1、研究生光譜技術(shù)與應(yīng)用課程作業(yè)河南大學(xué)單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) 學(xué)生：郭愛宇 學(xué)號(hào)：104753120870 學(xué)院：物理與電子學(xué)院 年級(jí)專業(yè)：2012級(jí)光學(xué)工程 課程名稱：光譜技術(shù)及應(yīng)用 指導(dǎo)老師：郭立俊教授單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)摘要：?jiǎn)畏肿訜晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移技術(shù)(single molecule fluorescence resonance energy transfer, smFRET) 通過檢測(cè)單個(gè)分子內(nèi)的熒光供體及受體間熒光能量轉(zhuǎn)移的效率，來研究分子構(gòu)象的變化。在單分子探測(cè)技術(shù)發(fā)展之前，大多數(shù)的分子實(shí)驗(yàn)是探測(cè)分子的綜合平均效應(yīng)(ensemble averages)，這一平均效應(yīng)掩蓋了許

2、多特殊的信息。單分子探測(cè)可以對(duì)體系中的單個(gè)分子進(jìn)行研究，得到某一分子特性的分布狀況，也可研究生物分子的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。介紹了近來單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的進(jìn)展。關(guān)鍵詞：?jiǎn)畏肿樱粺晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移；熒光基團(tuán)1 引言 光譜技術(shù)是研究生物分子最常用的方法之一。在單分子光譜（single molecule spectroscopy, SMS）探測(cè)技術(shù)發(fā)展以前，大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)是探測(cè)分子的綜合平均效應(yīng)，得到的是由大量對(duì)象組成的一個(gè)整體所表現(xiàn)出的平均響應(yīng)和平均值，這一平均效應(yīng)掩蓋了許多特殊的信息。而單分子探測(cè)可對(duì)體系中的單個(gè)分子進(jìn)行研究，通過與時(shí)間相關(guān)過程的探測(cè)，能實(shí)時(shí)了解生物大分子構(gòu)象變化的信息。 2002年美

3、國(guó)第46屆生物物理年會(huì)表明單分子仍是生物物理學(xué)目前和今后重點(diǎn)發(fā)展的研究領(lǐng)域。主要的技術(shù)手段包括生物大分子熒光光譜，單分子熒光能量轉(zhuǎn)移譜、與原子力顯微鏡結(jié)合進(jìn)行單分子水平的分子間相互作用力的測(cè)量，以及可進(jìn)行單分子操作的激光光鉗，高時(shí)間分辨率的單分子軌跡追蹤等1。由此可見，單分子熒光技術(shù)具有重要的地位。 標(biāo)記在生物大分子上單個(gè)熒光基團(tuán)的各種特性變化能夠提供有關(guān)分子間相互作用、酶活性、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、構(gòu)象動(dòng)力學(xué)、分子運(yùn)動(dòng)自由度(molecular freedom of motion)及在化學(xué)和靜電環(huán)境下活性改變的信息。近年，在動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究領(lǐng)域，用單分子熒光光譜技術(shù)研究生物分子構(gòu)象變化的方法主要有兩

4、種：一是通過單分子熒光偏振的各向異性（single molecule fluorescence polarization anisotropy，smFPA）研究生物分子的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)(conformational dynamics)和旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)(rotational motions)。另一個(gè)是單分子對(duì)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(single pair fluorescence resonance energy transfer, spFRET)，在單分子水平測(cè)量一個(gè)分子內(nèi)或兩個(gè)不同分子間的距離變化和相互作用。本文主要就后者做簡(jiǎn)要介紹。 2 單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（smFRET）2.1 smFRET原理

