1、    紅景天甙對(duì)缺氧狀態(tài)下兔肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖 和c-fos、c-myc原癌基因表達(dá)的影響        摘要目的：研究紅景天甙(salidroside, Sal)對(duì)缺氧( 2%3%)狀態(tài)下兔肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)增殖、DNA合成、細(xì)胞周期和c-fos,c-myc 原癌基 因表達(dá)的影響。方法：應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)、四唑鹽比色試驗(yàn)(MTT)、3H -胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入、細(xì)胞周期測(cè)定和斑點(diǎn)雜交的方法。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)缺氧24 h可直接刺激PASMC，使MTT

2、之OD值增加95%(P0.05)，3H-T dR的摻入量增加140%(P0.01)；在缺氧的PASMC培養(yǎng)液中加入Sal(1200 g/mL)可抑 制缺氧的這種促增殖作用，PASMC的MTT之OD值與3H-TdR摻入量與缺氧組相比顯著 下降(P0.05)；流式細(xì)胞分析顯示缺氧24 h PASMC G2/M期細(xì)胞比例比常氧組明顯 增 多(P0.01),G0/G1期細(xì)胞比例明顯減少(P0.05)，與缺氧組相比Sal可增 多PASMC G0G1期細(xì)胞比例，減少G2M期細(xì)胞比例(P0.05)；缺氧可促 進(jìn)c-fos,c-myc原癌基因表達(dá)，該效應(yīng)可被Sal所抑制。結(jié)論：紅 景天甙可抑 制缺氧所致的PA

3、SMC增殖、DNA合成、進(jìn)入G2/M期的細(xì)胞比例和c-fos,c-myc原癌 基因表達(dá)。主題詞低氧；肺動(dòng)脈；肌，平滑；基因-fos; 基因-myc; 原癌基因 Effects of salidroside on the proliferation and c-fos, c-myc oncogene expression ofrabbit pulmonary artery smooth muscle cell s under hypoxiaZHAO He-Ling, LIN Shu-Xin, JIA Bin, ZHANG Li-Li, ZHANG Shi-Fan?Department of Pa

4、thophysiology, Fourth Military Medical University, Xian(710032)?Lanzhou General Hospital Abstract AIM：To investigate the effects of salidroside on the proliferation, DNA synthesis, cell cycle and c-fos, c-myc oncogene expre ssion of rabbit PASMC(pulmonary artery smooth muscle cell) under hypoxia. ME

5、THODS ：Techniques of cell culture, M TT test, 3H-TdR incorporation, flowcytometric DNA analysis and Dot blot wer e used. RESULTS： OD value of MTT and 3H-TdR i ncorporation to PASMC increased significantly by 95% (P0.05) and 140%( P0.01) respectively after 24 h hypoxia, and salidroside(1 200 g/mL) co

6、uld inhibit these effects induced by hypoxia(P0.05); Flowcytometric DNA ana lysis revealed that hypoxia induced significant enhancement of G2/M phase of PASMC (P0.01) and decreased G0G1 phase of PASMC(P0.05); While salidroside could reverse these effects (P0.05); hypoxia stimulate d c-fos, c-myc onc

7、ogene expression of PASMC, and the effect could be inh ibited by salidroside. CONCLUSION：Salid roside inhibited the proliferation, the cell proportion of G2M phase, DN A synthesis and c-fos, c-myc oncogene expression of PASMC induced by hy poxia.MeSHAnoxia; Muscle, smooth; Pulmonary artery; Genes, f

