1、 16S rDNA鑒定細菌的方法細菌16S rDNA鑒定主要分為7個部分：1.提取細菌基因組DNA,2.設計/選擇引物進行PCR擴增，電泳檢測純度與大小。3.瓊脂糖凝膠電泳分離4.膠回收目的片段5.目的片段測序。6.BLAST比對獲取相似片段。7.構(gòu)建系統(tǒng)進化樹 試劑：1.1 培養(yǎng)基：通常選擇組分簡單且細菌生長良好的培養(yǎng)基（培養(yǎng)基組分過于復雜會影響DNA的提取效果，也可以在裂解細菌前用TE緩沖液對菌體進行洗滌。）。1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加濃鹽酸約（70ml, 60ml, 42ml），高溫高鹽滅菌后，室溫保存。冷卻到室

2、溫后調(diào)pH，每升高1，pH大約下降0.03個單位。(Tris-HCl緩沖液（0.05mol/L，25） 50ml 0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液與x ml 0.1mol/L 鹽酸混勻后，加水稀釋至100ml 。Tris緩沖液不僅被廣泛用作核酸和蛋白質(zhì)的溶劑，Tris也是蛋白質(zhì)電泳緩沖液的主要成分之一)1.3 0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA2H2O，用NaOH調(diào)pH至8.0（約20g）,高溫高壓滅菌，室溫保存。(配置方法 1. 稱取186.1g Na2EDTA2H2O，置于1L燒杯中。 2. 加入約800mL的去離子水，充分攪拌。 3.

3、用NaOH調(diào)節(jié)pH值值8.0（約20g NaOH）。 注意：pH值至8.0時，EDTA才能 溶解。 4. 加去離子水將溶液定容至1L。 5. 適量分成小份后，高溫高壓滅菌。6. 室溫保存。 ）1.4 10×TE Buffer(緩沖液）(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：組分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl（pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。高溫高壓滅菌，室溫保存。 1×TE Buffer用10×TE Buffer稀釋10倍即可。1.5 10%SDS（W/V）：稱1

4、0gSDS，68加熱溶解，用濃鹽酸調(diào)pH至7.2。室溫保存。用之前在65溶解。配置時要戴口罩。6、5M NaCl：稱292.2gNaCl，高溫高壓滅菌，4保存。7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），加熱攪拌。用之前在65溶解。8、氯仿/異戊醇：按氯仿：異戊醇=24：1（V/V）的比例加入異戊醇。9、酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）：按苯酚與氯仿/異戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚與氯仿/異戊醇。10、TAE緩沖液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 m

5、ol/L EDTA。濃儲存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。11、6×上樣緩沖液（100 ml）：0.25%溴酚藍（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4保存。12、0.6%瓊脂糖凝膠：稱取0.3g瓊脂糖用TAE溶液配置50 ml。13、EB：10 mg/ml。稱取1g溴化乙錠定容至100ml。棕色瓶室溫避光保存。EB的工作濃度為0.5ug/ml。當配置50ml 瓊脂糖凝膠時加入EB為2.5ul。（因EB是劇毒物質(zhì)，目前很多實驗室用生物熒光染料替代

6、，常用的有Gelred等）14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20保存，反應濃度50 ug/ml，反應緩沖液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反應溫度37-56。無需預處理。15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，無菌水2460 ul，于100加熱15分鐘，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20。（為避免RNA的干擾，使用RNA酶降解基因組中的RNA。）1.1細菌基因組DNA提取基本步驟： 材料準備 破碎細胞或胞膜內(nèi)容

7、物釋放 核算分離、純化 沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì) 核酸溶解在適量緩沖液或水中基因組DNA提取所需儀器：高速冷凍離心機、恒溫冰箱、移液器、水平電泳槽、紫外/熒光觀測儀細菌基因組DNA提取方法綜述細菌基因組DNA的提取方法主要有5種。不同的方法所選擇的試劑會有所不同。1 快速微量提取法Ø 取1.5ml菌體培養(yǎng)物于一滅菌Ep管中，12000rpm離心1min, 丟去上清夜，收集菌體。Ø 加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸鈉,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混勻,置于37oC水浴1hr。Ø 然后加入200ul5mol/L的氯化鈉溶液，混勻