5、熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指當(dāng)兩種不同的熒光生色團(tuán)離的較近，且其中一種生色團(tuán)（供體，donor）的發(fā)射譜與另一種生色團(tuán)（受體，acceptor）的激發(fā)譜有相當(dāng)程度的重疊時(shí)，當(dāng)供體被激發(fā)時(shí)，受體會(huì)因供體激發(fā)能的轉(zhuǎn)移而被激發(fā)。其直觀表現(xiàn)就是供體產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度較其單獨(dú)存在時(shí)要低的多，而受體發(fā)射的熒光卻大大增強(qiáng)，同時(shí)伴隨它們熒光壽命的相應(yīng)縮短和延長(zhǎng)。能量轉(zhuǎn)移效率與兩個(gè)生色團(tuán)激發(fā)譜和發(fā)射譜的重疊程度、供體與受體躍遷偶極的相對(duì)取向、供受體間的距離有密切關(guān)系， 其經(jīng)典公式為E=R06/(R6+ R06)，R0為能量傳遞達(dá)到50%的距離。選定供、受體對(duì)之后，可將R0看作恒量。能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生將改變供、受體的去偏振程度、

6、熒光壽命、熒光強(qiáng)度等，測(cè)定這些參數(shù)值就可得出E。利用R0和實(shí)驗(yàn)測(cè)得的E就可測(cè)得供受體間的距離R。用此方法測(cè)量生色團(tuán)距離的方法被稱為光譜尺，可測(cè)量1.0-10.0nm之間的距離。 smFRET是在一個(gè)生物大分子或兩個(gè)相互作用的分子上標(biāo)記兩個(gè)不同的熒光基團(tuán)。同樣，當(dāng)供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜相重疊時(shí)，發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移。通過探測(cè)能量轉(zhuǎn)移效率，就可確定兩點(diǎn)間的距離。由于相對(duì)取向和光譜重疊積分等不確定因素，該方法不能準(zhǔn)確確定絕對(duì)距離。但可通過監(jiān)測(cè)供體-受體的相對(duì)距離變化，結(jié)合其時(shí)間變化推測(cè)生物大分子在生命活動(dòng)中的構(gòu)象變化。該技術(shù)不僅有非常好的靜態(tài)定位能力，也能提供分子內(nèi)或分子間兩個(gè)熒光基團(tuán)在距離和方

7、向上的動(dòng)態(tài)變化。由于每次只觀察一對(duì)供、受體系統(tǒng)，因此能在毫秒時(shí)間尺度內(nèi)觀察這些變化，從而將具有不同能量轉(zhuǎn)移效率的亞群分開。將這種方法擴(kuò)展，可用于研究生物多聚體的組成動(dòng)力學(xué)、DNA限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)，以及DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的去折疊等2-7。 2.2 smFRET的特點(diǎn)單分子技術(shù)的優(yōu)勢(shì)使其在生物領(lǐng)域受到極大的青睞。例如在不均一的體系中，單分子技術(shù)能直接反映分子特性的分布狀態(tài)。此外，在復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)中，單分子技術(shù)能夠在不同步化每一步反應(yīng)的情況下研究每一步的動(dòng)態(tài)化學(xué)反應(yīng)8,9。2.2.1 smFRET研究群體的分布狀態(tài)當(dāng)單個(gè)生物分子的FRET 值確定后，可以通過FRET 值的分布作出生物分子的統(tǒng)計(jì)圖

8、10。這種方法不局限于smFRET 技術(shù)，還有其他的方法也能達(dá)到這一目的?？梢约僭O(shè)有一個(gè)不均一的樣品，包含兩個(gè)不同的群體，每一個(gè)群體有不同的FRET 值。傳統(tǒng)的整體穩(wěn)態(tài)FRET 測(cè)量只能得到單一的FRET值，即整個(gè)樣品的平均FRET 值，但是它不能反映出樣品的不均一性。而smFRET 方法通過生物分子的統(tǒng)計(jì)圖能很直觀的檢測(cè)出樣品的群體分布狀態(tài)，以及每一個(gè)群體的FRET 值 ( 圖1 A)。2.2.2 smFRET研究生物分子的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)對(duì)于生物化學(xué)反應(yīng)，如果想用整體FRET 來研究動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，得出反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，需要用各種方法來使反應(yīng)同步化，使每一個(gè)分子處于反應(yīng)的同一狀態(tài)，然后在外加的因子下

