1、鮮煙葉樣品的制備 液氮法編制說明1 工作簡況1.1 任務(wù)來源本項目是由國家煙草專賣局2012年下達的煙草行業(yè)標準制定計劃（國煙科2012118號），合同號為2012B062。1.2 項目承擔單位、協(xié)作單位及主要分工該標準項目的牽頭承擔單位為中國煙草總公司鄭州煙草研究院（楊軍），協(xié)作承擔單位為云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（崔國民）。中國煙草總公司鄭州煙草研究院主要負責(zé)標準項目的總體統(tǒng)籌和協(xié)調(diào)，指導(dǎo)實施方案制定以及標準制定的各項具體工作；云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院負責(zé)煙草調(diào)制過程鮮煙葉樣品的制備技術(shù)研究。1.3 主要工作過程本標準制定工作于2012年4月簽訂項目合同。2012年6月 制定完成了鮮煙葉樣品

2、采集制備方案；2012年9月 完成大田關(guān)鍵生育期鮮煙葉樣品采集工作，共采集樣品903個；同期完成烘烤過程鮮煙葉樣品的采集工作，共采集樣品96個；2012年12月 完成大田鮮煙葉樣品代謝組學(xué)和分子生物學(xué)試驗研究；完成烘烤試驗鮮煙葉樣品淀粉和蛋白質(zhì)含量的檢測；2013年1月 撰寫“鮮煙葉樣品制備 液氮法”標準文本的草稿及年度試驗總結(jié)報告；2013年3月 完成代謝組學(xué)和分子生物學(xué)補充實驗；2013年4月 根據(jù)補充實驗研究結(jié)論對鮮煙葉樣品采集制備方案進行修正和完善，形成初稿；2013年5月 邀請有關(guān)專家對“鮮煙葉樣品制備 液氮法”標準文本及研究報告進行完善；形成征求意見稿。1.4 標準主要起草人及其所

3、做的工作根據(jù)“全國煙草標準化技術(shù)委員會制、修訂工作細則”的要求，由承擔單位組織了林福呈、楊軍、崔國民、金立鋒、魏春陽、李鋒、王燃、羅朝鵬、武明珠等起草人為主的起草小組，負責(zé)該標準的起草工作。其中，項目負責(zé)人楊軍負責(zé)標準制定的各項具體工作；林福呈負責(zé)項目的總體協(xié)調(diào)和技術(shù)指導(dǎo)；崔國民與魏春陽負責(zé)標準項目協(xié)調(diào)、標準條款起草；崔國民負責(zé)煙草調(diào)制過程鮮煙葉樣品的制備技術(shù)研究；金立鋒、魏春陽、李鋒、王燃、羅朝鵬、武明珠、趙高坤、黃維等負責(zé)樣品采集、制備、分析檢測研究與驗證。2 相關(guān)領(lǐng)域的國、內(nèi)外標準研究和制修訂情況目前，與煙草鮮煙葉采集制備尚沒有完善或發(fā)布的相關(guān)國家標準，煙草基因組重大專項的實施需要大量新

4、鮮煙葉樣本的采集制備、分析等工作，重大專項需要行業(yè)內(nèi)外多家實驗共同參與，為保證樣本的后期樣本數(shù)據(jù)的通用性，需要對煙葉樣本進行統(tǒng)一標準化的采集、制備、運輸、保存。因此，目前亟須建立行業(yè)內(nèi)外通用的鮮煙葉樣品的制備標準，同時經(jīng)過兩年多代謝組學(xué)及表達譜樣品制備實踐，項目組已經(jīng)具備制定規(guī)范的煙葉樣本的條件。該標準將對煙草基因組計劃重大專項及行業(yè)其他需要采集鮮煙葉的樣本進行嚴格規(guī)范，鮮煙葉樣本采集制備將更加統(tǒng)一，對于不同實驗室后期數(shù)據(jù)交流與共享具有重要意義。目前，國外無相關(guān)的標準研究。3 標準制定的原則及主要內(nèi)容確定的依據(jù)3.1 標準適用范圍本標準規(guī)定了煙草生育期和烘烤過程中鮮煙葉樣品采集、制作、保存和運

5、輸?shù)募夹g(shù)要求。本標準適用于烤煙、白肋煙和香料煙，其他類型煙草可參照使用。3.2 標準編制原則標準的制定，能夠為最大限度減小煙草鮮煙葉取樣過程和樣品運輸保存過程的代謝物及RNA等含量變化為技術(shù)參考，確保實驗室所用樣本最大限度體現(xiàn)煙葉樣本的原有理化特性，從而真實反應(yīng)煙葉生理變化規(guī)律。3.3 標準主要內(nèi)容確定的依據(jù)煙草是重要的模式作物及經(jīng)濟作物，代謝物是煙草品質(zhì)及香氣的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)、DNA、RNA及是煙葉品質(zhì)形成的可調(diào)控體內(nèi)因子，煙草基因組學(xué)暨主要從這四個層面研究煙草品質(zhì)形成機理、探討建立有效調(diào)控手段。這些物質(zhì)研究材料主要是新鮮煙葉樣本，同時為了研究的實用性，大部分研究取材直接從大田進行取樣