8、后于13000rpm離心15min。Ø 取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。Ø 加兩倍體積無水乙醇，1/10體積醋酸鉀(3M ,pH8.0)，-20度保存1小時后，13000rpm離心15min，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室溫干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4保存?zhèn)溆谩? 蛋白酶/SDS法制備² 用10ml含適當抗生素的GBM過夜培養(yǎng)Delftia sp.² 4000rpm離心10min收集菌體，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌體2次。² 將菌體充

9、分懸浮在5ml 1×TE緩沖液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，輕輕混勻后50放置3h-5h。² 用等體積的Tris飽和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/異戊醇抽提一次，氯仿抽提一次。（取上清液。² 乙醇沉淀DNA。² 用自動移液器吸管頭將絮狀DNA沉淀塊吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于適²當1×TE或ddH2O中。3u 細菌培養(yǎng)：細菌接種于5ml液體培養(yǎng)基中，37搖床（300rpm）培養(yǎng)過液。u 細菌收集：取1ml培養(yǎng)物于1.5ml EP管中，室溫8000rpm離心5min，棄上清，沉淀重新

10、懸浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。u 菌體裂解：加入6l 50mg/ml的溶菌酶，37作用2h。再加2mol/LNaCl50l，10%SDS 110l，20mg/ml的蛋白酶K 3l，50作用3h或37過夜。（此時菌液應為透明粘稠液體）。 u 抽提：菌液均分到兩個1.5ml EP管，加等體積的酚氯仿異戊醇(25241)，混勻，室溫放置5-10min。12000rpm離心10min。抽提兩次。（上清很粘稠，吸取時應小心，最好槍頭尖應剪去）。u 沉淀：加0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10min。1 2000rpm離心10。u 洗滌：沉淀用75%的乙醇洗滌。u 抽（涼）干

11、后，溶于50l ddH2O中，取2-5l電泳。作PCR模板用。² 5 CTAB/NaCl裂解法n 接兩環(huán)菌（0.75ml甘油管菌液）于25ml LB培養(yǎng)基中，37、200r/min培養(yǎng)24h。n 取1.5ml菌液于1.5ml Eppendorf 離心管中，8000r/min離心5分鐘,棄去上清。n 加入1.5ml TE離心洗滌后,用567 ul TE溶解菌體,混勻。n 加入30l 10%SDS和3 ul 20 mg/ml的蛋白酶K（100 ug/ml），混勻，于37溫育1h。n 加入100l 5mol/L NaCl,充分混勻，再加入80l CTAB/NaCl,混勻,65溫育10分鐘。

12、n 加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)（0.8ml）,混勻,12000r/min離心5分鐘,保留上清。n 上清中加入等體積的酚氯仿異戊醇(25241)(0.8ml),混勻,12000r/min離心5分鐘,保留上清。n 加入0.6倍的異丙醇（0.48ml）,輕輕混合直到DNA沉淀下來（0.5h）,12000r/min離心15分鐘,收集DNA沉淀,用75%乙醇(1ml)12000r/min離心5分鐘洗滌DNA沉淀，真空干燥0.5h。n 用50 ul雙蒸水溶解DNA, 加入終濃度為20g/mlRNaseA，4保存。n 用0.6%瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取的DNA , 每孔點樣6l (4l樣品+ 2l

13、loading buffer) , 80 V , 電泳1.5小時。2.設計選擇引物進行16S rDNA的PCR擴增一般細菌鑒定選擇通用引物，最常用的通用引物為27F/1492R。27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'2.1 實驗原理2.1.1 PCR多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction)簡稱技術，是年代中期發(fā)展起來的一種體外擴增特異片段的技術。此法操作簡便， 可在短時間內(nèi)在試管中獲得數(shù)百萬個特異的目的序列的拷貝，技術雖然問世僅數(shù)年時間， 但它已迅速滲