9、啟動(dòng)反應(yīng)。如果反應(yīng)無法同步化，整體FRET 的方法就無法對(duì)反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。但是smFRET 并不受生物化學(xué)反應(yīng)同步化的限制( 圖1B)。同時(shí)smFRET 還能探測(cè)到稀有的構(gòu)象變化以及非富集中間產(chǎn)物的形成11。這些是很難用整體FRET 檢測(cè)到的。圖1 smFRET能檢測(cè)不同的構(gòu)象。A, LeuT在無Na+的條件下，smFRET能檢測(cè)出兩個(gè)FRET的峰，而整體FRET的方法只能得到平均的FRET值(虛線)；B,smFRET能檢測(cè)到單個(gè)LeuT分子構(gòu)象間的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而得到分子動(dòng)力學(xué)參數(shù)，這些信息很難應(yīng)用整體FRET的方法得到。3 smFRET實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 單分子熒光探測(cè)必須滿足兩個(gè)基

10、本要求，一是在被照射的體積中只有一個(gè)分子與激光發(fā)生相互作用；二是要確保單分子的信號(hào)大于背景的干擾信號(hào)。背景信號(hào)來自于Raman散射、Rayleigh散射、溶劑中雜質(zhì)、蓋玻片產(chǎn)生的熒光和探測(cè)器的暗電流。因此，進(jìn)行單分子探測(cè)要求 (1) 激發(fā)容積要小，因?yàn)楸尘暗奈张c激發(fā)體積成正比，盡量減小激發(fā)體積可降低背景干擾，（2）高效的收集光學(xué)系統(tǒng)，（3）靈敏的探測(cè)器，（4）采用針孔裝置，或?qū)⑷軇┲须s質(zhì)預(yù)漂白以及用低熒光光學(xué)材料等方法清除背景熒光。 常用的裝置是近場(chǎng)光學(xué)掃描顯微鏡(near-field scanning optical microscope NSOM)，其最小激發(fā)體積小于10-2m3。該方法

11、在單分子熒光的探測(cè)中發(fā)揮了很重要的作用?？杀O(jiān)測(cè)單個(gè)生物大分子的構(gòu)造變化，例如旋轉(zhuǎn)和納米水平上的距離變化。其不足是掃描時(shí)需要通過復(fù)雜的控制系統(tǒng)來保持適當(dāng)?shù)臉悠放c探針之間的距離，并且其近場(chǎng)激發(fā)對(duì)所研究的生物體系有微擾作用，給研究帶來許多限制。 共聚焦激光掃描顯微鏡(Confocal scanning optical microscope CSOM)12-13，也是常用裝置之一。在其光學(xué)設(shè)計(jì)中，激光束經(jīng)物鏡聚集到樣品上形成一個(gè)接近衍射極限的光斑，利用同一物鏡收集樣品反射回的光，經(jīng)一個(gè)共焦小孔后被探測(cè)器接收，而非焦面的光則被小孔濾掉，從而保證了良好的光學(xué)收集效率和高信噪比。 為了實(shí)現(xiàn)寬場(chǎng)顯微觀察，可通

12、過常規(guī)熒光顯微鏡的上方照明孔送入激發(fā)光，但這樣無法消除來自顯微鏡片和樣本的自身熒光，會(huì)產(chǎn)生次級(jí)干擾。采用瞬間場(chǎng)激發(fā)方法可避免激發(fā)光進(jìn)入探測(cè)器，這種方法是由在玻璃和水界面的激發(fā)光產(chǎn)生全內(nèi)反射實(shí)現(xiàn)的，因此稱為全內(nèi)反射熒光顯微鏡(Total internal reflection fluorescence microscope TIRFM)14-15。為了實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射，需要大的入射角，例如玻璃-水界面的入射角要大于61°。這可以通過棱鏡(prism)實(shí)現(xiàn)，稱為prism-based TIRFM；也可通過高數(shù)值孔徑的物鏡實(shí)現(xiàn)，此時(shí)稱為objective-type TIRFM，見圖216。 探

