速度離心上清液，沉降需要的更小的粒子。若不純，則用相同的介質(zhì)把沉淀懸浮起來，再用較低的速度離心即可去掉沉淀中混雜的較小粒子。是基于各種粒子的沉降速度不同對其進(jìn)行分離的。操作較簡單。但有如

52、下缺點： 要得到某一組分，需要時間長，效率低。 一次只能得到沉降最快的組分。 顆粒大小相差過小時，難于用此法分離。二、密度梯度離心將樣品粒子在一個密度梯度介質(zhì)中離心，此介質(zhì)由一合適的小分子及其溶劑組成，離心時，離軸心越遠(yuǎn)介質(zhì)的密度越大。比差速離心法分辨力高，可同時分離樣品中的幾個或全部組分。按操作方法的不同，又可分為：梯度介質(zhì)制備裝置A低濃度液；B高濃度液；C電磁攪拌器；D，E活塞；F攪拌磁棒；G離心管 3. 離心過程中自動形成的，如 硫酸銫、氯化銫等，蔗糖也可但需較長時間。 速率區(qū)帶離心：離心過程中顆粒常受到振動、溫差和對流的干擾。因此，要利用密度梯度來消除和減輕這種現(xiàn)象。分離樣品的最小密度

53、要大于介質(zhì)的最大密度，因樣品中的各組分沉降速率不同，被分離成一系列的樣品區(qū)帶，所以稱速率區(qū)帶離心。這里密度梯度介質(zhì)的作用是： 支撐樣品溶液， 防止離心中產(chǎn)生的對流對已形成區(qū)帶的破壞作用（下面密度大的介質(zhì)不會上?。?。但密度梯度介質(zhì)的最大密度不能超過待分離粒子的最小密度。否則不能有效分離，所以離心時間不能過長，否則更多組分都將沉降下來，而達(dá)不到分離的目的。同時此法因樣品容量的限制，故不適于大量制備實驗。此種分離主要取決于粒子之間所受離心力與摩擦阻力的差異。 等密度梯度離心：介質(zhì)的密度梯度范圍包括待分離的樣品中所有顆粒的密度。各粒子移動到與其密度相等的地方即形成區(qū)帶所以叫等密度梯度離心。此種分離主要取決于粒子之間的密度差。梯度介質(zhì)可用均一介質(zhì)，在離心時自動形成（自生梯度如用銫鹽或銣鹽）亦可預(yù)先人工制備 如，蔗