1、豚鼠氣道平滑肌的急性分離及KATP通道單通道電流的記錄        【摘要】     目的：建立急性分離豚鼠氣道平滑肌的方法，并初步分析ATP敏感鉀通道(KATP通道)單通道電流的性質(zhì)。方法：急性分離出豚鼠34級(jí)支氣管，并用鏈霉蛋白酶E分散氣道平滑肌細(xì)胞，應(yīng)用膜片鉗技術(shù)的內(nèi)面向外式記錄方法，研究氣道平滑肌KATP通道單通道電學(xué)性質(zhì)。結(jié)果：成功記錄到電導(dǎo)為112.4±5.14 pS的、可被優(yōu)降糖所阻斷的KATP通道單通道電流。鉗制電壓在0-60 mV之間，

2、通道電流無(wú)整流現(xiàn)象，且未見(jiàn)時(shí)間依賴性失活。結(jié)論：建立了急性分離豚鼠氣道平滑肌的方法，并成功記錄KATP通道單通道電流，為進(jìn)一步研究氣道平滑肌KATP通道在呼吸道疾病中的作用提供了基礎(chǔ)。     【關(guān)鍵詞】  氣道平滑肌; 急性分離; ATP敏感鉀通道; 單通道電流    氣道平滑肌的主要作用是調(diào)節(jié)氣道的緊張度和口徑1。氣道平滑肌收縮是呼吸系統(tǒng)疾病中氣道阻力增高的主要原因之一。多種ATP敏感鉀通道(ATPsensitive potassium channel, 簡(jiǎn)稱KATP通道)開(kāi)放劑，如吡那地爾(pina

3、cidil)2、克羅卡林(cromakalim)3，可以使氣道平滑肌松弛，并且這種作用能被KATP通道特異性阻斷劑優(yōu)降糖所阻斷。因此，KATP通道在調(diào)節(jié)氣道平滑肌的舒張和收縮中起著重要作用，但其單通道電學(xué)性質(zhì)一直未能闡明。本研究利用改進(jìn)的氣道平滑肌分離方法分離細(xì)胞，并用膜片鉗技術(shù)研究了氣道平滑肌KATP通道的單通道性質(zhì)，為進(jìn)一步研究KATP通道在呼吸道疾病中的作用提供了基礎(chǔ)。1 材料和方法1.1 支氣管平滑肌細(xì)胞急性分離氣管組織制備和保持：取健康豚鼠(雌雄不分)，體重300400 g，用3%的戊巴比妥鈉鹽4 ml/kg腹腔麻醉后，取出氣管和肺組織，立即置于4 用95%O2+5%CO2飽和的HP

4、SS液(成分(mmol/L)：NaCl 126，KCl 5，HEPES 10，CaCl2 2，MgSO4 2，DGlucose 10,pH7.3(NaOH)中。分離兩側(cè)肺組織中的34級(jí)支氣管。去除上皮細(xì)胞和外側(cè)面的結(jié)締組織和肺組織后，放入含10 ml HPSS液的浴槽底部平衡。內(nèi)含青霉素(20 U/L)和鏈霉素(20 g/ml)。溫度保持在32 ，通以95%O2+5%CO2混合氣。分離支氣管平滑肌細(xì)胞： 取3 ml HPSS液和4.5 mg鏈霉蛋白酶E(Pronase E)放入10 ml離心管中，將切成1 mm2的支氣管組織放入底部，上方通以混合氣，溫度37 ，pH7.4。消化3040 min