13、測(cè)器是單分子熒光檢測(cè)的關(guān)鍵部分，常用的探測(cè)器是超敏電感偶合相機(jī)(intensity charged coupled device, ICCD)和單光子計(jì)數(shù)模式的雪崩光二極管，將其與激光共聚焦熒光顯微鏡和有關(guān)電子系統(tǒng)相組合，可進(jìn)行多種形式的單分子熒光特性研究。包括單分子熒光成像，熒光光譜，熒光壽命及FRET。為了實(shí)現(xiàn)FRET效率最優(yōu)化，需特別注意降低cross-talk現(xiàn)象，即供體和受體發(fā)射光互相泄漏到彼此的探測(cè)器，尤其是供體發(fā)射光的漏射?？刹捎脦V波器降低此影響。 一般而言，單分子FRET研究設(shè)備的主要組成包括：激光光源，激發(fā)常用標(biāo)記物Cy3的理想波長(zhǎng)為532nm；倒置顯微鏡，CSOM和ob

14、jective type TIRM可用60倍油浸物鏡，NA=1.4, WD（工作距離）=0.15mm，prism-based TIRM可用60倍水浸物鏡，NA=1.2, WD=0.25mm；超敏數(shù)字CCD攝象機(jī)；其它，如樣本掃描平臺(tái)；熒光過濾器；棱鏡；石英載玻片；雪崩光電二極管；計(jì)算機(jī)等。圖3是典型的供體-受體標(biāo)記的單個(gè)蛋白能量轉(zhuǎn)移情形，可見供體熒光有效地轉(zhuǎn)移給受體。當(dāng)受體發(fā)生光漂白時(shí)，能量轉(zhuǎn)移被阻斷，供體自身發(fā)出熒光17。 圖2 smFRET全反射熒光顯微鏡示意圖。圖3 單對(duì)D-A體系標(biāo)記的單個(gè)無抑制劑蛋白的能量轉(zhuǎn)移過程。 3.2 熒光標(biāo)記物用于單分子熒光研究的理想熒光標(biāo)記物應(yīng)有下述特點(diǎn)：耐

15、光，不易發(fā)生光致漂白；具有高消光系數(shù)和高量子產(chǎn)率；易被激發(fā)，熒光強(qiáng)度波動(dòng)??；體積小，對(duì)標(biāo)記的宿主分子影響小。對(duì)于smFRET研究用的一對(duì)熒光探針，還要求 供、受體的激發(fā)譜有較大不同，二者的發(fā)射譜也要足夠分開。但供體發(fā)射譜與受體激發(fā)譜又要有一定重疊，盡量減少供體發(fā)射的熒光漏入受體發(fā)射范圍，降低激光直接激發(fā)受體的作用；供體和受體都有相當(dāng)?shù)牧孔影l(fā)射，保證在有FRET發(fā)生時(shí)，供、受體都有明確的強(qiáng)度相對(duì)變化。熒光蛋白18-20、有機(jī)染料9,21 以及半導(dǎo)體量子點(diǎn)22-23在單分子熒光技術(shù)上均有應(yīng)用。熒光蛋白具有較低的光穩(wěn)定性，在單分子技術(shù)上它的應(yīng)用不如有機(jī)染料廣泛。有機(jī)染料由于其相對(duì)分子質(zhì)量小，光穩(wěn)定性

16、強(qiáng)，以及多種形式的有機(jī)染料可以很容易購(gòu)得( 例如Cyanine 系列的染料可以從GE Healthcare購(gòu)得)，因此其應(yīng)用最為廣泛。其中，長(zhǎng)期以來一直廣泛應(yīng)用的是Cyanine 染料系列中的Cy3 及Cy5。半導(dǎo)體量子點(diǎn)也可作為熒光的供體用于單分子熒光技術(shù)上。目前商品化的半導(dǎo)體量子點(diǎn)的直徑大于20 nm，遠(yuǎn)大于有機(jī)熒光染料分子( 直徑小于1 nm)。如此大的體積，使其在smFRET 中檢測(cè)生物分子的構(gòu)象變化上不夠靈敏。 另外，單官能的半導(dǎo)體量子點(diǎn)目前尚未商品化。但是Jacob Piehler 實(shí)驗(yàn)室23及Alice Y Ting 實(shí)驗(yàn)室24報(bào)道了單官能的半導(dǎo)體量子點(diǎn)的制備及在單分子熒光技術(shù)上