8、os; Ge nes, myc; Oncogenes缺氧性肺動(dòng)脈高壓形成的主要因素有缺氧性肺動(dòng)脈血管收縮和缺氧性 肺動(dòng)脈壁構(gòu)型重建(remodeling)，而肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖是缺氧性肺動(dòng)脈壁構(gòu)型重建的 一個(gè)重要環(huán)節(jié)1。影響PASMC增殖的因素很多，如缺氧、血管緊張素-、內(nèi)皮素 、張力2等。藥用植物紅景天具有抗缺氧、提高機(jī)體對(duì)高原的適應(yīng)能力 等 作用，在我國(guó)西北、西南高原缺氧地區(qū)被用于防治高原適應(yīng)不全癥3，并取得滿 意效果，但對(duì)其作用機(jī)理尚缺乏研究。本試驗(yàn)應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)、四唑鹽比色試驗(yàn)、3H -TdR摻入、流式細(xì)胞儀和斑點(diǎn)雜交等方法研究缺氧狀態(tài)下SAL對(duì)兔PASMC增殖、DNA合成、細(xì) 胞周

9、期和c-fos,c-myc原癌基因表達(dá)的影響，探討其在防治缺氧造成的肺動(dòng)脈壁結(jié) 構(gòu)改變和肺動(dòng)脈高壓中的可能作用機(jī)制。材料與方法(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：純種新西蘭幼兔(出生1個(gè)月，體重400600 g)，由本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供 。(二)主要試劑和藥品：RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司；小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程 材料研究所，批號(hào)9610003； 胰蛋白酶、MTT(噻唑藍(lán))購(gòu)自Sigma公司；3H-TdR購(gòu)自 上海原子能科學(xué)研究院，比度7.4×1011Bq/mmol、放射性濃度3.7×107 Bq/m L；c-fos,c-myc原癌基因探針購(gòu)自華美生物試劑公司；紅景天甙由

10、蘭州軍區(qū)總醫(yī)院 提 供，根據(jù)Saratikov法提??；PPO購(gòu)自FLUKA公司；POPOP、DMSO為上?；瘜W(xué)試劑一廠產(chǎn)品。(三)實(shí)驗(yàn)方法：1.PASMC的培養(yǎng)和細(xì)胞同步化方法：新西蘭幼兔麻醉后，無(wú)菌取出肺主動(dòng)脈，用貼片法進(jìn)行 PASMC的原代培養(yǎng)。采用細(xì)胞分裂相脫離同步化法，使細(xì)胞進(jìn)入同步化生長(zhǎng)4。 2.PASMC的缺氧培養(yǎng)：已同步化的PASMC接種于96孔板24 h后，換成含5%小牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)液，進(jìn)行缺氧及常氧對(duì)照實(shí)驗(yàn)。缺氧裝置為自制有機(jī)玻璃小室，以20 mL/min連續(xù)通入5 % CO295N2的混合氣體，測(cè)得小室內(nèi)氧氣濃度維持在23%(CR-2測(cè)氧儀監(jiān)測(cè) )，小室置于

11、37培養(yǎng)箱內(nèi)。常氧對(duì)照組的細(xì)胞置于5% CO2孵箱內(nèi)。3.四唑鹽比色(MTT)試驗(yàn)：用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640配制 成 5×104細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，移入96孔板，細(xì)胞數(shù)為5×103100 L-1/孔， 將培養(yǎng)板移入CO 2孵箱中，在37、5% CO2及飽和濕度條件下，培養(yǎng)24 h，移去舊培養(yǎng)液，換5%胎牛 血清的RPMI-1640，并加入Sal，在含2%3% O2缺氧小室繼續(xù)孵育20 h后，每孔加入MTT 溶液(5 mg/mL) 20 L，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入DMSO 150L，振蕩10 min

12、，選擇490 nm波長(zhǎng)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(OD值)。4.3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)：將消化好的細(xì)胞懸液移入96孔板，使細(xì)胞數(shù)為5×103100 L-1/孔，培養(yǎng)24 h后，換為5%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入Sal， 在含2%3 CO2缺氧小室繼續(xù)培養(yǎng)18 h，然后加入3H-TdR(3.7×104 Bq/mL)，再繼 續(xù)孵育6 h后，中止反應(yīng)，收集細(xì)胞于9999型玻璃纖維濾紙上，用液閃計(jì)數(shù)器測(cè)定3H -TdR摻入量。5.流式細(xì)胞儀(FCM)測(cè)定細(xì)胞周期：長(zhǎng)成單層的PASMC換含5%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液，分 常氧(21%)，缺氧(2%3）