5、后洗去殘余酶。在HPSS液中，用針頭將氣管組織分離成絲狀，在常溫下分別用尖端拋光處理的直徑為300 m和150 m的Pasteur吸管連續(xù)吹打，使組織分散，細(xì)胞游離。取上部細(xì)胞懸液，置于HPSS液中，放在4 冰箱保存，供6 h內(nèi)使用。整個(gè)消化過(guò)程需通以95%O2+5%CO2混合氣。實(shí)驗(yàn)時(shí)，取細(xì)胞懸液加到培養(yǎng)皿內(nèi)的蓋玻片上，此蓋玻片事先涂有0.1%的多聚賴氨酸。靜置10 min后，加入2ml HPSS液洗去蓋玻片上多余的組織碎片和未附著在蓋玻片上的細(xì)胞。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。通道記錄僅選用細(xì)胞膜完整、有立體感、胞體呈梭形的細(xì)胞。1.2 單離子通道記錄與分析采用膜片鉗技術(shù)的內(nèi)面向外式。浴槽液成分為(m

6、mol/L)：KCl 140，CaCl2 1，NaCN 2，HEPES 10。電極液成分為(mmol/L)：KCl 140，CaCl2 2，MgCl21，TTX0.001，CdCl20.3，HEPES 10。加入TTX和CdCl2的目的在于分別阻斷電壓依賴性Na+和Ca2+通道。通過(guò)通道可被優(yōu)降糖(10 mol/L)所阻斷，確定為ATP敏感鉀通道。在實(shí)驗(yàn)之前，所有溶液的pH值均調(diào)到7.2，并用0.22 m的醋酸纖維微孔濾膜過(guò)濾，以除去灰塵顆粒和細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行(2127 )。1.3 資料分析數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。參數(shù)比較是在應(yīng)用方差齊性檢驗(yàn)后，用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0

7、.05為差異顯著。2 結(jié)果2.1 單通道電流實(shí)驗(yàn)中，浴槽液和電極液均使用高鉀液(K+濃度為140 mmol/L)。因此，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)面向外式記錄形成后，膜內(nèi)側(cè)面對(duì)浴槽液，此時(shí)K+平衡電位Ek為0 mV，電極下膜片的跨膜電位Vm=-Vp。當(dāng)Vp=0 mV時(shí)，未能記錄到任何通道活動(dòng);若在此基礎(chǔ)上去極化，便可記錄到外向通道電流。電流幅度在同一鉗制電壓下基本相同，呈時(shí)間不等的方波。其幅度分布直方圖呈對(duì)稱的單峰狀，能很好地進(jìn)行正態(tài)分布擬合。表1顯示的是不同鉗制電壓下單通道電流幅度的算術(shù)均數(shù)與正態(tài)擬合值的對(duì)比情況，其P值均大于0.2，表明兩者無(wú)明顯差異。說(shuō)明通道電流為單通道電流。另外，無(wú)論開(kāi)放時(shí)程長(zhǎng)短，通道電

8、流幅度基本一致。表1 單通道電流幅度算術(shù)均值與擬合均值的比較2.2 單通道電導(dǎo)外向電流隨去極化程度增大，表現(xiàn)為幅度增高。以Vp(mV)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的通道外向電流幅值(pA)為縱坐標(biāo)，可見(jiàn)在0-60 mV范圍內(nèi)，各點(diǎn)基本排列在一傾斜的直線上，說(shuō)明通道無(wú)整流。應(yīng)用直線回歸畫(huà)出最佳擬合直線(圖1，R=0.999，P<0.05)，此即電流電壓關(guān)系曲線(IV Curve)，電導(dǎo)值由該曲線斜率所決定。該通道的電導(dǎo)為112.4±5.14 pS(n=6)。IV曲線與X軸相交處的電壓值即為翻轉(zhuǎn)電位，本組通道翻轉(zhuǎn)電位為1.1 mV，與理論值0 mV極為接近。(數(shù)據(jù)顯示的是其中一例細(xì)胞記錄的結(jié)果)