17、的應(yīng)用。由于其光穩(wěn)定性遠(yuǎn)強(qiáng)于熒光蛋白及有機(jī)熒光染料，半導(dǎo)體量子點(diǎn)作為一種新型的熒光探針正越來越廣泛地被采用。 標(biāo)記的熒光團(tuán)是否會(huì)影響宿主分子的生物活性？Taekjip8認(rèn)為有機(jī)的熒光基團(tuán)會(huì)有一定作用，但他們進(jìn)行的有關(guān)RNA和DNA的研究，尚未發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的熒光基團(tuán)能明顯影響分子反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)。在他們進(jìn)行的靡蛋白酶抑制劑分子折疊-展開平衡分布的smFRET研究中，也未發(fā)現(xiàn)兩個(gè)較大的熒光基團(tuán)對(duì)分子的穩(wěn)定性有影響。一般而言，應(yīng)多選幾個(gè)替代標(biāo)記部位，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇對(duì)分子影響最小的部位。 3.3 樣品的制備及單分子的檢測(cè)現(xiàn)在有多種商品化的熒光染料，使得生物分子的標(biāo)記大大簡(jiǎn)單化，如對(duì)于核酸分子的標(biāo)記，含有亞磷

18、酰胺基團(tuán)的染料能很容易地在核酸合成的過程中標(biāo)記核酸分子；也可以用氨基反應(yīng)性的染料標(biāo)記核酸合成過程中產(chǎn)生的氨基，然后通過分子篩、高效液相色譜或凝膠電泳將染料標(biāo)記的核酸分子與游離的染料及無染料標(biāo)記的核酸分子分開。由于賴氨酸在蛋白質(zhì)表面的富集性，通常使用氨基反應(yīng)性的染料對(duì)蛋白質(zhì)或抗體進(jìn)行標(biāo)記。對(duì)于大多數(shù)蛋白，由于表面含有多個(gè)賴氨酸，此方法對(duì)于位點(diǎn)特異性的標(biāo)記并不可行，此時(shí)可以選擇半胱氨酸。半胱氨酸在蛋白質(zhì)表面并不常見，可以使用巰基反應(yīng)性的染料對(duì)蛋白進(jìn)行位點(diǎn)特異性地標(biāo)記。如果要較長(zhǎng)時(shí)間使用smFRET 技術(shù)觀察生物分子的構(gòu)象變化，生物分子需要表面固定化。不恰當(dāng)?shù)墓潭ǚ绞綍?huì)影響分子的性質(zhì)。鏈霉親和素(s

19、treptavidin) 和生物素(biotin) 具有很強(qiáng)的親和性，通常利用它們之間的相互作用來特異性地固定樣品25。例如生物素化的牛血清白蛋白可吸附在玻璃或石英的表面，然后通過多價(jià)的鏈霉親和素來結(jié)合并固定生物素化的熒光標(biāo)記的核酸分子。對(duì)于蛋白質(zhì)的固定，通常使用鈍化劑( 如聚乙二醇) 來抑制蛋白質(zhì)非特異性地結(jié)合到玻璃或石英的表面。對(duì)于His-Tag 蛋白的固定，可以采用螯合的Ni2+ 或Cu2+，但是有些情況下需要在His-Tag 和蛋白質(zhì)之間加一段鏈接以保證固定后的蛋白具有合適的取向11。smFRET研究中的另一個(gè)問題是光致漂白作用?？梢圆捎弥芷谛缘淖钄嗉す?，來延長(zhǎng)觀察時(shí)間。鑒于單態(tài)氧的存

20、在是熒光漂白的主要原因，除去溶液中的氧可延長(zhǎng)某些基團(tuán)的熒光壽命，例如Cy5的壽命可增加30倍。但對(duì)其他一些熒光基團(tuán)，祛除氧只有很小的作用，甚至有相反作用。此外，密封樣品艙，與環(huán)境空氣隔絕也很重要。 3.4 數(shù)據(jù)處理為了保證所選擇的信號(hào)來自真正的熒光分子而不是來自背景信號(hào)，在對(duì)smFRET 信號(hào)篩選時(shí)，通常需要設(shè)定多個(gè)參數(shù)11。如分子具有單個(gè)光褪色步驟，信噪比大于8:1，供體的熒光閃爍少，供體對(duì)受體的皮爾遜相關(guān)系數(shù)小于0.5，同時(shí)熒光分子的壽命長(zhǎng)于15 時(shí)幀，并且分子的FRET 值大于0.15。標(biāo)記分子的FRET 值隨時(shí)間變化，通常被解釋成熒光供體和受體間的距離的變化及標(biāo)記分子構(gòu)象的變化。這是基