6、，取樣點遍布全國，取樣點距離實驗室較遠，需要長距離運輸回到實驗室。鮮煙葉樣品制備規(guī)程是獲得好的生物學(xué)（尤其是“組學(xué)”）數(shù)據(jù)的前提。煙草中各類物質(zhì)包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)及代謝物都容易受環(huán)境的影響，在實際分析過程中，包括取樣、運輸、保存和樣品制備對各種生物組分分析影響非常關(guān)鍵，很多文獻和不同實驗室的經(jīng)驗都證明了這一點。因此，一個好的實驗操作流程是獲得真實數(shù)據(jù)的前提，不同的實驗室采取不同的樣品制備技術(shù)會獲得大相徑庭的結(jié)果，所以非常有必要確定煙草鮮煙葉樣品制備規(guī)程。煙草鮮煙葉樣品制備規(guī)程是獲得歸范、可比、標準數(shù)據(jù)的前提，有利于不同研究單位的數(shù)據(jù)對接。隨著煙草基因組的測序和重大專項的展開，越來越多的

7、研究單位開展以鮮煙葉為樣本有關(guān)的生物學(xué)研究，不同單位可能采用不同的樣品制備方法，有的單位對怎樣進行樣品制備還存在疑惑，不同單位獲得的數(shù)據(jù)之間的可比性較差，浪費了實驗經(jīng)費和時間，所以有統(tǒng)一的鮮煙葉樣品制備規(guī)范不僅給各研究單位提供的準確實用的取樣方法，而且可以有效利用不同研究層面的研究數(shù)據(jù)，實現(xiàn)不同項目組實驗數(shù)據(jù)的可比、交流、共享。我們這兩年來通過開展煙草代謝組學(xué)項目與煙草表達譜項目，已經(jīng)制定了一套嚴格完整的鮮煙葉取樣規(guī)程，實驗結(jié)果分析表明取樣時間盡量縮短（控制在10 min之內(nèi)），樣品取下標記后迅速浸入液氮，完全速凍后，采用干冰完全包埋盡快（長途使用航空）運回實驗室，-80保存，可以保證樣本中總

8、代謝物及總RNA基本不變。標準的制定根據(jù)“全國煙草標準化技術(shù)委員會制、修訂工作細則”的要求，嚴格按照國家行業(yè)標準制定程序及格式開展標準制定工作。標準制定的具體依據(jù)詳見標準技術(shù)驗證報告。3.4 本標準在標準技術(shù)內(nèi)容、水平方面的情況本標準為新制定的煙草行業(yè)標準。本標準是在兩年來煙草代謝組學(xué)及表達譜項目鮮煙葉樣品采樣實踐和數(shù)據(jù)分析基礎(chǔ)上制定的。本標準的術(shù)語、定義、適用范圍等方面，符合現(xiàn)有的煙草代謝組學(xué)和生物學(xué)科學(xué)研究實際，有利于促進煙草基因組計劃工作高效、規(guī)范、有序進行。本標準的制定和發(fā)布實施，對基因組重大專項有關(guān)鮮煙葉樣本制備規(guī)程、確?；蚪M重大專項項目數(shù)據(jù)真實可靠、交叉使用及共享具有重要意義。4

9、 標準預(yù)期產(chǎn)生的社會、經(jīng)濟效益本標準為國家煙草專賣局標準制訂項目，本標準適用于煙草代謝組學(xué)和生物學(xué)研究的科研單位。本標準發(fā)布實施后，將使基因組重大專項及涉及鮮煙葉樣本其他項目樣本采集規(guī)范化，保證煙草生物學(xué)研究數(shù)據(jù)真實、可靠，促進不同實驗室開展數(shù)據(jù)交流及共享。5 采用國際標準和國外先進標準的情況本標準為新制定的煙草行業(yè)標準，未采用相關(guān)國際標準。目前煙草生物相關(guān)研究尚沒有相關(guān)標準。本標準是基于保證鮮煙葉真實生物學(xué)狀態(tài)，促進煙草基因組計劃相關(guān)項目可以進行有效數(shù)據(jù)交流、共享角度制定的。本標準對確保煙草基因組計劃順利實施具有一定意義。6 與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強制性標準的關(guān)系本標準與其他現(xiàn)行法律、法規(guī)并無沖突之處。7 重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù)無。8 作為強制性標準或推薦性標準的建議及主要依據(jù)本標準建議為推薦性標準。理由：不屬于國家標準法中規(guī)定的強制性標準的范圍。9 標準