13、，缺氧(2%3）+Sal組，培養(yǎng)24 h后，用0.25%胰酶-EDTA 消化離心收集細(xì)胞，0.01 mol/L pH 7.4 PBS洗2次，1 000 r/min 離心10 min，上機(jī)前加 含RNA 酶的PI染液4 30 min，調(diào)細(xì)胞濃度至106/mL，用FCM EPICS Profile 型測(cè)定細(xì)胞周 期。6.c-fos,c-myc原癌基因斑點(diǎn)雜交：制備1×106細(xì)胞/mL懸液，每組加入10 mL 懸液，培 養(yǎng)24 h以后，換為含5%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基，分別作常氧及缺氧培養(yǎng)，24 h后加Sal， 分別 于30 min，1 h中止反應(yīng)并收集細(xì)胞，按文獻(xiàn)5方法提取總R

14、NA，以260 nm波長(zhǎng)紫 外光吸光度測(cè)定RNA含量，c-fos基因探針長(zhǎng)1.6 kb，c-myc基因探針長(zhǎng)1.3 kb， 通過(guò)缺口 平移法進(jìn)行放射性標(biāo)記，每一樣品點(diǎn)兩個(gè)斑點(diǎn)，用量分別為5 g,2.5 g RNA，然后按文 獻(xiàn)6方法進(jìn)行RNA斑點(diǎn)雜交，最后進(jìn)行放射自顯影。7.統(tǒng)計(jì)分析：所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以組間t檢驗(yàn)判 斷差異顯著性。細(xì)胞周期采用總體率假設(shè)檢驗(yàn)。結(jié)果 1.Sal對(duì)缺氧狀態(tài)下PASMC增殖和DNA合成的影響：結(jié)果如1所示，結(jié)果表明，Sal可抑制缺 氧所致的PASMC增殖和DNA合成。以單純?nèi)毖踅M為對(duì)照，Sal使PASMC的OD值下降23%，

15、3 H-TdR摻入量 下降28%(P0.05)。PASMC的OD值下降45%，3H-TdR摻 入量下降28%(P0.05)。Fig 1 Effects of salidroside on the proliferation and DNA synthesis o f PASMC under hypoxiaP0.05,vs H group;? P0.01, vs N group(±s,n=12)N=normoxia; H=hypoxia; H+Sal=hypoxia+salidroside1紅景天甙對(duì)缺氧狀態(tài)下PASMC增殖和DNA合成的影響2.紅景天甙對(duì)缺氧狀態(tài)下PASMC細(xì)胞周期的

16、影響：流式細(xì)胞分析表 明，與常氧對(duì)照 組相比，PASMC缺氧培養(yǎng)24 h后，顯著增加進(jìn)入G2/M期的細(xì)胞比例，顯著減少進(jìn)入G0 G1期的細(xì)胞比例(P0.01)，Sal能減少缺氧的PASMC進(jìn)入G2M期的細(xì)胞 比例(P0.05)，增加進(jìn)入G0G1期的細(xì)胞比例(P0.05)，使更多的P ASMC處 于相對(duì)靜止期，如2所示。Fig 2 Effect of salidroside on the cell cycle of PASMC under hyp oxiaA=normoxia; B=hypoxia; C=salidroside+hypoxia2紅景天甙對(duì)缺氧狀態(tài)下PASMC細(xì)胞周期的影響3.紅景