21、于在數(shù)據(jù)采集的時(shí)間刻度范圍內(nèi)，熒光基團(tuán)能自由旋轉(zhuǎn) ( 熒光基團(tuán)的取向因子K2=2/3)及熒光的量子產(chǎn)率在數(shù)據(jù)收集過程中穩(wěn)定。用實(shí)驗(yàn)的方法測(cè)量熒光基團(tuán)的取向因子K2 比較困難，因此通常不用FRET 值來測(cè)定絕對(duì)距離，而是用smFRET 來反映分子動(dòng)態(tài)的變化即相對(duì)距離的變化。FRET 的變化可能來自分子構(gòu)象的變化，也可能是由于熒光基團(tuán)與標(biāo)記分子間的相互作用。通?？梢杂靡韵聝蓚€(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)來排除構(gòu)象變化外的其他因素導(dǎo)致的FRET 的變化8,9。首先，用整體平均的方法測(cè)量熒光的各向異性。如果熒光的各向異性值很低，表明熒光基團(tuán)與標(biāo)記的分子間的作用較弱，熒光基團(tuán)的旋轉(zhuǎn)比較自由。此方法不能排除熒光基團(tuán)與標(biāo)記分子

22、間短暫的相互作用，該相互作用可以通過測(cè)量固定化的單個(gè)熒光分子的各向異性來排除。另外一種對(duì)照實(shí)驗(yàn)是通過改變實(shí)驗(yàn)的生物學(xué)參數(shù)來確定觀察到的FRET 的變化的生物學(xué)來源，如在蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化試驗(yàn)中，如果FRET 的變化與蛋白的底物相關(guān)，與功能相關(guān)的單位點(diǎn)突變也影響FRET 的變化，這說明所觀察到的FRET 的變化具有生物學(xué)意義11。4 smFRET應(yīng)用smFRET研究分子內(nèi)和分子間的構(gòu)象變化非常有用。分子內(nèi)的研究包括大分子的起伏（fluctuation）和穩(wěn)定、蛋白質(zhì)分子內(nèi)部特定點(diǎn)位之間的距離，折疊和去折疊及催化作用時(shí)酶結(jié)構(gòu)改變等。分子間的研究包括受體與配體結(jié)合、酶與底物的結(jié)合和分離及馬達(dá)蛋白的運(yùn)動(dòng)

23、等。圖4（上）26所示的是用smFRET測(cè)量分子內(nèi)的構(gòu)象變化示意圖。D和A分別是供體和受體，ID和IA分別是供體和受體熒光的強(qiáng)度，t是時(shí)間。圖4(下)表示用smFRET研究分子間的結(jié)合和分離。從圖中可見供體和受體的熒光強(qiáng)度正好成相反的變化。自從1996年首次報(bào)道測(cè)量單個(gè)供體和受體間能量轉(zhuǎn)移以來，已用該方法研究了葡萄球菌酶催化作用時(shí)酶與底物的相互作用，在人工脂膜上配體與受體的結(jié)合和定位，鈣離子結(jié)合蛋白與鈣結(jié)合時(shí)的構(gòu)象變化，鹽濃度對(duì)卷曲狀原肌球蛋白解離的影響等。 圖4 spFRET研究分子內(nèi) (上) 和分子間（下）構(gòu)象變化的示意圖。局部環(huán)境的變化會(huì)引起熒光基團(tuán)發(fā)射特性的改變，也可在單分子水平進(jìn)行檢