9、圖1 KATP 通道內(nèi)面向外式記錄的電流電壓關(guān)系曲線2.3 通道激活與去極化時(shí)間關(guān)系在記錄到的所有通道活動(dòng)中，無(wú)論膜去極化程度大小，60 s內(nèi)通道的電導(dǎo)、開(kāi)放概率均無(wú)明顯變化，長(zhǎng)者甚至在90 min內(nèi)通道活動(dòng)仍無(wú)明顯變化。3 討論本實(shí)驗(yàn)從急性分離的單個(gè)豚鼠氣道平滑肌細(xì)胞上記錄到的單通道電流，在鉗位電壓一定時(shí)，電流幅度均一，呈均勻的正態(tài)分布，是單通道電流。由于電極液中含有鈣通道阻斷劑CdCl2，阻斷了電壓依賴性鈣通道;有TTX，阻斷了Na+通道，由此排除了鈉通道與鈣通道電流的干擾;通道電流在去極化時(shí)為外向電流，且幅度隨去極化加大而增大;內(nèi)面向外式記錄膜內(nèi)外鉀離子濃度相等時(shí)，通道翻轉(zhuǎn)電位為0 mV

10、，與實(shí)驗(yàn)狀態(tài)下的鉀離子平衡電位一致，說(shuō)明通道對(duì)K+選擇性通透。再結(jié)合KATP通道特異性阻斷劑優(yōu)降糖對(duì)通道電流的阻斷作用，確定該通道為KATP通道。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)中的方法4，并針對(duì)豚鼠氣道平滑肌的特點(diǎn)進(jìn)行了改良，成功對(duì)豚鼠氣道平滑肌急性分離，獲得了適用于膜片鉗研究的單個(gè)氣道平滑肌細(xì)胞。由于在完整細(xì)胞上，胞內(nèi)ATP可抑制通道的活動(dòng)，因此在完整細(xì)胞上難以記錄到KATP通道的單通道活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)中，我們采用了浴槽內(nèi)加入NaCN的方法抑制細(xì)胞代謝，并使用膜片鉗內(nèi)面向外式記錄方式，最大限度地去除了胞內(nèi)ATP的影響，成功記錄到KATP通道的活動(dòng)，并對(duì)其單通道電學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。在本實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，正常豚

11、鼠氣道平滑肌上能記錄到的KATP通道活動(dòng)較少。究其原因，可能是由于平滑肌細(xì)胞KATP通道密度很低(如肺動(dòng)脈平滑肌KATP通道電流噪音分析表明單個(gè)細(xì)胞只有300400個(gè)通道，即大約每10 m2一個(gè)通道5)，記錄到單通道的概率較低。KATP通道具有多樣性或異質(zhì)性，單通道電導(dǎo)的變化很大。平滑肌KATP通道大致可分為小到中電導(dǎo)(在平衡鉀液中電導(dǎo)值1550 pS)和大電導(dǎo)(在平衡鉀液中電導(dǎo)值130 pS以上)兩類6。本研究發(fā)現(xiàn)豚鼠氣道平滑肌KATP通道電導(dǎo)較大，為112.4±5.14 pS。通道電導(dǎo)的不同，可能與通道組織來(lái)源和實(shí)驗(yàn)條件及記錄方式不同所致。一般來(lái)說(shuō)，KATP通道開(kāi)放可使細(xì)胞膜超極

12、化、引起電壓依賴性Ca2+通道的關(guān)閉，激動(dòng)劑誘導(dǎo)的三磷酸肌醇(IP3)合成減少，收縮器對(duì)Ca2+敏感性降低，進(jìn)而松弛氣道平滑肌及血管平滑肌6。在以往的實(shí)驗(yàn)中，人們觀察到某些鉀通道開(kāi)放劑(如吡那地爾、克羅卡林)在氣道平滑肌上可產(chǎn)生松弛作用，并且這種作用可被優(yōu)降糖所阻斷，因此推斷KATP通道在氣道平滑肌上起著重要的作用2,3。但對(duì)氣道平滑肌的KATP通道的單通道性質(zhì)一直不是很清楚。本研究填補(bǔ)了相應(yīng)空白，為進(jìn)一步研究KATP通道在呼吸道疾病中的作用提供了基礎(chǔ)。    【參考文獻(xiàn)】  1Mitchell HW. Airway smooth muscle

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