17、天甙對(duì)缺氧狀態(tài)下PASMC的c-fos,c-myc基因表達(dá)的影響：結(jié)果如 3所 示?？梢?jiàn)缺氧組PASMC的斑點(diǎn)灰度較常氧組高，而在缺氧組PASMC中加入Sal后，于30 min，1 h收集細(xì)胞，分別作c-fos,c-myc原癌基因的斑點(diǎn)雜交，則斑點(diǎn)灰度較單純?nèi)毖踅M低。Fig 3 Effect of salidroside on the expression of c-fos (1,2,3)、c- myc(4,5,6) oncogene of PASMC under hypoxia1,4=normoxia; 2,5=hypoxia; 3,6=hypoxia+salidroside3紅景天甙對(duì)PA

18、SMC c-fos、c-myc原癌基因表達(dá)的影響討論大量研究證明，肺血管平滑肌在缺氧環(huán)境下的增生導(dǎo)致肺血管壁結(jié)構(gòu)重建。影響PASMC增殖 的因素很多，Reusch等7報(bào)道機(jī)械張力可通過(guò)JNK/SAPK和ERK(extracellular sig nal-regul ated kinase)系統(tǒng)的激活促進(jìn)PASMC的增殖。生長(zhǎng)因子如PDGF，EGF等可通過(guò)改變 細(xì)胞內(nèi)NaH交換促進(jìn)PASMC的增殖8。Cornfield等研究發(fā)現(xiàn)9 ，急性缺氧可引起PASMC內(nèi)Ca2增高，而Ca2是細(xì)胞增殖活動(dòng)中重 要的第二信使，PKC的激活依賴于Ca2。各種刺激PASMC增殖的因素通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信息 傳導(dǎo)的共同通路

19、如Ras/MAPK、Raf-1系統(tǒng)10、cGMP、磷酸酶/磷脂系統(tǒng)的激活將 細(xì)胞外信息傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)c-myc,c-fos,c-jun等原癌基因快速短暫轉(zhuǎn) 錄和表達(dá)，促進(jìn)與DNA合成相關(guān)蛋白的合成，進(jìn)而促進(jìn)PASMC的增殖。本研究表明，紅景天甙可顯著抑制缺氧對(duì)PASMC增殖和DNA合成的促進(jìn)作用，抑制缺氧所致的 G2/M期細(xì)胞比例增多，使更多的PASMC處于G0G1期，從而抑制PASMC的增殖， 研究還表明Sal可抑制缺氧所致的c-fos,c-myc mRNA表達(dá)增加。本研究為Sal應(yīng)用于 臨床防治 缺氧性肺動(dòng)脈高壓提供了理論基礎(chǔ)，但其抑制PASMC的增殖及原癌基因表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳 導(dǎo)

20、途徑還有待進(jìn)一步研究。作者單位：趙賀玲林樹(shù)新賈斌張莉莉第四軍醫(yī)大學(xué)病生教研室(西安710032)張世范蘭州軍區(qū)總醫(yī)院胸外科參考文獻(xiàn) 1Davies P, Patton W. Peripheral and central vascular smooth muscle cells from rat lung exhibit different cytoskeletal protein profiles but similar growth factor requirements. J Cell Physiol, 1994, 159(3):399.2Kulik TJ, Alvarado SP. Ef

21、fect of stretch on growth and collagen synth esis in cu ltured rat and lamb pulmonary arterial smooth muscle cells. J Cell Physiol, 1993 , 157(3):615.3昝俊平，謝印之，孫興斌，等.紅景天中藥復(fù)方提高高原機(jī)體勞動(dòng)能力的效果觀 察.解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，1994，12(1)：17.4鄂征.細(xì)胞同步化法.鄂征主編.組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù).第3版.北京：人民衛(wèi) 生出版社，1994. 201.5Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid g uanidinium thiocyanate-phenol-chlororm extraction. Anal Biochem, 1987, 162:156. 6盧圣東.現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù).北京：高等教育出版社，1993，167.7Reusch HP, Chan G, Ives HE, et al. Activation of JNK/SAPK and ERK by m echanical strain in vascular smooth muscle cells depend