24、測(cè)。實(shí)際上，由于它們的熒光發(fā)射特性對(duì)電荷 、PH和離子濃度非常敏感，因此可做為非常理想的指示劑。將其與酶或離子通道結(jié)合，封閉活性部位或通道口時(shí)就能通過其反映生物分子的結(jié)構(gòu)變化和功能。圖5（上）表示離子通道用熒光指示計(jì)I標(biāo)記，其強(qiáng)度I的變化反應(yīng)了局部離子濃度的變化。如果在離子通道上再標(biāo)記上供體和受體對(duì)（圖5下），則smFRET就能反應(yīng)通道蛋白質(zhì)構(gòu)象動(dòng)力學(xué)的變化，同時(shí)指示計(jì)能檢測(cè)離子流的變化情況26。通道病(channelopathies)是目前生物物理領(lǐng)域研究的重要問題之一。電測(cè)量與熒光技術(shù)的結(jié)合已揭示了離子通道的作用模型。通道與Alzheimer病的發(fā)生也有密切關(guān)系。 圖5 spFRET用于研

25、究離子通道變化的示意圖。smFRET還可用于測(cè)量單個(gè)酶的催化作用。用供體和受體標(biāo)記核酸酶后，可通過測(cè)量分子內(nèi)的構(gòu)象變化監(jiān)測(cè)其催化活性。當(dāng)?shù)孜餄舛雀邥r(shí)，能得到供、受體發(fā)射熒光強(qiáng)度的反相變化和呈明顯周期性的時(shí)間軌跡。用這種方法能得到單個(gè)酶分子的催化速率等信息。在分子間的smFRET催化實(shí)驗(yàn)中，在酶上標(biāo)記一個(gè)供體，底物上標(biāo)記一個(gè)或多個(gè)受體。發(fā)生催化反應(yīng)時(shí)也能得到供、受體熒光發(fā)射強(qiáng)度的反相變化曲線，如果受體空間距離相等，就能得到準(zhǔn)確的時(shí)間周期變化，見圖6A和B26。這種測(cè)量還能提供底物或產(chǎn)品結(jié)合與分離速率的信息。 圖6 核酸酶與DNA相互作用時(shí)分子內(nèi)（A）和分子間(B)的smFRET。借助于單分子操縱

26、技術(shù)，如原子力顯微鏡和光鑷和磁鑷等，可研究單個(gè)DNA分子的過度延伸和超螺旋，單分子馬達(dá)反應(yīng)時(shí)的力和位移以及蛋白質(zhì)的去折疊。 圖7示意的是用光鑷與smFRET結(jié)合研究DNA的展開變化26。2000年有學(xué)者報(bào)道了用該技術(shù)研究A431癌活細(xì)胞上表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的信號(hào)傳遞過程。用供、受體標(biāo)記單個(gè)EGFR分子，能通過FRET記錄其發(fā)生二聚反應(yīng)（dimerization reaction）的連續(xù)視頻圖象，（圖8）27。這證明smFRET可用于研究活細(xì)胞膜蛋白的二聚、寡聚、結(jié)合與分離和構(gòu)象動(dòng)力學(xué)。未來smFRET有可能用于胞液，甚至細(xì)胞核的研究，包括有絲分裂期間單個(gè)馬達(dá)蛋白、轉(zhuǎn)錄時(shí)RNA聚合酶和

27、翻譯時(shí)核糖體的運(yùn)動(dòng)性和結(jié)構(gòu)變化。 圖7 用smFRET研究DNA的機(jī)械牽拉。圖8 活細(xì)胞上的spFRET。a是膜上EGFR分子標(biāo)記供受體的示意圖， b是供受體熒光強(qiáng)度變化的視頻圖象和記錄曲線。 5 結(jié)語(yǔ)與展望應(yīng)用全內(nèi)反射熒光顯微鏡進(jìn)行單分子或smFRET的研究，在生物領(lǐng)域取得了巨大的進(jìn)展，使人們對(duì)有些生物過程有了更深入的了解?；罴?xì)胞水平單分子的研究能使人們深入理解細(xì)胞膜上膜蛋白的動(dòng)態(tài)變化，膜蛋白與其他蛋白間的相互作用，以及膜蛋白的生物調(diào)控等問題。未來隨著探針的改進(jìn)及數(shù)據(jù)分析的改進(jìn)，該領(lǐng)域會(huì)有突飛猛進(jìn)的發(fā)展。參 考 文 獻(xiàn)1) 韓學(xué)海 從美國(guó)生物工程學(xué)年會(huì)第46屆年會(huì)看國(guó)際生物物理發(fā)展趨勢(shì). 生

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