14、透到分子生物學的各個領域，引起了生物技術發(fā)展的一次革命，目前它在分子克隆， 目的基礎檢測，遺傳病的基因診斷，法醫(yī)學，考古學等方面得到了廣泛的應用。技術實際上是模擬體內(nèi)DNA合成過程，是在模板， 引物和種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于聚合酶的酶促合反應，技術的特異性取決于引物和模板結(jié)合的特異性。 反應分三步：變性（denaturation）；退火（annealing）；延伸（ex tension），反應過程見圖。PCR（Polymerase Chain Reaction) 的原理2.1.2 16SrDNA的核酸序列分析16SrDAN是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA（16SrRNA）的基因，是細菌

15、分類學研究中最常用、最有用的“分子鐘”。16SrRNA的序列高度保守，可精確指示細菌之間的親緣關系，16SrRNA的大小為1500bp左右，所含信息能反映生物界進化關系，易操作，適用于各級分類單元。目前常用的是建立在PCR技術基礎上的16SrRNA基因的直接測序法，方便快捷。較之23SrDNA等看家基因而異，它具有分子大小適中，突變率小等優(yōu)點，素有“細菌化石”之稱。其序列包含10個可變區(qū)（variable region）和與之相同的11個恒定區(qū)（constant region），可變區(qū)因細菌而異，且變異程度與細菌的系統(tǒng)發(fā)育密切相關。2.1.3 PCR法的操作過程Step 1: DNA熱變性；S

16、tep 2: 引物退火；Step 3: 引物延伸2.2 PCR反應標準體系² DNA模板 ² 引物² 反應緩沖液² dNTP² ddH2O² 耐熱聚合酶2.2.1 PCR反應體系各組分的作用和使用量及反應條件v 模板：反應中量在ngng左右。且純度較高， 以增加反應特異性。v dNTP:反應體系中達100M200M。v Mg2+：Mg2+是Taq酶的輔基濃度在2.0mM左右，濃度太低Taq酶活力降低；太高反應特異性降低。v 引物：根據(jù)目的基因兩側(cè)特定序列設計。引物約20堿基左右；含量在40 70之間；引物內(nèi)部不能有回該序列；引物端不能

17、互補。v Taq酶：它是從嗜熱桿菌中提取的耐熱性聚合酶，在時分鐘還有活力。v 變性溫度：在之間使模板充分變性。v 復性溫度：左右，此溫度選擇是根據(jù)模板和引物配對結(jié)合強弱而定， 它是反應特異性的決定因素。v 延伸溫度：左右，為Taq酶最適反應溫度。2.2.2 材料設備及試劑設備：eppendorf管、微量取液器、臺式高速離心機、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀試劑：16SrDNA引物、細菌基因組DNA、Taq Plus、dNTP、PCR、沖液、瓊脂糖、TAE電極緩沖液、Lamdar DNA/Hind、染色液、 加樣緩沖液2.2.3 操作步驟PCR反應 依次混勻下列試劑Ø 5l 1

18、0×PCR反應緩沖液Ø 1l 4種dNTP Ø 2l 上游引物（引物） Ø 2l 下游引物（引物）Ø 1l 模板DNA Ø 0.5l Taq DNA聚合酶Ø 38.5l H2O混勻后離心5秒。擴增：用94變性3分鐘， 94變性1分鐘，61退火1分鐘, 72延伸1分鐘, 循環(huán)30輪,進行PCR。最后一輪循環(huán)結(jié)束后, 于72下最后延伸5-10分鐘，使反應產(chǎn)物擴增充分。電泳檢測：1%瓊脂糖凝膠電泳，分析PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。3.用試劑盒做瓊脂糖凝膠電泳分離和膠回收目的片段用TaKaRa DNA純化試劑盒對PCR擴增產(chǎn)物純化4. 純化

19、后的目的片斷送到測序公司測序也可以直接將電泳檢測后的PCR產(chǎn)物送到測序公司，讓公司對產(chǎn)物進行純化和測序5 .BLAST比對獲取相似片段。將測序得到的16S rDNA序列在NCBI上進行blast比對，選擇與比對序列相似度高的菌株。6.構(gòu)建系統(tǒng)進化樹將選擇的序列與測序序列用DNAStar軟件的MegAlign構(gòu)建菌株系統(tǒng)進化樹。l 如果要測16S rDNA的全序列長度則需要對PCR產(chǎn)物做T-A克隆。T-A克隆步驟：PCR 連接 轉(zhuǎn)化 鑒定1.1 T-A克隆需要在PCR產(chǎn)物末端加A尾巴有些PCR聚合酶可以在產(chǎn)物末端加A尾巴，但并不是所有的聚合酶會加A尾巴，所以在克隆之前最好搞清楚使用的酶到底是否加

20、A，否則克隆出來的白班太少，又要討論很久。具有3'到5'外切酶活性的高保真酶就不會產(chǎn)生A尾巴。產(chǎn)物末端加A步驟：Ø 用高保真酶擴增完之后，在反應管中加入0.7-1unit的Tap聚合酶。無需更換buffer期中的dATP已經(jīng)夠用。Ø 在72孵育8-10min。Ø 立即進行純化，沉淀、跑膠、或用純化試劑盒。這一點相當重要，否則高保真聚合酶會將A尾巴或T載體上的T尾巴切掉。1.2 將加A尾巴的PCR產(chǎn)物與T載體連接常用的T載體有Invitrogen的T載體；Promege的pGEM-T和TaKaRa的pMD18-T。1.3 將載體與目的片斷的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)

21、化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中進行液體搖床培養(yǎng)，涂平板進行藍白斑挑選。1.4 對挑選的菌落提質(zhì)粒，電泳檢測大小，對正確的陽性克隆的質(zhì)粒進行酶切目的片斷回收。目前對于T-A克隆技可以通過T-A克隆試劑盒來完成。細菌16S rDNA鑒定是應注意的問題和常見問題1 細胞裂解注意事項1.1材料應適量，過多會影響裂解，導致DNA量少，純度低1.2選擇適當?shù)牧呀馓幚矸绞?.3高溫溫浴室定時輕柔震蕩2 核酸分離純化2.1采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應提供相應的緩沖體系。2.2采用有機（酚/氯仿）抽提時應充分混勻，但動作要輕柔。2.3 離心分離兩相時，應保證一定的轉(zhuǎn)速和時間。2.4針對不同材料的特點，在提取

22、過程中輔以相應的去雜質(zhì)的方法。3 核酸沉淀、溶解3.1當沉淀的時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分。3.2沉淀是加入1/10體積的NaAc(PH5.2,3M)，有利于充分沉淀。3.3沉淀后應用70%的乙醇洗滌，以除去鹽離子等。3.4晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)。3.5若長期儲存建議用TE緩沖液溶解，TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase，TE緩沖液PH8.0可以防止DNA發(fā)生酸解。4 DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應4.1 DNA中含有蛋白，多糖，多酚類雜質(zhì)：應重新純化DNA，去除雜質(zhì)。4.2 DNA在溶解前有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應：應重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)。4.3 DNA中殘留有金屬離子：應增加70%乙醇的洗滌次數(shù)（2-3次）。5 DNA提取量少5.1 實驗材料不佳或量少：應盡量選擇新鮮的材料。5.2 破壁或裂解不充分：G+菌裂解前應先用生物酶或機械方式破壁；高溫裂解時，時間適當延長5.3 沉淀不完全：低溫沉淀，延長沉淀時間；加輔助物促進沉淀。5.4 洗滌DNA時丟失：洗滌時最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒。6 DNA降解6.1 未很好的抑制內(nèi)源核酸酶的活性：可增加裂解液中螯合劑的含量。6.2 提取過程操作過于